UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE QUÍMICA
BIOLÓGICA Y FISIOLOGÍA ANIMAL

CÁTEDRA DE BIOQUÍMICA AMBIENTAL

P2. - Determinación de la actividad enzimática de la

amilasa.
I. INTRODUCCION
ACTIV ENZIMATICA: Sustrato transformado (residual) o Producto formado /
tiempo
I. INTRODUCCION El alfa-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la
saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un
polisacárido de reserva vegetal.

El almidón está formado por dos tipos de moléculas: la

amilosa y la amilopectina, ambos polisacáridos de glucosa.

La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas

unidas por enlaces α-C1---C4.

La amilopectina tiene, además de estos últimos enlaces,

uniones α-C1---C6, formando cadenas ramificadas.

La α-amilasa rompe uniones α-C1---C4, tanto en la amilosa como

en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas
(oligosacáridos) como productos.
I. INTRODUCCION

Sustrato
AMILOSA

H2 pH: 6,6
Enzima O T= 37 oC
AMILASA

+ +
maltosa glucosa
I. INTRODUCCION

Sustrato
Amilopectina

H2O pH: 6,6

Enzima T= 37 oC
Dextrina
Amilasa
+
+ +
maltosa glucosa
 Reacción del lugol en almidón
I. INTRODUCCION
Reacción del lugol:
Este método se usa para identificar polisacáridos.
El almidón en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol
(disolución de yodo y yoduro potásico) toma un color azul-violeta
característico. La coloración producida por el Lugol se debe a que
el yodo se introduce entre las espiras de la molécula de almidón.

No es por tanto, una verdadera reacción química, sino que se forma

un compuesto de inclusión que modifica las propiedades físicas de
esta molécula, apareciendo la coloración azul violeta.

Este fenómeno no es una verdadera reacción química,

por lo tanto, como solo afecta las propiedades físicas,
esta puede ser reversible al someterle al calor y luego
enfriarle, como se muestra a continuación:
I. INTRODUCCION
La reacción o prueba de Benedict
La reacción o prueba de Benedict identifica azúcares reductores (aquellos que tienen su OH anomérico
libre), como el lactosa, la glucosa, la maltosa, y celobiosa.
En un medio alcalino (NaOH), el ion cúprico (otorgado por el sulfato cúprico de color azul) es capaz de
reducirse por efecto del grupo Aldehído del azúcar (CHO) a su forma de Cu+. . Este ion se observa como
un precipitado rojo ladrillo.
II. OBJETIVO

Demostrar la actividad enzimática, determinando para ello la

actividad de la amilasa salival que cataliza la hidrólisis del
almidón a maltosa y algo de glucosa, después de un tiempo
determinado de incubación y bajo condiciones específicas de pH
y temperatura.
 III. PROCEDIMIENTO: SISTEMA 1: HIDRÓLISIS DEL ALMIDON
(SISTEMA DE INCUBACIÓN)

TUBO 1 TUBO 2
COMPONENTE (mL)
(TESTIGO) (PROBLEMA)

Cte: [sustrato], pH Solución de almidón al 1%, pH 6,9 2,5 2,5

Cte: cofactor = ión cloruro Solución de NaCl 0,1 M 0,5 0,5

Agua destilada 2,0 1,5
Cte: T° Mezclar y pre-incubar a 37°C por 5 minutos
Variable: [ENZIMA] Amilasa salival al 1/2 --- 0,5
Cte: tiempo de incubación Mezclar suavemente e incubar a 37° C por 10 minutos
 III. PROCEDIMIENTO: SISTEMA 1: HIDRÓLISIS DEL ALMIDON

2,5 mL 2,5 mL
1 mL 1 mL 2,0 mL 1,5 mL

I II I II I II
NaCl 0,1M

Colocar los tubos al Colocar los tubos al baño

baño de agua a 37°C de agua e incubar a 37°C
y pre-incubar por 5 0,5 mL por 10 minutos
minutos

I II
III. PROCEDIMIENTO: SISTEMA 2: EVALUACIÓN ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
(SUSTRATO RESIDUAL → almidón)

COMPONENTE (mL) TUBO 3 TUBO 4

Solución de HCl 0.05 M 5,0 5,0

De los tubos 1 y 2 del Sistema 1 0,5 0,5

Solución yodada 0,5 0,5
Mezclar y observar el color resultante en cada tubo.
Analizar los datos obtenidos, explicando si se demuestra o no la actividad
enzimática en base a la intensidad del color resultante.
III. PROCEDIMIENTO: SISTEMA 2: EVALUACIÓN PRESENCIA DE ALMIDÓN

0,5 mL
5 mL 5 mL
0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL

I
III IV II
III IV
III IV

III IV
Azul violeta → presencia de almidón
Actividad enzimática → ???

Amarillo→ ausencia de almidón

Actividad enzimática → ???
IV. RESULTADOS III IV

Detección y medición de la actividad enzimática por el sustrato residual:

RESULTADOS TUBO TESTIGO TUBO PROBLEMA

Color resultante: Azul violeta / Amarillento Azul violeta amarillo

Presencia de almidón residual:

abundante Ausente
Abundante / Regular / Escaso / Ausente.
Diferencia entre Testigo y Problema: Si /
SI SI
No.
Actividad amilásica: Abundante / Regular /
Ausente Abundante
Escasa / Ausente.
Reacción de Lugol
III. PROCEDIMIENTO: SISTEMA 3: DETERMINACIÓN DE ACTIV ENZIMA
(PRODUCTO → AZÚCAR REDUCTOR)

COMPONENTE (mL) TUBO 5 TUBO 6

De los tubos 1 y 2 del Sistema 1 0,5 0,5

Reactivo de Benedict 5,0 5,0
Mezclar y hervir por 10 minutos en baño de agua hirviendo.
Observar el color y la formación de precipitado resultantes en cada tubo.
Analizar los datos obtenidos, explicando si se demuestra o no la actividad
enzimática en base a la formación de precipitado.
III. PROCEDIMIENTO: SISTEMA 3: DETERMINACIÓN AZÚCAR REDUCTOR
1 mL
1 mL hervir en baño maría durante 10 minutos.
5 mL 5mL

I
II
V VI V VI
Reactivo
Benedit

Testigo
Problema

Tubo 5 → ausencia de azucares reductores

Actividad enzimática → ???
V VI
Enfriar
Tubo 6 → presencia de azucares reductores
Actividad enzimática → ???
 V VI
IV. RESULTADOS
Detección y medición de la actividad enzimática por los productos formados
(Azúcares reductores):

RESULTADOS TUBO TESTIGO TUBO PROBLEMA

Color resultante: Celeste / Rojo indio celeste Rojo indio

Precipitado: Presencia (abundante / regular Abundante (rojo

ausente
/ escaso / ausente) y Color (rojo indio). indio)
Presencia de azúcares reductores: Si /
no sí
No.
Diferencia entre Testigo y Problema: Si /
SI SI
No.
Actividad amilásica: Abundante / Regular /
ausente abundante
Escasa / Ausente.
V. DISCUSIÓN
SISTEMA 1: HIDRÓLISIS DEL ALMIDON

A simple vista el contenido del tubo I y II es

idéntico, lo cual no es correcto, porque en el
tubo II ocurrió la reacción de la enzima
Amilasa con Almidón (enzima-sustrato) pero no
es visible debido a que no usamos un marcador.

La solución salina fue agregada para solubilizar

la enzima y servir como un cofactor, la α-amilasa
contiene en los restos aminoacídicos de su sitio
activo Cl, y por ello, al agregar NaCl, los aniones
cloruro se unen al sitio activo aumentando la
actividad enzimática.
V. DISCUSIÓN
SISTEMA 2: EVALUACIÓN PRESENCIA DE ALMIDÓN

El cambio de color del tubo III de incoloro a

azul-violáceo se debe a que el indicador usado
(solución yodada) reaccionó con la presencia
del almidón (sustrato), en cambio en el tubo IV
el color amarillo claro se debió a que el
indicador no encontró sustrato (porque se había
convertido en productos) sobre el cual actuar,
manteniendo el color característico de la
solución yodada.
V. DISCUSIÓN
SISTEMA 3: DETERMINACIÓN AZÚCAR REDUCTOR

En el tubo V se obtuvo un color celeste, distinto

al tubo VI en el cual se obtuvo un color naranja,
esto se debió a que la solución cúprica reaccionó
con los productos de la reacción enzimática que
son azucares reductores como Glucosa, Maltosa,
etc., los cuales actúan sobre el cobre,
reduciéndolo.
VI. CONCLUSIONES

Se demostró la actividad enzimática de la amilasa salival,

por sustrato residual y producto formado.
 CUESTIONARIO
1. ¿Qué es una enzima?
2. ¿Qué entiende por sitio activo catalítico de una enzima?
3. ¿Qué entiende por especificidad enzimática, y para qué sirve?
4. ¿Cuál es la función del NaCl en el proceso de incubación de la amilasa salival?, Fundamente su respuesta.
5. ¿Cómo puede medirse la actividad de una enzima?
6. Diga cuales son los factores que determinan la actividad enzimática y explique cada uno de ellos.
7. Explique el fundamento de la valoración de la actividad de la amilasa por el sustrato residual.
8. Explique el fundamento de la valoración de la actividad de la amilasa mediante el método de los productos
formados.
9. Cuáles son los requisitos de un agente que pueda ser utilizado para detener la reacción enzimática? Explique.
10. Cuáles son los requisitos de una sustancia que pueda ser utilizada para visualizar la reacción enzimática?
Explique.