DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y

RECONOCIMIENTO DE MACROMOLÉCULAS
PROGRAMA DE BIOLOGÍA
ASIGNATURA: BIOLOGÍA GENERAL.

INTRODUCCIÓN

Los seres vivos representan frente a la materia inerte, una categoría diferente, la vida es
como una nueva propiedad de la materia y solamente aparece cuando ciertas moléculas
se disponen rigurosamente. Este orden específico la materia viva origina consecuencias
morfológicas y dinámicas, éstas pueden considerarse como funciones vitales, inherentes
al concepto de la vida y que se desarrollan mediante complejos fenómenos físicos y
químicos (Sheldrake, 2011). En cuanto a la composición química, los seres vivos están
constituidos por varios elementos: oxígeno, carbono, hidrógeno, nitrógeno, los que
aproximadamente forman el 97% de los constituyentes. Además, es posible encontrar
azufre, fósforo, potasio, hierro, magnesio, sodio, calcio cloro y otros que apenas
representan el 3% restante (Brown, 2004).

En las plantas, es común identificar la presencia de la enzima catecol oxidasa,

responsable del pardeo o color marrón que todos hemos podido observar en las patatas,
champiñones, alcachofas, piñas, plátanos, manzanas y otras frutas, y en general, en los
tejidos de plantas al poco tiempo de ser cortadas o dañadas (Morante et al. 2014). Es una
reacción que tiene un papel protector para las plantas, ya que los productos de esta
reacción, las quinonas, son dañinas para las bacterias, y por tanto protege a los tejidos
vegetales heridos o dañados de la invasión bacteriana. Es una enzima de indudable interés
en los procesos de transformación y almacenamiento de los productos vegetales
comerciales, ya que su actividad modifica el aspecto y el sabor de éstos y, por tanto, el
evitar o favorecer su actividad en determinados momentos del procesamiento para la
comercialización tiene una gran importancia económica.

En los animales esta enzima tiene una gran relevancia ya que es responsable del proceso
de melanización. La formación de melanina produce la pigmentación oscura marronacea
de los epitelios, y también la tinta de los calamares y pulpos. La enzima tirosinasa
convierte el aminoácido tirosina en el pigmento oscuro e insoluble melanina. La melanina
proporciona una pantalla protectora frente a la radiación solar. Los albinos carecen de
esta enzima funcional, por un defecto o mutación en el gen que la codifica (Azcona,
2003).
OBJETIVO GENERAL
Comprobar las propiedades físicas y químicas del protoplasma, así como la actividad
catalítica de una enzima.

MATERIALES Y REACTIVOS

● Licuadora ● Papel de parafilm

● Pipetas Pasteur ● Gasa
● Tubos de ensayo ● Termómetro 0-100°C
● Vasos de precipitados ● Baño maría
● Gradillas ● Pinza para tubo de ensayo
● Catecol 0.09 M ● Fosfato disódico 0.2M
● Ácido cítrico 0,1 M
● Ácido ascórbico 0.1 M
● Cajas de Petri
● Mecheros
● Agua destilada
● Solución de almidón
● Solución de glucosa
● Lugol
● Biuret
● Sudan III
● Benedict
● Alcohol etilico
● Huevos, limones, aceite de cocina,
leche, papa, muestras de alimentos.

PROCEDIMIENTO

A. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

1. Obtención de un extracto enzimático a partir de papa

✔ Cortar en pequeños trozos una papa de aproximadamente 50 g, previamente lavada y
pelada.
✔ Añadir 400 mL de agua destilada y licuar durante 30 segundos.
✔ Filtrar a través de una doble capa de gasa y dejar reposar para que se pose el almidón.
Cuando se observe una capa de precipitado blanco, que corresponde al almidón
extraído de las células de la papa, decantar y guardar el sobrenadante que contiene el
extracto enzimático de catecolasa que se va a utilizar en la práctica.
✔ Repartir el extracto en tres tubos de ensayo, llenándolos hasta la mitad, y marcar con
rotulador (A, B, C); el resto se tapa y se guarda en nevera.
✔ El tubo A contiene el extracto enzimático que se va a utilizar en condiciones normales
o control, para observar la reacción cuando se añade el sustrato catecol exógeno.
✔ El tubo B se hierve al baño maría durante 15 minutos para desnaturalizar la enzima.
✔ El tubo C se deja a temperatura ambiente y se agita cada cierto tiempo para oxigenar
el contenido y observar la reacción que transcurre lentamente con el sustrato endógeno,
es decir, el catecol que contienen las células de la papa.

2. Reacción enzimática
Como sustrato para la reacción enzimática con la catecolasa obtenida de las células de
papa se va a utilizar una disolución de catecol 0.09M (1%).
Marcar los tubos de ensayo, y añadir 3 mL de H2O (puede utilizarse también un buffer de
pH 7).

Con una pipeta Pasteur añadir las gotas según se indica en las distintas tablas.

Tubo Enzima Catecol 1% Agua Reacción=color (- , + ,

++)
1 20 0 20
2 0 20 20
3 5 20 15
4 20 20 0

Observar las diferencias en la reacción como consecuencia de la presencia/ausencia de

enzima, sustrato y las diferentes concentraciones relativas de las mismas.

3. Inhibición de la reacción por desnaturalización de la enzima

Se realiza la reacción con el extracto enzimático de catecolasa obtenida de papa, pero
hervido previamente (Tubo B), lo que provoca la desnaturalización de la estructura de la
enzima y por tanto su inactivación.
Tubo Enzima Catecol Agua Reacción=color (-, +,
1% ++)
5 20 20 0

Comparar el resultado con el tubo número 3.

4. Estudio del efecto del pH en la reacción

Para estudiar el efecto del pH en la reacción catecol/catecolasa se utilizarán diferentes
proporciones de una solución 0,1 M de ácido cítrico, 0.1 M de ácido ascórbico y 0.2 M
de fosfato disódico, para obtener el tampón o buffer en el que posteriormente se realizará
la reacción:

Reacción:
Tubo Enzima A Catecol Buffer Reacción=color (- , + ,
(gotas) (gotas) ++)
6 20 20 3 mL pH 9,2
7 20 20 3 mL pH 7,1
8 20 20 3 mL pH 2,5

Observar la reacción y comparar con el tubo número 3.

B. RECONOCIMIENTO DE MACROMOLÉCULAS PRESENTES EN EL

PROTOPLASMA

1. Propiedades físicas del protoplasma

Para ello se utilizará la clara de huevo, ya que representa un sistema coloidal y por lo tanto al
protoplasma.

 Observe la clara de huevo crudo que está en el vaso de precipitado y tóquela con los
dedos. Anote todas las características observables.
 Coagulación de la clara de huevo. En un tubo de ensayo ponga un poco de agua, agregue
un poco de la clara de huevo y caliente suavemente hasta que hierva. Anote lo que sucede.
 En dos cajas de Petri coloque un poco de clara de huevo y añada a una de las cajas unas
gotas de limón y a la otra unas gotas de alcohol. Observe y anote. Tenga en cuenta la
velocidad de la reacción.

2. Propiedades químicas del protoplasma

Para determinar la presencia de los compuestos orgánicos se utiliza un método colorimétrico, lo

primero que se debe hacer es conocer el color de los reactivos utilizados (biuret, benedict, lugol,
sudan III). Entonces proceda así:

En un tubo de ensayo agregue agua hasta un nivel de unos dos centrímetros, adiciónele unas gotas
de Biuret. Este será el color del Biuret ya que está en agua. Proceda en igual forma para el Lugol,
El Sudan III (en este caso agite y note como el Sudan III no se disuelve en el agua) y el Benedict
(siempre que se utilice este reactivo se debe calentar después de ser agregado).

Usted debe colocar los tubos de izquierda a derecha y en orden mencionado antes: Biuret, Lugol,
Sudan III y Benedict. Conserve estos tubos de ensayo con su contenido. A continuación, se
determinará la presencia de los compuestos orgánicos de diferentes sustancias así:
Reconocimiento de proteínas:
 Tome un tubo de ensayo, agréguele leche hasta un nivel de unos dos centímetros, luego
adiciónele unas de gotas Biuret, el color resultante identifica la presencia de proteínas.
 Compare esta coloración con la del tubo de ensayo que usted dejó en la gradilla y que es
el color del reactivo.
 Conserve este tubo de ensayo ya que le servirá de patrón en la identificación de sustancias
problemas.

Reconocimiento de almidones
 Tome otro tubo de ensayo y agréguele (2 cm) almidón, luego adiciónele Lugol, éste es el
control para la presencia de almidones. Consérvelo.

Reconocimiento de grasas
 A un tercer tubo de ensayo agréguele aceite de cocina (2 cm) y adiciónele Sudan III, agite.
Observe cómo se disuelve en el aceite. Este es el control para grasas. Consérvelo.

Reconocimiento de azúcares o glúcidos

 A un cuarto tubo de ensayo agregue glucosa (2 cm) y luego unas gotas de Benedict.
Caliente suavemente hasta que hierva. Observe la coloración final. Este es el control para
la glucosa. Consérvelo.

Ahora usted procederá a identificar los compuestos orgánicos presentes en las sustancias
problema que el profesor le indicará. Si el material es sólido lo debe macerar en un mortero,
agregándole agua, después utilizará este jugo para hacer las diferentes pruebas.

Registra las reacciones en la siguiente tabla de acuerdo al parámetro establecido (intensidad

de color):

+++ Color oscuro

++ Color definido
+ Color claro
0 No hay cambio de color

Reacción:

MUESTRA CARBOHIDRATOS PROTEÍNAS LÍPIDOS

CUESTIONARIO

1. ¿Qué función cumplen los reactivos empleados en esta práctica?

2. ¿A qué se deben los cambios de color en cada una de las preparaciones?
3. ¿Qué cambios provoca el alcohol en las grasas?
4. ¿Cuáles son los principales compuestos orgánicos que forman nuestro cuerpo?
5. ¿Por qué las proteínas forman parte de casi todas las estructuras celulares?
6. ¿Cuál es la función que cumplen las proteínas, los lípidos y los carbohidratos?

BIBLIOGRAFÍA

Azcona, L. (2003). Problemas de pigmentación: tratamiento. Demofarmacia, vol. 17.

Número 1, enero.

Brown, T. L., LeMay Jr, H. E., Bursten, B. E., & Burdge, J. R. (2004). Química: la ciencia
central. Pearson educación

Morante Carriel, J., Agnieszka-Obrebska, A., Bru-Martínez, R., Carranza Patiño, M.,
Pico-Saltos, R., & Nieto Rodriguez, E. (2014). Distribución, localización e inhibidores
de las polifenol oxidasas en frutos y vegetales usados como alimento.

Sheldrake, R. (2011). Una nueva ciencia de la vida: la hipótesis de la causación

formativa. Editorial Kairós.

Tomado de: Prácticas de Laboratorio Biología. Ciencias Ambientales. UNED, JL

Martínez Guitarte, G Morcillo.