MANUAL DE LABORATORIO

Laboratorio N° 1:

ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA AMILASA

I. INTRODUCCIÓN.

Las enzimas son biocatalizadores específicos de naturaleza química proteica que

aceleran las reacciones específicas experimentando cambios físicos durante ellas, pero
recuperan su estado original cuando la reacción ha terminado.

A continuación se presenta la reacción química enzimática:

SUSTRATO + ENZIMA --------- PRODUCTO + ENZIMA

Las proteínas y los lípidos ingeridos con los alimentos “no hidrolizan apreciablemente” y
por lo tanto no podrán ser asimilados, permanecen sin modificación como la maicena y la
mantequilla en el supermercado.

La concentración de una determinada enzima en un ser vivo depende de la velocidad de

síntesis y de la velocidad de su degradación. Generalmente ambas velocidades se
encuentran desequilibradas, de modo que la concentración de la enzima se mantiene más
o menos constante.

Muchas enzimas requieren de un cofactor para actuar catalíticamente. El cofactor en la

mayoría de las enzimas que lo requieren es una coenzima, esto es, una molécula
orgánica termoestable, de bajo peso molecular y por lo tanto dializable. La coenzima está
unida covalentemente o no covalentemente a la proteína. En algunos casos un ion
inorgánico forma parte de la coenzima. Cuando la coenzima está unida covalentemente
se le denomina “grupo prostético”. Algunas enzimas tienen como cofactor solamente a un
ion inorgánico.

La velocidad de una reacción química catalizada por una enzima está influenciada por
factores físicos y químicos. Los factores químicos son las concentraciones del sustrato, la
enzima, del cofactor, pH de la solución en la que se encuentra el sistema enzimático y la

Escuela de Ingeniería Ambiental Pá gina 1

 MANUAL DE LABORATORIO

presencia de moléculas o iones activadores o inhibidores. Los factores físicos son

principalmente el tiempo y la temperatura.

Las enzimas son moléculas relativamente frágiles y fácilmente se desnaturalizan bajo

condiciones inapropiadas. Los tratamientos relativamente violentos con ácidos fuertes,
altas temperaturas, etc. Frecuentemente empleados en química orgánica, rápidamente
desnaturalizan a las enzimas causando su inactivación. Los factores físicos y químicos
que influyen en la reacción enzimática deben ser óptimos para la enzima en estudio.

Para detectar y medir la actividad de una enzima, es decir, para detectar y medir la
velocidad de transformación del sustrato en productos existen dos métodos generales:

1. Detectar y medir los productos formados

2. Detectar y medir el sustrato transformado (sustrato inicial – sustrato residual o final)

II. OBJETIVOS.
 Determinar cualitativamente la actividad enzimática de la Amilasa que cataliza la
hidrólisis del almidón a maltosa (disacárido reductor)

III. EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO.

III.1. Material Biológico.

 Amilasa

III.2. Materiales y Equipos.

 Pipetas
 Tubos de ensayos
 Baño maría
 Cocina eléctrica
 Balanza

III.3. Medios de cultivos.

 Solución de almidón al 1% en buffer fosfato 0.1 M pH 6.9 conteniendo NaCl
0.01 M
 Solución de enzima al 1%

Escuela de Ingeniería Ambiental Pá gina 2

 MANUAL DE LABORATORIO

 HCl 0.05 M
 Solución cúprico alcalino yodada
 Sol. Cúprico alcalino
 Sol. Fosfanolibdica

IV. PROCEDIMIENTO.

4.1. OBTENCION DE ENZIMA AMILASA

 En un matraz colocar saliva aproximadamente 20 -30 Ml
 Mezclar a la misma proporción con buffer fosfato
 Con una gasa o algodón proceder a filtrar la mezcla
 El filtrado corresponde a la enzima

4.2. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD AMILASICA

Se procederá de acuerdo al siguiente sistema de incubación enzimática:

COMPONENTES T1 (testigo) T2 (problema)

Solución de almidón al 1% (mL) 2.5 2.5
Agua destilada (mL) 2.5 2.5
Colocar en baño maría a 37°C por 5 minutos
Enzima al 1% (mL) ------ 0.5
Colocar en baño maría a 37°C por 10 minutos

4.3 CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA POR SUSTRATO RESIDUAL

Simultáneamente con el proceso de incubación de 10 minutos colocar HCl en dos
tubos adicionales y continuar de acuerdo al siguiente esquema

COMPONENTES T1 (testigo) T2 (problema)

HCl 0.05 M (mL) 5 5
De los tubos que fueron trabajados
0.5 0.5
en la etapa A (mL)
Sol. Yodada (mL) 0.5 0.5
MEZCLAR
OBSERVAR EL COLOR RESULANTE EN CADA TUBO Y
ANALIZARLO EXPLICANDO SI SE DEMUESTRA ACTIVIDAD
ENZIMATICA O NO

Escuela de Ingeniería Ambiental Pá gina 3

 MANUAL DE LABORATORIO

4.4 CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA POR PRODUCTOS FORMADOS

(azúcares reductores)
Simultáneamente con el proceso de incubación de 10 minutos, en el tercer par de
tubos, procedes de acuerdo al sgte esquema. Mediante el método de FOLIN-WU

T1 T2
COMPONENTES Blanco
(testigo) (problema)
Agua destilada 1 0.5 0.5
T1 de la parte A ----- 0.5 -----
T2 de la parte A ----- ---- 0.5
Sl. Cúprica alcalina 1 1 1
Mezclar y colocar en baño de agua hirviendo por 8 minutos. Al termino
de este tiempo enfriar en agua corriente
Sol. Fosfomolibdica 1 1 1
Mezclar enérgicamente y dejar reposar 3 minutos
Agua destilada 7 7 7

Mezclar por inversión y dejar en reposo durante 10 minutos. Evaluar los resultados
de manera cualitativa.

V. RESULTADOS.

V.1. Control de la Actividad Enzimática por SUSTRATO RESIDUAL

INDICADOR T1 (testigo) T2 (problema)
Color resultante Ámbar oscuro Ámbar claro
Presencia de almidón residual (abundante, Moderado Escaso
moderado, escaso, ausente)
Diferencia entre testigo y problema Si Si
(SI,NO)
Actividad amilásica (presente o ausente) Ausente Presente

V.2. Control de la Actividad Enzimática por PRODUCTOS FORMADOS

INDICADOR T1 (testigo) T2 (problema)
Color resultante Amarillo claro Gris oscuro
Precipitado (presencia y color) Presenta No presenta
precipitado precipitado
Presencia de azucares reductores - -
Diferencia entre testigo y problema (SI, Si Si
NO)
Actividad amilásica (presente o ausente) Presente Ausente

Escuela de Ingeniería Ambiental Pá gina 4

 MANUAL DE LABORATORIO

VI. DISCUSION

En la FACULTAD DE MEDICINA HUMANA en el año 2022 hicieron un análisis en

laboratorio sobre la actividad enzimática de la amilasa, sus resultados fueron muy buenos
en los cuales hice una pequeña comparación con el resultado de la tabla 2. En el tubo n°4
la amilasa presente en el tubo produjo hidrolisis positiva de almidón produciendo
así azucares reductores, por lo tanto, el color del tubo fue amarillo pardo dando negativo
para Lugol y en la tabla 2 del testigo uno obtuvimos un color amarillo claro hubo presencia
de azucares reductores donde la actividad amilásica estuvo presente dándonos un buen
resultado positivo.
En la primera tabla se obtuvieron los siguientes resultados, en la Tabla 1 presenta
almidón tanto moderado como escaso, en la tabla 2 presenta almidón y azúcar por eso
tienen diferente color en ambas.

VII. CONCLUSIONES
Concluimos que el color amarillo claro y el color ámbar claro demostró actividad
enzimática, pero hubo una pequeña confusión al mezclar con los otros ácidos y no
obtuvimos los resultados que esperábamos en el T2 de la tabla 1 y el T2 problema de la
tabla 2 .

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

en el tubo n°4 la amilasa presente

en
el tubo produjo hidrolisis
positiva de almidón
produciendo así azucares

Escuela de Ingeniería Ambiental Pá gina 5

 MANUAL DE LABORATORIO

reductores, por lo tanto, el color

del tubo fue amarillo pardo dando
negativo
para Lugo
en el tubo n°4 la amilasa presente
en
el tubo produjo hidrolisis
positiva de almidón
produciendo así azucares
reductores, por lo tanto, el color
del tubo fue amarillo pardo dando
negativo
para Lugo
en el tubo n°4 la amilasa presente
en

Escuela de Ingeniería Ambiental Pá gina 6

 MANUAL DE LABORATORIO

el tubo produjo hidrolisis

positiva de almidón
produciendo así azucares
reductores, por lo tanto, el color
del tubo fue amarillo pardo dando
negativo
para Lugo
en el tubo n°4 la amilasa presente
en
el tubo produjo hidrolisis
positiva de almidón
produciendo así azucares
reductores, por lo tanto, el color
del tubo fue amarillo pardo dando
negativo
para Lugo
Escuela de Ingeniería Ambiental Pá gina 7
 MANUAL DE LABORATORIO

en el tubo n°4 la amilasa presente

en
el tubo produjo hidrolisis
positiva de almidón
produciendo así azucares
reductores, por lo tanto, el color
del tubo fue amarillo pardo dando
negativo
para Lugol.
(S/f). Studocu.com. Recuperado el 28 de agosto de 2023, de https://www.studocu.com/es-

mx/document/universidad-de-san-martin-de-porres/bioquimica/informe-de-

bioquimica-seminario-digestion-enzimatica-del-almidon/25393186

Escuela de Ingeniería Ambiental Pá gina 8