FACULTAD DE INGENERIA AMBIENTAL

ECOTOXICOLOGIA

Practica N° 5:

DEMOSTRACIÓN DEL EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA

SOBRE LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA

I. INTRODUCCIÓN.

Las enzimas, en general, al actuar como biocatalizadores, aceleran reacciones

químicas específicas, experimentando cambios físicos durante ellas, pero
recuperando su estado original cuando la reacción química ha terminado. Sin
embargo dada la naturaleza proteica de la molécula enzimática, diferentes
factores físicos y químicos pueden modificar la actividad de una enzima, siendo
lo más importante la temperatura y el pH. Las enzimas transforman rápidamente
los sustratos a temperaturas y a valores de pH óptimos característicos para
cada una respectivamente.

Respecto al pH, las enzimas requieren, para actuar con máxima eficiencia, una
determinada concentración de iones hidrogeno en el medio, por tanto, cada
enzima tiene un pH óptimo de acción. El efecto del pH se explica por la acción
de la concentración de protones en la disociación de distintos grupos del
sustrato y en especial de la enzima, que participan tanto en la unión enzima-
sustrato y en el mecanismo catalítico mismo, como en el mantenimiento de la
determinada conformación de la enzima. A valores de pH por encima o por
debajo del pH optimo, disminuye la actividad enzimática por lo que,
generalmente se describe una curva en forma de campana.

Respecto a la temperatura, al igual que el pH, existe un rango, algunas veces

muy pequeño, donde es máxima la actividad enzimática, que está determinado

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 por la magnitud de las variaciones de la velocidad inicial en función de la
temperatura del medio, lo que significa que la velocidad inicial de reacción
aumentará con la temperatura hasta que se haga prácticamente imposible de
medir debido a una activación. La mayoría de las enzimas son completamente
inactivadas por encima de los 70 °C.

La temperatura óptima de reacción enzimática es el resultado de un balance

entre el incremento en la actividad y la velocidad de destrucción de la enzima.
La temperatura óptima no es un valor constante para una enzima dada, sino
que depende del tiempo durante el cual se hace la medición de la actividad.
Mientras más corto sea el tiempo de medición, más alta será la temperatura
óptima.

Las moléculas deben poseer cierta energía de activación para que puedan
reaccionar y las enzimas actúan disminuyendo la energía de activación,
permitiendo que la reacción avance rápidamente. Se puede determinar
fácilmente el efecto de la temperatura, exponiendo la enzima a diferentes
temperaturas y se mide la cantidad de actividad residual.

Para estudiar el efecto de estos factores sobre una reacción enzimática, se debe
trabajar en condiciones de operación bien determinadas. Los otros paramentos
o factores, deben permanecer constante respecto al factor determinante. Para
ello se trabajará como sustrato almidón y se determinara las variaciones del
almidón según procedimiento de identificación y cuantificación de sustrato
residual, utilizando solución iodada.

II. OBJETIVOS.
▪ Demostrar el efecto o influencia del pH sobre la velocidad de reacción de la
amilasa.

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 ▪ Demostrar el efecto o influencia de la temperatura sobre la velocidad de
reacción de la amilasa

III. EQUIPOS Y MATERIALES DE LABORATORIO.

3.1. Material Biológico.

▪ Amilasa

3.2. Materiales y Equipos.

▪ Pipetas
▪ Tubos de ensayos
▪ Baño maría
▪ Cocina eléctrica
▪ Balanza
3.3. Reactivos.
▪ Solución buffer acetato.
▪ Solución buffer fosfato.
▪ Solución buffer carbonato.
▪ Solución de almidón al 1%.
▪ Solución de enzima al 1%.
▪ Solución NaCl 0.1M.
▪ HCl 0.05 M.
▪ Solución Iodada.
▪ Sol. Cúprico alcalino.

IV. PROCEDIMIENTO.

4.1. OBTENCION DE ENZIMA AMILASA

▪ En un matraz colocar saliva aproximadamente 20 -30 Ml
▪ Mezclar a la misma proporción con buffer fosfato
▪ Con una gasa o algodón proceder a filtrar la mezcla
▪ El filtrado corresponde a la enzima

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 4.2. EFECTO DEL pH SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCION DE LA
AMILASA SALIVAL.

A. Sistema de Incubación:

COMPONENTES Y SISTEMA (Tubos)

PROCESO 1 2 3

Soluc. Almidón 1% 1.0 1.0 1.0

Buffer pH 2.5 3.0 - -

Buffer pH 6.8 - 3.0 -

Buffer pH 9.0 - - 3.0

Soluc. de NaCl 0.1N 0.5 0.5 0.5

Mezclar y Pre-Incubar a 37 °C por 5 minutos.

Soluc. Amilasa 0.5 % 0.5 0.5 0.5

Mezclar y Pre-Incubar a 37 °C por 15 minutos.

Inmediatamente de transcurrido el tiempo respectivo para cada

sistema, prepara y seguir con el siguiente sistema.

B. Valoración de la actividad enzimática por el sustrato residual:

SISTEMA (Tubos)
COMPONENTES Y PROCESO
Blanco 1 2 3

Soluc. HCl 0.5N 4.0 4.0 4.0 4.0

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 Agua destilada 0.5 - - -

De los tubo 1-3 parte A - 0.5 0.5 0.5

Solución Iodada 0.5 0.5 0.5 0.5

Mezclar, observar y anotar los resultados en cada sistema, bien de

manera cualitativa (de acuerdo a la intensidad del color resultante), o
bien de manera cuantitativa (leer en el lapso de 30 minutos bien el
fotocolorímetro con filtro verde, o bien en espectrofotómetro a 660 nm).

4.3. EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE

REACCION DE LA AMILASA SALIVAL.

A. Sistema de Incubación:

SISTEMA (Tubos)
COMPONENTES Y PROCESO
1 2 3

Soluc. NaCl 0.2N 0.5 0.5 0.5

Soluc. Amilasa salival. 0.5 0.5 0.5

Mezclar y colocar los tubo por 2 minutos en:

Baño de agua helada SI - -

Baño maría a 37 °C - SI -

Baño maría 65 °C - - SI

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 Soluc. Almidón 1%. 1.0 1.0 1.0

Incubar por 15 minutos a las mismas temperaturas.

Inmediatamente de transcurrido el tiempo respectivo para cada

sistema, prepara y seguir con el siguiente sistema.

B. Valoración de la actividad enzimática por el sustrato residual:

SISTEMA (Tubos)
COMPONENTES Y PROCESO
Blanco 1 Blanco 2 1 2 3

Soluc. HCl 0.5N 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0

Agua destilada 0.5 - - - -

Soluc. Almidón 1% - 0.5 - - -

De los tubo 1-3 parte A - - 0.5 0.5 0.5

Solución Iodada 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Mezclar, observar y anotar los resultados en cada sistema, bien de

manera cualitativa (de acuerdo a la intensidad del color resultante), o
bien de manera cuantitativa (leer en el lapso de 30 minutos bien el
fotocolorímetro con filtro verde, o bien en espectrofotómetro a 660 nm).

V. ESQUEMA.

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 VI. RESULTADOS.

VII. DISCUSIÓN.

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VIII. CONCLUSIÓN.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

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X. CUESTIONARIO.

1. Explique qué ocurre en cada uno de los sistemas de incubación preparados,

tanto en efecto del pH como de la temperatura.
2. Grafique el efecto del pH y la temperatura sobre la velocidad de reacción de
la amilasa salival y otras enzimas.
3. Investigue los pH y las temperaturas óptimas de otras enzimas importantes.
4. Defina que es estabilidad enzimática y explique la pH estabilidad y termo
estabilidad de una enzima.
5. Defina el punto isoeléctrico (pI) de una enzima (proteína).
6. Describa un procedimiento para demostrar (pI) de una enzima. Ejemplo
amilasa salival.

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