UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BSICAS

PROGRAMA ACADMICO DE MICROBIOLOGA
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

GUIA DE TRABAJO N2: RECUENTO EN CMARA DE NEUBAUER

OBJETIVO GENERAL
Realizar e interpretar la tcnica para el recuento de levaduras y esporas de hongos en la cmara de
Neubauer.

FUNDAMENTOS TERICOS

La cmara de Neubauer es una cmara de recuento que se utiliza para determinar el nmero de partculas
(levaduras, bacterias, eritrocitos, etc.) por unidad de volumen de un lquido a travs del microscopio. Est
constituida por un bloque grueso de cristal demarcado por una cuadrcula (Fig. 1), que contiene dos zonas
ligeramente deprimidas cuyas dimensiones son conocidas. La depresin central del cubreobjetos est hundida
0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie
marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la superficie y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro
cbico, es decir 0.1 microlitro.
Habitualmente ser necesario determinar tanto la densidad de las clulas en la suspensin como el porcentaje
de stas que son viables. Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes mtodos. El ms comn es
el de tincin con azul de metileno. El azul de metileno es un colorante que se introduce en el interior de las
clulas que presentan daos en la membrana. As pues las clulas que aparecen de color azul, son consideradas
no viables.

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Figura 1. Vista superior y lateral de la cmara de Neubauer

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MTODOS

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES REACTIVOS
1 Micropipeta 100-1000 ml con puntas Muestra de levadura
1 Baln aforado de 10 ml Cultivo de hongo (esporulado)
1 Gotero Agua destilada
1 Cmara de Neubauer Azul de metileno al 0,01% (agua)
Lmina cubreobjetos Alcohol antisptico
1 Micropipeta de 0,5-10 ul con puntas
1 Microscopio

PROTOCOLOS

1- Conteo de levaduras

1.1- Preparacin de la Muestra.

Tomar 1 ml del cultivo lquido (muestra de la levadura) y aforar a 10 ml con agua destilada en un baln
aforado. Aadir una gota de azul de metileno. Tapar y agitar cuidadosamente.
En caso de que el cultivo se encuentre en medio slido, tomar una colonia y resuspenderla en 5 ml de
diluyente; tomar 1 ml y realizar la dilucin 10-1.

1.2- Llenado de la cmara y conteo celular

Limpie la cmara y la lmina cubre objetos con alcohol

Coloque la laminilla sobre la cmara, esta debe quedar centrada.
Llenar la cmara con una micropipeta pequea (0,5-10 ul). El llenado debe ser continuo en un solo intento. No
se deben observar porciones secas en las esquinas del recuadro de llenado, tampoco se debe inundar.
Llevar la cmara al microscopio y enfocar el cuadro de conteo con el ocular de 4X. Observar una imagen
similar a la figura 2.

Figura 2. Cmara de Neubauer 4X.

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Si las clulas que va a contar son pequeas como las levaduras, bacterias, etc. Ubicarse en la cuadricula central
y pasar al ocular de 10X, se visualizar de la siguiente manera:

Figura 3. Cmara de Neubauer 10X.

En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las clulas presentes en 5 campos,
generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central (sealadas por flechas en la Fig. 3), lo que
garantiza un conteo aleatorio. Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de
los campos y con ayuda del carro del microscopio se desplaza la cuadricula hasta contar en todos los cuadros.
El conteo en estos campos de la cmara de conocer como AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se
ve de la siguiente manera:

Figura 4. Cmara de Neubauer en 40X

Las clulas se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda realizar el conteo siguiendo las
flechas de la Fig. 5 para evitar que se cuenten las clulas dos veces o no que no se cuenten. Alrededor de cada
cuadricula se observa que hay tres lneas que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el momento del
conteo ya que definen cuales clulas son contables o cuales estn fuera del campo de conteo. Las clulas que
no tocan la segunda lnea son contables, si la tocan o estn encima de ella no se incluyen.

Figura 5. Orientacin para realizar el conteo

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Las clulas que tiene una X son las que no se deben contar (Fig. 6)

Figura 6. Conteo de clulas en cuadros terciarios

Despus de contar las clulas se procede a calcular el nmero de clulas por unidad de volumen. Para esto se
debe tener en cuenta el rea de cada cuadro y el espacio que hay entre la cuadricula de la cmara y la laminilla
cubre objetos. La cmara tiene una profundidad de 0,1 mm y las siguientes dimensiones:

Figura 7. Dimensiones de la cuadricula de la Cmara de Neubauer

Las suspensiones celulares deben ser diluidas lo suficiente para que las clulas u otras partculas no se
sobrepongan y deben estar uniformemente distribuidas. Para clulas pequeas se recomiendan contar cuatro
esquinas y el cuadro del centro.
Cada cuadro tiene un rea de 0,2* 0,2= 0.04 mm2 y 0,1 mm de profundidad. Por lo tanto el volumen total de
cada cuadro es de 0,04* 0,1= 0,004 mm3, si se contaron 5 cuadros se tiene un volumen de 0,02 mm3. Si se

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contaron 187 clulas en un volumen de 0,02 mm3 equivale a 9350 clulas/mm3. Hay 1000 mm3 en 1 cm3,
dando un total de 9.350.000 clulas/ml.
Para fines prcticos se puede aplicar la siguiente formula:

Clulas/ ml = total de clulas contadas * 50.000

Clulas/ ml = 187 * 50.000 = 9.350.000

Pero, para poder determinar el nmero de clulas en la muestra original hay que multiplicar este valor por la
dilucin, que en este caso fue 10.

Clulas/ ml = (total de clulas contadas * 50.000)* dilucin

Clulas/ ml = (187 * 50.000)*10 = 93.500.000

1.3- Determinacin de la viabilidad celular

El colorante azul de metilo es capaz de penetrar la pared de las clulas muertas, tindolas completamente, de
tal manera que las clulas vivas se observan sin teir. Para determinar la viabilidad celular del cultivo es
necesario aplicar la siguiente frmula:

Viabilidad % = (clulas totales- clulas muertas)/ clulas totales x 100

Es importante hacer el conteo lo ms pronto posible despus de realizada la tincin, debido a que algunas
clulas pueden morir por procesos oxidativos, alterando el recuento.

2- Conteo de esporas de Hongos

Tomar con un asa de argolla parte del micelio areo del hongo y diluir en 10 ml de agua destilada. De ser
necesario, filtrar a travs de una malla o gasa para eliminar el agar o restos de micelio. Cargar la cmara como
en el procedimiento anterior.

En caso de que el hongo tenga esporas grandes, hacer el conteo de los cuadros A, B, C y D (Fig. 8) y aplicar la
siguiente formula:

Esporas/ ml= (total de esporas contadas*10.000)/ (# de cuadros* factor de dilucin)

Ejemplo: si se obtuvo un conteo total de 66 esporas:

Esporas/ ml= (66*10.000)/ (4 * 0,1)

Esporas/ ml= 1.650.000

Si las esporas son pequeas, el conteo se puede hacer como para levaduras.

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 Figura 8. Cuadricula para el conteo de esporas de hongos.

BIBLIOGRAFA

Universidad Autnoma de Guadalajara, Manual de ciencias qumico- biolgicas, Biotecnologa: Apndice 1

cuantificacin de levaduras, http://es.slideshare.net/cesarturo26/practica-1-crecimiento-levaduras

Libkind, D, Tognetti, C & M, Molin Curso terico-prctico sobre microscopia y recuento de levaduras para
productores de cerveza [en linea], Laboratorio de Microbiologa aplicada y biotecnologa, Instituto de
investigaciones en biodiversidad y medioambiente, Bariloche- Argentina,
http://www.somoscerveceros.com/wp-content/uploads/2014/11/Teorica-Curso-Microscopio-La-Plata-2014-
V5.pdf

ESTADO LEGAL INTERNO DEL CURSO

Elabor Valeria Prez Luna E-mail valeriaperez@usc.edu.co
Revisado Sandra P. Rivera Msc. Departamento Ciencias Bsicas
Aprueba x rea Microbiologa

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