UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Profesora: Luz Mery Buitrago A.
Práctica de laboratorio

ENZIMAS PROTEOLITICAS

INTRODUCCIÓN

Las enzimas proteolíticas rompen enlaces peptídicos, algunas de estas se encuentran en el

tubo digestivo que transforman progresivamente las proteínas en péptidos y éstos en
aminoácidos.

La papaína es una mezcla de proteasas que se han aislado como cristales y pueden separarse
en dos fracciones: papaína propiamente dicha y quimiopapaína. La papaína hidroliza proteínas
amidas y ésteres de aminoácidos: su acción enzimática está relacionada con la presencia de
grupos sulfidrilo (-SH) de la cisteína en el centro activo.

Estas enzimas se sintetizan en forma activa, pero en algunos casos se pueden inhibir, de tal
forma que para obtener una actividad máxima necesitan de agentes alquilantes como el EDTA
o de sustancias reductoras como el ácido sulfúrico.

Al igual que otras proteasas, estas enzimas son activas en un rango de pH que oscila entre 3-
9. El valor de pH óptimo varía según el sustrato que va a hidrolizarse; la temperatura también
está relacionada con el tipo de sustrato y se puede manejar entre 40 a 65 °C

Los grupos sulfidrilo de la enzima se pueden inhibir por agentes oxidantes, tal es el caso del
peróxido de hidrógeno (H2O2), agentes alquilantes y por metales pesados como el mercurio:
estos inhibidores convierten a los grupos sulfidrilo en disulfuros inactivos. El proceso es
reversible cuando se trata con agentes reductores, ejemplo; glutatión.

Por su actividad proteolítica la papaína se emplea en la industria de alimentos, en la producción

de concentrados, en medicina para controlar problemas digestivos y en la industria para el
tratamiento de textiles, de cueros, etc.

En esta práctica, se emplea la prueba de coagulación de la leche para evidenciar la actividad

proteolítica de la papaína extraída de la papaya; se prueba además la que contienen algunos
ablandadores comerciales.

ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE LAS ENZIMAS

Las enzimas son proteínas globulares complejas de gran tamaño, formadas por una o más
cadenas polipeptídicas. Están plegadas un surco o bolsillo en el que encajan la molécula o las
moléculas reactivas (el sustrato) y donde tiene lugar las reacciones. Esta región de la enzima
se conoce como sitio activo, el cual no sólo tiene una configuración tridimensional
complementaria a la del sustrato, sino también tiene una distribución complementaria de
cargas y de zonas hidrofílicas o hidrofóbicas sobre la superficie de unión. Si una región
particular del sustrato tiene una carga negativa, es probable que el sitio activo tenga una carga
positiva en la zona correspondiente. De tal modo el sitio activo no solamente reconoce y
confina a la molécula de sustrato, sino que también la orienta en una dirección particular.
ENERGÍA DE ACTIVACIÓN Y CATÁLISIS

Las reacciones químicas en nuestras células no ocurren espontáneamente. Si así fuera, el

metabolismo sería caótico. En lugar de ello, muchas reacciones en la célula son controladas
por proteínas llamadas enzimas. El nombre de enzima, propuesto en 1867 por el fisiólogo
alemán Wilhelm Kuhne (1837-1900), deriva de la frase griega en zyme que significa en
fermento.

La mayoría de las reacciones químicas requieren un ingreso inicial de energía para comenzar y
desarrollarse a un ritmo razonable. La energía añadida incrementa la energía cinética de las
moléculas, permitiendo que un mayor número de ellas adquiera la fuerza suficiente no sólo
para superar su repulsión mutua, sino también para romper los enlaces químicos existentes en
su interior. La energía que deben poseer las moléculas para iniciar una reacción se conoce
como energía de activación. En el laboratorio, la energía de activación se obtiene a menudo
como calor. Pero en una célula ocurren muchas reacciones diferentes al mismo tiempo y el
calor las afectaría a todas indiscriminadamente. Además, el calor rompería puentes de
hidrógeno y produciría en la célula otros efectos generalmente destructivos. Las células evitan
este problema utilizando enzimas, que son proteínas globulares especializadas para actuar
como catalizadores.

Un catalizador es una sustancia que disminuye la energía de activación necesaria para una
reacción formando una asociación pasajera con las moléculas que reaccionan (Figura 1). Esta
asociación temporal acerca a las moléculas que reaccionan y también pueden debilitar los
enlaces químicos existentes, facilitando la formación de otros nuevos. La disminución en la
energía de activación debida a la acción del catalizador es similar a la cantidad de energía que
posee la mayoría de las moléculas que intervienen en una reacción química. Como resultado,
la reacción ocurre más rápidamente en presencia de un catalizador. El catalizador mismo no
sufre ninguna alteración permanente en el proceso y se puede volver a utilizar repetidamente.

En la actualidad se conocen más de dos mil enzimas diferentes, cada una de las cuales es
capaz de catalizar una reacción química específica. Sin embargo, diversos tipos de células
elaboran diferentes tipos de enzimas; ninguna célula contiene todas las enzimas conocidas,
las enzimas particulares que pueden fabricar una célula son uno de los principales factores que
intervienen en la determinación de las actividades biológicas y funciones de esa célula. Una
célula puede efectuar una reacción química dada a una velocidad razonable solamente si
posee una enzima específica que puede catalizar una reacción. La molécula o moléculas sobre
la cual actúa una enzima se conoce como su sustrato.

Figura 1. Mecanismo de catálisis. Tomado de: www.100ciaquimica.net

 MATERIALES
MATERIALES BIOLÓGICOS
 30 mL Leche fresca (* grupo de trabajo)
 30 mL Zumo de papaya (* grupo de trabajo) o 30 g de papaya
 Ablandador de carne (10 g * grupo de trabajo)
 25 g de Hígado licuado en 75 mL de agua
 3 papas criollas (1 hervida) (* grupo de trabajo)

MATERIALES NO BIOLÓGICOS
 12 tubos de ensayo
 1 Pinza para tubos de ensayo
 2 Morteros
 Pipetas de 1-5 y 10 mL
 Vasos de precipitado: 50, 100 y 250 mL
 1Gradilla
 1 Embudo
 1 Pipeteador
 1 vidrio de reloj
 1 Agitador
 1 Termómetro
 Papel filtro
 Papel indicador de pH
 Tubos para centrífuga

 1 bisturí (individual)
 Gasa o muselina (individual)
 1 Frasco de agua oxigenada (* grupo de trabajo)

REACTIVOS
 EDTA 0.2M
 Buffer de acetato de sodio 0.5 M pH 5.5 (ácido acético y acetato de sodio)
 Hidróxido de amonio 0.25 M
 Ácido clorhídrico 0.25 M
 Buffer fosfatos calibrado pH 6.0.
 Buffer fosfato 0.02 M (pH=7)
 MnO2
 HCl 3 M
 NaOH 3M
 HgCl3 2%

EQUIPOS:

 Centrífuga
 Plancha de calentamiento
 Baño serológico
 Balanza
 METODOLOGÍA

Preparación de soluciones enzimáticas:

Jugo de papaya:
Macere 30 g de papaya en un mortero y sin agregar agua, filtre a través de doble gasa o de
muselina. Rotule el filtrado como solución enzimática 1.

Ablandador de carne:
A 3 g de ablandador de carne agregar 10 mL de agua destilada, mezcle y centrifugue. Separe
el sobrenadante y rotúlelo como solución enzimática 2.

Ensayo de la prueba enzimática

En un tubo de ensayo pipetee 0.5 mL de cualquiera de las soluciones enzimáticas y adicione
3.0 mL de leche y mezcle e incube a 50°C hasta la formación del coágulo. Agitando
suavemente note el incremento de viscosidad.

NATURALEZA DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA DEL ABLANDADOR DE CARNE

Prepare cuatro tubos de ensayo con los siguientes reactivos:

REACTIVOS (mL) 1 2 3 4
Solución enzimática 2 0.5 0.5 0.5 0.5
Agua destilada 0.2 - 0.05 0.05
EDTA - 0.1 - -
Ácido clorhídrico - - 0.15 -
Hidróxido de amonio - - - 0.15
pH 2 9
Mezclar y luego de 15 minutos de reposo, añadir 5 mL de buffer de acetato a cada uno.
Efectuar la prueba enzimática a cada tubo. Registrar los resultados y analizarlos.

NATURALEZA DE LA ACTIVIDAD PROTEOLÍTICA DE LA PAPAINA

Prepare cuatro tubos de ensayo con los siguientes reactivos:

REACTIVOS (mL) 1 2 3 4
Solución enzimática 1 0.5 0.5 0.5 0.5
Agua destilada 0.2 - 0.05 0.05
EDTA - 0.1 - -
Ácido clorhídrico - - 0.15 -
Hidróxido de amonio - - - 0.15
pH 2 9
Mezclar y luego de 15 minutos de reposo, añadir 5 mL de buffer de acetato a cada uno.
Efectuar la prueba enzimática a cada tubo. Registrar los resultados y analizarlos.
EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Tomar 3 tubos de ensayo, añadirles 5mL de hígado homogenado, rotular e incubar, de acuerdo
a la siguiente tabla:

TUBO INCUBACIÓN
1 80°C (colocar tubo por 10 minutos)
2 37°C (colocar tubo por 5 minutos)
3 Temperatura ambiente

1. Tomar el cronómetro, añadir 2 mL de peróxido de hidrógeno a cada tubo, este es el tiempo

cero, registrar el momento en que empieza a producirse las burbujas

Registrar resultados y observaciones en una tabla.

EFECTO DEL PH EN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Tomar 3 tubos de ensayo, añadir 1 mL de hígado homogenado a cada tubo, luego rotular y
adicionar reactivos de acuerdo a la siguiente tabla:

TUBO INCUBACIÓN
1 3 mL de HCl 3 M
2 3 mL de NaOH 3 M
3 3 mL de buffer fosfato 0.02 M (pH=7)

1. Agitar suavemente hasta mezclar

2. Adicionar 3 mL de peróxido de hidrógeno a cada tubo
3. Observar y escribir resultados en una tabla

COMPARACIÓN ENTRE LA ACCIÓN DE UNA ENZIMA Y LA DE UN CATALIZADOR

INORGÁNICO

Tome 7 tubos de ensayo limpios y secos y mida los reactivos señalados en la siguiente tabla:

TUBOS
REACTIVOS 1 2 3 4 5 6 7
Papa (Tr=trozo) 1 Tr - - - - 1 Tr -
H2O2 5% (gotas) 10 10 10 10 10 10 10
Extracto papa hervida(mL) - 1 - - - - -
Cloruro de Mercurio (mL) - - 1 - - - -
*Extracto enzimático (mL) - - 1 - - - 1
MnO2 gramos - - - 0.01 **0.01 0.01 -
*Se puede utilizar cualquier extracto
** Al tubo 5 se le debe calentar con dióxido de manganeso (MnO 2), después enfriarlo para
adicionarle peróxido de hidrógeno.
Compare y escriba los resultados obtenidos en cada tubo.
 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Consulte la especificidad de las enzimas proteolíticas: papaína, tripsina, quimiotripsina,

renina y pepsina.
2. Consulte las principales características de la enzima quimiotripsina, sitio de síntesis en el
organismo, mecanismo de activación, número de aminoácidos que conforman la estructura
de la enzima, aminoácidos del sitio activo y mecanismo de acción
3. Realice una descripción sobre el efecto que tiene la temperatura en la actividad de las
enzimas
4. ¿Cómo influye en la actividad catalítica los cambios de pH?
5. Consulte sobre los catalizadores inorgánicos y establezca dos diferencias con respecto a
las enzimas.

BIBLIOGRAFÍA

 Bacca, C. Bioquímica. Manual de Laboratorio. Universidad INCCA de Colombia. Colombia:

Unidad Editorial. 2011
 Laboratorio de Bioquímica 1, prácticas para la carrera de odontología, Universidad Nacional
de Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de Química, Santafé de Bogotá, 1996.
 Lodish, H. et al. Biología celular y molecular. 5 Ed. Argentina: médica panamericana.2005
 Nelson, D., COX, M. Leningher. Principles of Biochemstry. 3 Ed. New York: Worth
Publischer,2001
 Plummer, D. Bioquímica Práctica. Editorial Mc Graw Hill Latinoamericana, México, 1981.
 Rentina, G. Técnicas de Bioquímica aplicada. Editorial interamericana, México, 1974.
 Stryer,L. Bioquímica. Cuarta edición. Editorial Reverte, Barcelona, 1995.