UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE
INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Determinacin de la biomasa: Recuento microscpico

en cmara de Neubauer.
CURSO:

Biotecnologa de los productos Agroindustriales

AUTORES:

Duarte Soto, Erick Alexander.

ASESOR:

Ing. Jess Alexander. Snchez Gonzales.

CICLO:

IX

GUADALUPE PER

2016

PRACTICA N01. DETERMINACION DE BIOMASA: RECUENTO

MICROSCPICO EN CMARA DE NEUBAUER.
I- INTRODUCCIN:
En la agroindustria y en sus aplicaciones es importante conocer el nmero
de microorganismos presentes en una muestra. Este conocimiento puede
ser utilizado en estudio de curvas de crecimiento, anlisis de alimentos,
preparaciones de inculos para fermentacin, etc.
Un parmetro clave en el modelado y monitoreo del funcionamiento de
plantas de agroindustriales dedicadas a procesos de fermentacin,
panificacin entre otros en donde se utilicen inculo es la concentracin de
biomasa. Biomasa es un trmino general que se refiere a los
microorganismos presentes en un sistema. Existen muchas maneras de
medir la concentracin de biomasa, como por ejemplo masa, volumen,
extensin linear de filamentos, dispersin de luz, conteo de clulas u
organelos. Existen diferentes mtodos para cuantificar el nmero de
microorganismos o peso (biomasa) de clulas microbianas en un cultivo;
los mtodos pueden ser directos e indirectos.
Entre los directos se puede mencionar a la determinacin de peso seco y el
recuento de clulas en cmara de Neubauer.
La determinacin de peso seco es un mtodo de cuantificacin muy
utilizado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y levaduras.
Como los cultivos se someten a varios procesos (filtracin, lavado, secado)
se pueden causar prdidas importantes de biomasa y errores en la
cuantificacin. El mtodo de cuenta directa en cmara tiene la ventaja de
ser muy rpido y econmico, aunque no se pueden distinguir las clulas
viables y no viables. Se puede calcular el nmero de microorganismos en
una muestra a partir del volumen de la cmara y de las diluciones de la
muestra que sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que
la observacin y cuantificacin se dificultan en clulas muy pequeas (1 5
m) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeo volumen de
muestra que se utiliza (0.1 0.2 mm3) (Aquiahuati, 2004).
Entre los indirectos podemos mencionar a Turbidimetra y Nefelometra las
cuales nos permiten obtener aproximadamente la cantidad de biomasa de
una muestra.
II- OBJETIVOS:

Comprender el uso y lectura por cmara de Neubauer.

Determinar la concentracin de microorganismos utilizando la cmara de
Neubauer en el microscopio.
Determinar la desviacin estndar, promedio y coeficiente de variacin
de la muestra a analizar.

III-FUNDAMENTO TERICO:
Una suspensin celular se caracteriza por presentar un nmero de
partculas microscpicas dispersas en un fluido. Habitualmente ser
necesario determinar tanto la densidad de las clulas en la suspensin
como el porcentaje de stas que son viables. Para determinar la densidad
de las clulas se emplean diferentes tcnicas, desde la relativamente simple
cmara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre
ellas la que empleamos (cmara de Neubauer), hasta equipos automticos
de contaje celular como el "Cell Coulter" de la empresa Beckman-Coulter.
IV- MARCO TEORICO:
A- CMARA DE NEUBAUER
La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al
microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un
portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha
marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en
la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos
lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L
corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del cubreobjetos
est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se
cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1
milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos
es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.
Para contar las clulas de un cultivo lquido, se agrega una gota de este
entre estas dos placas y observar al microscopio ptico la cantidad de
clulas presentes en un campo determinado de las grilla.

Figura 1. Cmara de Neubauer.

Figura 2. Manipulacin de la cmara de Neubauer.

B- CONTEO EN CAMARA DE NUEBAUER
1. Colocar el cubreobjetos sobre el portaobjetos de la cmara e introducir
entre ambos la muestra celular previamente preparada. Debe evitarse que
la muestra rebalse, si esto sucede las clulas a contar tambin se
perdern.
2. La velocidad de llenado de la cmara debe ser homognea, evitando as
una mala distribucin de las clulas en el preparado que traer aparejado
errores en el recuento.
3. La muestra no debe secarse, por lo tanto es recomendable guardar la
cmara de Neubauer cargada dentro de una cmara hmeda para que
sedimenten las clulas.
4. Luego se coloca la cmara en un microscopio ptico y se procede al
conteo, eligiendo para ello los cuadrados apropiados.
5. Se elegir un criterio para definir qu clulas se cuentan y cules no,
cuando las mismas quedan sobre uno de los bordes del cuadrado.

6. Una vez contadas las clulas se calcula la concentracin en la muestra

original, considerando: la dilucin de la muestra hecha para el sembrado, la
cantidad de cuadrados considerados, el nmero de clulas contadas y el
volumen de muestra debajo de cada cuadrado.
V- MATERIALES Y METODOLOGIA
A- MATERIALES

Pipetas. (10 ml., 1 ml.)

Lamina cubre objeto.

Tubos de ensayos. (Capacidad mayo a 10 ml.)

Gradilla.

Agua de cao.

Levadura (Saccharomyces cerevisiae).

B- EQUIPOS

Microscopio.

Cmara de Neubauer.

C- METODOLOGIA

Se prepararon las soluciones a distintas concentraciones de

levadura con agua.

De la solucin se tom 10 ml y se colocaron en un tubo de ensayo el
cual se llam muestra original. Se tomaron 3 tubos de ensayos y se

llenaron con agua a 9 ml.

De la muestra original se pipeteo 1 mililitro y se le adiciono al tubo de
ensayo con 9 mililitros de agua, as se realizaron posteriormente

para obtener diluciones de 10-1 ,10-2 y10-3.

Con una pipeta se tom una determinada cantidad de la muestra 102 y se coloc en el borde del cubreobjetos de manera que el lquido

entre por capilaridad sin que se formen burbujas en la cmara.

Se Llev la cmara al microscopio y con el objetivo 10x se localiz
en el campo visual el cuadrante central, enfocando de tal forma que
se observen ntidamente los cuadrantes y luego se pas al objetivo
40x.

Contar las clulas presentes en los cuadros elegidos (generalmente

se cuentan en los cuadrados de los cuatro ngulos y el centro, o en
forma diagonal empezando por el primero de la parte superior
izquierda. Tambin se deben contar las levaduras que estn
ubicadas tocando la primera de las tres lneas que se encuentran
circundando el cuadro, las que se encuentran en la parte superior y
la derecha del cuadrado.

VI-

RESULTADOS Y DISCUSIONES

CUADRO DE RESULTADOS:

SUSPENSIONES DE
LEVADURAS
(g de lavadura/mL de agua)

N
Clulas/mL

Desviaci
Coeficiente
Promedi
n
de
o
Estndar
Variabilidad

12.5 g de levadura / 250 ml H20

1.4x107

6.12

56

10.94%

20 g de levadura / 250 ml H20

3.3x107

19.15

130.4

14.69%

40 g de levadura / 200 ml H20

1.0x107

6.26

40.8

15.35%

25 g de levadura / 250 ml H20

4.9x106

3.78

19.6

19.29%

150 g de levadura / 1000 ml H20

5.3x107

30.38

210.6

14.43%

Tabla 1. Nmero de clulas de levaduras contabilizadas en la solucin de 12.5

g de levadura / 250 ml H20
CUADRICULAS
(4 x 4)
1
3
6
11
14
16
SUMA

CUADRADOS (5 x 5)
7
9
13
17
9
10
10
3
7
12
8
10
14
8
15
12
Promedio 12
56
8
10
Desviacin10
Estndar 11
6.12
6
Coeficiente50
de Variabilidad
10.94%
61
64

TOTAL

19
14
10
10
4
6
9
53

896

Tabla 2. Promedio y Coeficiente de Variabilidad del conteo de levaduras.

Clculo de las levaduras / mL:

N de Celulas /mL=

56 cel
0.2 mm0.2 mm0.1 mm

N de Celulas /mL=

56 cel
3
3
4 x 10 mm

N de Celulas /mL=

14000 cel
3
mm

de Celulas 14000 cel 1000 mm3

N
=
x
3
mL
mL
mm
N

de Celulas
7 cel
=1.4 x 10
mL
mL

8
9
11
12
7
5
52

CUADRICULAS
(4 x 4)

1
3
6
11
14
16
SUMA

19
23
18
22
20
20
122

TOTAL

2086.4

CUADRADOS (5 x 5)
9
13
17
15
16
16
19
23
22
15
24
24
17
20
115
113

17

19
26
22
26
24
28
23
149

25
26
23
21
28
30
153

Tabla 3. Nmero de clulas de levaduras contabilizadas en la solucin de 20 g

de levadura / 250 ml H20

Tabla 4. Promedio y Coeficiente de Variabilidad del conteo de levaduras.

Promedio
Desviacin Estndar
Coeficiente de Variabilidad

Clculo de las levaduras / mL:

N de Celulas /mL=

130.4 cel
0.2 mm0.2 mm0.1 mm

N de Celulas /mL=

130.4 cel
4 x 103 mm3

N de Celulas /mL=

32600 cel
mm3

de Celulas 32600 cel 1000 mm3

=
x
mL
mL
mm3

de Celulas
cel
=3.3 x 107
mL
mL

130.4
19.15
14.69%

Tabla 5. Nmero de clulas de levaduras contabilizadas en la solucin de 40 g

de levadura / 200 ml H20
CUADRICULAS
(4 x 4)

CUADRADOS (5 x 5)
9
13
9
5
7
6
10
9
4
7
8
6
8
8
7
7
7
6
2
10
38
39
49

1
3
6
11
14
16
SUMA
TOTAL

17

19
3
5
7
13
10
7
45

652.8

Tabla 6. Promedio y Coeficiente de Variabilidad del conteo de levaduras.

Promedio
Desviacin Estndar
Coeficiente de Variabilidad

Clculo de las levaduras / mL:

N de Celulas /mL=

40.8 cel
0.2 mm0.2 mm0.1 mm

N de Celulas /mL=

40.8 cel
3
3
4 x 10 mm

N de Celulas /mL=

10200 cel
mm3
3

de Celulas 10200 cel 1000 mm

=
x
3
mL
mL
mm

40.8
6.26
15.35%

7
6
5
4
5
6
33

de Celulas
7 cel
=1.0 x 10
mL
mL

Tabla 7. Nmero de clulas de levaduras contabilizadas en la solucin de 25 g

de levadura / 250 ml H20
CUADRICULAS
(4 x 4)

CUADRADOS (5 x 5)
9
13
2
2
5
3
4
4
3
4
2
1
1
3
1
3
1
7
6
3
17
20
18

1
3
6
11
14
16
SUMA
TOTAL

17

19
1
5
2
5
2
2
17

313.6

Tabla 8. Promedio y Coeficiente de Variabilidad del conteo de levaduras.

Promedio
Desviacin Estndar
Coeficiente de Variabilidad

Clculo de las levaduras / mL:

N de Celulas /mL=

19.6 cel
0.2 mm0.2 mm0.1 mm

N de Celulas /mL=

19.6 cel
4 x 103 mm3

N de Celulas /mL=

4900 cel
mm3

19.6
3.78
19.29%

4
5
4
5
3
5
26

de Celulas 4900 cel 1000 mm

=
x
mL
mL
mm3

de Celulas
6 cel
=4.9 x 10
mL
mL

Tabla 9. Nmero de clulas de levaduras contabilizadas en la solucin de 150

g de levadura / 1000 ml H20
CUADRICULAS
(4 x 4)

1
3
6
11
14
16
SUMA

30
32
44
28
31
33
198

TOTAL

3369.6

CUADRADOS (5 x 5)
9
13
42
31
38
35
46
43
48
47
40
39
34
42
248
237

17

19
23
33
34
30
40
33
193

30
32
24
31
22
38
177

Tabla 10. Promedio y Coeficiente de Variabilidad del conteo de levaduras.

Promedio
Desviacin Estndar
Coeficiente de Variabilidad

Clculo de las levaduras / mL:

N de Celulas /mL=

210.6 cel
0.2 mm0.2 mm0.1 mm

N de Celulas /mL=

210.6 cel
3
3
4 x 10 mm

210.6
30.38
14.43%

SUSPENSIONES DE LEVADURAS
(g de lavadura/mL de agua)

N Clulas/mL

12.5 g de levadura / 250 ml H20

1.4x107

20 g de levadura / 250 ml H20

3.3x107

40 g de levadura / 200 ml H20

1.0x107

25 g de levadura / 250 ml H20

4.9x106

150 g de levadura / 1000 ml H20

52650 cel
N de Celulas /mL=
3
mm

5.3x107

de Celulas 52650 cel 1000 mm3

=
x
3
mL
mL
mm

de Celulas
7 cel
=5.3 x 10
mL
mL

Tabla 11. Cantidad de Levaduras por mL de Agua en cada disolucin

En la tablas 2, 4, 6, 8. Podemos observar que los coeficientes de variabilidad

son 10.94%, 14.69%,15.35%, 19.29%( se debi quizs a las fallas que
present el microscopio con el tema de la luz, que al final va influenciar en el
resultado final.), 14.43% respectivamente; esto nos indica el grado de
variabilidad o dispersin que existe entre los datos. Segn Nuez (1992) si CV
es menor o igual que 20% se dice que el promedio es representativo, o que los
datos son homogneos y si el CV es mayor al 20%, el promedio no es
representativo de los datos, o los mismos no son homogneos, es por ello que
afirmamos que los datos son homogneos y el mtodo de recuento en
microscopio utilizando la cmara de Neubauer es adecuado para la
determinacin de biomas.
(Muoz, 2007) El conteo en la cmara de Neubauer debe efectuar en los 25
cuadrantes de la cmara, hasta obtener un nmero de 300 clulas con el fin de
tener una confianza del conteo del 90%.
Segn Hernndez (2002). Es importante determinar al mosto la concentracin
de clulas para que luego se dosifique la cantidad especfica para alcanzar una

concentracin en el rango de (1,5 a 2,0) x 107cel/mL de mosto. Por lo que

ciertas cantidades halladas se han aproximado al rango pero tambin
depender de la relacin de entre la cantidad de levadura con la cantidad de
agua.
Es importante contar en total en total 10 cuadrados, cinco en cada cmara, es
decir de la cmara de arriba y la de abajo (Aquiahuati, 2004) sin embargo en
la prctica realizada solo se contaron 5 cuadrados por lo que el porcentaje de
error se incrementar.
Segn Arnaiz, et al (2000), los mtodos clsicos de determinacin de biomasa
son mtodos directos que se basan en el nmero de clulas o en el peso
celular. Los mtodos de enumeracin celular, son mtodo de observacin,
basados en propiedades fsicas o en la actividad biolgica. Mientras que los
mtodos indirectos estiman algn componente celular o alguna actividad
metablica especfica, estos no requieren de examen visual de los organismos
ni su incubacin.
Segn Unam (1986), en la tcnica de conteo de clulas hay que tener en
cuenta que en esta tcnica uno de los factores que afecta la observacin de las
clulas de levadura es la correcta dilucin de la muestra empleada se puede
decir que si durante el conteo se observan aproximadamente 69 clulas la
muestra se encuentra muy concentrada, mientas que si se observan menos de
20 clulas, la muestra se encuentra muy diluida. En nuestro prctica la muestra
nos arrojaron valores de un total de clulas son mayores a 69, por lo que
podemos decir que probablemente se encuentra muy diluida.

VII-

CONCLUSIONES:

Se comprendi el uso y lectura por cmara de Neubauer.

Se determin la biomasa presente en una solucin de levadura y
expres en unidades de clulas/ml obtenindose un rango de 1.02 y
5.27 x 107Cel/mL con un promedio de entre 19.6 y 210.6 clulas por
cada cuadro de

0,2mm x 0,2mm x 0,1mm y un coeficiente de

variabilidad de entre 11 y 19 %, en las 5 celdas al azar, por lo que nos

damos cuenta que la

muestra de 5 celdas al azar es una muestra

representativa de la general. Se pudo determinar las clulas por mililitro

gracias a la cmara Neubauer.

Se pudo comprender y determinar el promedio de levaduras contadas en
las 5 celdas al azar, por el mtodo de conteo directo, usando la cmara
de Neubauer, que es un mtodo eficaz para el conteo de dichas
levaduras. Por lo que la muestra de las 5 al azar es representativa.

SUSPENSIONES DE
LEVADURAS
(g de lavadura/mL de agua)

N
Clulas/mL

12.5 g de levadura / 250 ml H20

1.4x107

6.12

56

10.94%

20 g de levadura / 250 ml H20

3.3x107

19.15

130.4

14.69%

40 g de levadura / 200 ml H20

1.0x107

6.26

40.8

15.35%

25 g de levadura / 250 ml H20

4.9x106

3.78

19.6

19.29%

150 g de levadura / 1000 ml H20

5.3x107

30.38

210.6

14.43%

VIII-

RECOMENDACIONES:

IX-

Desviaci
Coeficiente
Promedi
n
de
o
Estndar
Variabilidad

Para realizar un recuento en cmara de Neubauer se recomienda agitar

bien la dilucin con el fin de tener una muestra ms homognea y al
momento de colocar la muestra sobre la cmara tener la precaucin
para no derramarla sobre la placa cubreobjetos de tal manera que el
conteo sea el adecuado.
Se recomienda calibrar bien el microscopio, y que est en buen estado,
con la finalidad de poder observar de manera ms clara las levaduras,
de esta forma facilitaremos el conteo de las clulas.

BIBLIOGRAFA:

ARNIZ, C., ISAC, L. LEBRATO, J. (2000). Determinacin de la biomasa en

procesos biolgicos. Sevilla-Espaa.
Aquiahuati, M. (2004). Manual de prcticas: Laboratorio de microbiologa
celular. Mxico: Universidad Autnoma Metropolitana.
Hernndez, A. (2002). Microbiologa Industrial. Costa Rica: Editorial EUNED.
Muoz, A. (2007). Microbiologa. Madrid: Editorial Paraninfo.
Nuez, A. (1992). Estadstica Bsica para planificacin. Madrid: Siglo XXI
Editores.
UNAM, (1986); Biologa Celular, Manual de Prcticas. Departamento de
Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad autctona de Mxico. Pg. 20 28.

ANEXOS
ANEXO 1: Fotos observadas en el microscopio (Objetivo 10X)

IMAGEN 1: Observacin de
Cuadro 4 x 4

IMAGEN 2: Observacin de
Cuadro 5 x 5