Prctica N.

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Uso de la cmara de Neubauer
En las investigaciones realizadas en el campo de la Biologa Celular,
con frecuencia se tiene la necesidad de conocer con exactitud la
cantidad de clulas utilizadas en los experimentos. Para hacer un
recuento directo de una poblacin celular se necesita un
microscopio de campo claro y una cmara de Neubauer.
La cmara de Neubauer, tambin conocida como hemocitmetro
o cmara cuenta glbulos, consta de un cubreobjetos de
caractersticas especiales y de un portaobjetos de un grosor mucho
mayor que los de uso comn (Fig. 1A). En la cara superior del
portaobjetos, se encuentran cuatro canales longitudinales y un
canal transversal central, a cuyos lados superior e inferior existen
grabados dos cuadros de 9 mm2 de superficie, subdivididos a su
vez en una cuadrcula ms fina (Figura 1A).

Figura1. (A) Cmara de Neubauer (hemocitmetro). (B) Escala ubicada

en cada uno de los sitios indicados por las flechas. (C) Tamao de los

cuadros dentro de la cuadrcula. (D) Clulas que no se deben contar

porque estn fuera de la cuadrcula. (E) Clulas de levadura vistas a 10X.

Usando el objetivo de 10X podemos enfocar un solo de los cuadros

de 1 mm2 de superficie a la vez, siendo el cuadro central de la zona
cuadriculada el que se usa para contar el nmero de clulas de una
poblacin problema. La superficie del cuadro central es de 1 mm2
subdividida en 25 cuadros que miden 0.2 mm por lado y por lo
tanto con una superficie cada uno de ellos de 0.04 mm2 (Figura
1C).

Al colocar el cubreobjetos encima de la superficie donde se

encuentra grabada la cuadrcula, existe entre ellos (cuadrcula y
cubreobjetos) una distancia fija (profundidad) de 0.1 mm., la misma
que viene indicada en el portaobjetos como Depth 0.10 mm.
Por lo tanto el volumen de la muestra problema en uno de los
cuadros grandes (de 1 mm2 de superficie) ser igual a 1.0 mm 2
x 0.1 mm = 0.1 mm3 .
Las tcnicas de conteo consideran el nmero de individuos
presentes en una muestra de volumen determinado y comnmente
se expresan como nmero de individuos presentes por cada
mililitro. Ya que 1 ml = 1 cm3 = 1000 mm3 y como 1000 m3 =
10.000 x 0.1 mm3, entonces 1 ml = 10.000 veces el volumen
de la muestra, que como se indic anteriormente es de 0.1 mm3 .
As , para la cmara de Neubauer , la frmula utilizada Al contar en
los cuadros grandes.

Concentracin de clulas =

Suponiendo que se hizo un conteo de clulas en el cuadro central

de la cuadrcula, obtenindose la cifra de 320 clulas. Para expresar
el nmero de clulas por mililitro, se multiplica 320 x 10.000 ya que
son 320 las clulas existentes en 0.1 mm3 y 1 ml = 10.000 mm3. El
resultado es de 3.200.000 clulas / ml.
En caso de que se aplic una dilucin, la concentracin obtenida
debe ser convertida a la concentracin original antes de la dilucin.
En este caso, la concentracin debe dividirse por la dilucin
aplicada.
La frmula ser:

Concentracin de clulas =

Ejemplo:
Para una dilucin 1:10 la dilucin ser 0.1
Para una dilucin 1:100 la dilucin ser 0,01
Los errores en el intervalo de 20 % -30 % son comunes en este
mtodo debido a errores de pipeteo, errores estadsticos, errores de
volumen de la cmara, y los errores de volumen introducidos en la
cmara. A pesar de todo, la cmara de Neubauer sigue siendo el
mtodo de recuento de clulas ms ampliamente utilizado en el
mundo.

BIBLIOGRAFA
Biologa, 1974. Interaccin de Experimentos e ideas. Consejo
Nacional para la enseanza de la biologa. Limusa, Mxico.
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Cell Culture Manual 2008-2009, 3rd Edition. Sigma Life Science, pp

230-231.
Hako, C.J. , Baker, J. Y Allen, G. 1971. Twelve Problems in Biology.
Addison Wesley, Mass.
Ruiz, Oronoz, M. Y Herrera T. Prcticas complementarias de
Botnica. Facultad de Ciencias, UNAM. Mxico.
http://www.microbehunter.com/the-hemocytometer-counting-chamber/

Determinar el nmero de clulas de levadura en una

suspensin.
Materiales :
Vaso de precipitado de 50 ml
Pipeta de 1 ml o micropipeta de 0 a 200 l
H2O destilada
Papel seda
Material biolgico
1 sobre de levadura seca
Equipo :
Microscopio de campo claro
Cmara de Neubauer
Mtodo :
1. Limpiar con papel de seda la cmara de Neubauer.
2. Colocar el cubreobjetos en el lugar correspondiente
3. Mezclar 0,1 de levadura en 10 ml de agua destilada agitando
hasta cuando la suspensin sea homognea.
4. Pipetear 0.01 ml (10 l) de la suspensin, colocar la punta de la
pipeta en la cmara, de tal manera que la muestra vaya entrando
por capilaridad, sin caer en los canales (Figura 5). Si se llegaran a
formar burbujas, repita todo el procedimiento, lavando la cmara
previamente con agua destilada.
5. Colocar la cmara de Neubauer y enfocar a menor aumento
(10X).
6. Localizar el cuadro central de conteo (Figura 3) y enfocar las
clulas de levadura y contar las clulas de levadura que se
encuentran en l.
7. La cuadrcula que se usa como gua para el conteo es de 0.2 x
0.2 mm. Al contar el nmero de clulas en la cuadrcula se deben
tomar las precauciones :
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a. No contar la misma clula en una ocasin.

b. Omitir contar una clula.
8. Para obtener resultados lo mas exacto posibles, hay que contar
entre 200 y 300 clulas en cada muestra. Si en el cuadro central
existen menos de 200 clulas, entonces se deber seguir
contando clulas utilizando mas cuadros hasta tener el recuento
de 200 a 300 clulas y al hacer los clculos se deber tomar en
cuenta el incremento del rea de conteo.
PROBLEMAS DE CONTEO
En la prctica de la cuantificacin del nmero de individuos
existentes en una muestra problema, pueden surgir diferentes
situaciones que pueden ser resueltas de la siguiente manera :
A. Se puede dar el caso de que existan entre 200 y 300 clulas
en los cuadros de 1 mm2 de superficie, en tal situacin
solamente hay que multiplicar por 10.000 el nmero de
clulas contadas. El resultado ser igual al nmero de
clulas/ml.
B. Puede ser que en el cuadro central (1 mm2 de superficie) el
nmero de clulas sea inferior a 200, en cuyo caso ser
necesario usar mas cuadros para llegar a contar las 200 a
300 clulas requeridas.
C. En el cuadro central puede haber un nmero muy superior a
200 clulas, por lo que sera sumamente laborioso para hacer
el conteo de todas ellas. En este caso se toman en cuenta los
cuadros mas pequeos (de 0.04 mm2 de superficie) y se
hace el conteo de 200 a 300 clulas solamente. Para obtener
el resultado se divide el nmero total de clulas contadas
entre el nmero de cuadros (de 0.04 mm2 de superficie) que
se emplearon, este dato se multiplica por 25, puesto que son
25 los cuadros de 0.04 mm2 de superficie, el resultado ser el
nmero de clulas por cuadro grande. Para obtener el nmero
de clulas por ml., solamente hay que multiplicar el dato
anterior x 10.000.
D. Puede haber un nmero tan elevado de clulas que sea
imposible discriminar unas de otras impidiendo un conteo
correcto; en este caso habr que diluir la suspensin
multiplicando el nmero final de clulas por el factor de
dilucin empleado.

Taller prctica cmara de Neubauer o hemocitmetro

1. Realice los clculos de levaduras realizadas en el
hemocitmetro. Recuerde que cada cuadrcula de conteo
mide 1 mm x 1mm x 0.1 mm. De tal manera que:
volumen de cada cuadrcula = 1 x 1 x 0.1 mm3 = 0.1 mm3 o 1 x 10-4 mL
Ejemplo:
Promedio de conteo celular:

48 56 45 51
50
4

50 levaduras ? levaduras 50 levaduras x1ml

50 x10 4 levaduras o 5 x10 5 levaduras x ml

4
4
1ml
1x10 ml
10 ml

Tambin se puede proceder de la siguiente manera:

nmero total de levaduras contadas x factor de dilucin x 10 4
nmero de cuadros contados

2. Una vez realizado un conteo celular con un hemocitmetro. Cul

es el porcentaje de viabilidad de una suspensin celular si se
cuentan 130 clulas, de las cuales 22 retienen el azul de Trypan
que se aadi a la solucin celular para determinar si las clulas se
encontraban vivas o muertas (viabilidad)? Las clulas vivbas no
toman el colorante
Clculo de la densidad celular
3. Se realiz un conteo celular en un vial que contena una
suspensin celular utilizando un contador celular electrnico. La
suspensin celular se prepar mediante adicin de 0.2 ml de clulas
a 9.8 ml de isotone (es un lquido que no contiene clulas). El
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conteo se realiz utilizando ml cada vez y se realiz cuatro veces

sucesivas, obteniendo los siguientes conteos: 5032, 4992, 5023 y
5019. Utilizando el promedio (media estadstica) de cuatro conteos,
calcule las clulas por ml en la muestra original de 0.2 ml.
3. Utilizando la siguiente figura realice el clculo de nmero de
espermatozoides por mililitro de esperma y adems conteste las
siguientes preguntas:

1. Cules son las principales causas de disminucin de nmero de

espermatozoides?
2. Los posibles tratamientos para la esterilidad.
3. Presente una explicacin cientfica para explicar la infertilidad.