Laboratorio # 7: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE

LA AMILASA SALIVAL
Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de las reacciones
metabólicas que ocurren tanto a nivel celular como fuera de ellas, sin sufrir ellas cambios en su
estructura y/o función. La acción de las enzimas, por sus características físico-químicas, puede
verse afectada por las condiciones presentes en el lugar de acción de éstas. Entre los principales
factores que pueden modificar la acción enzimática tenemos:

a) La temperatura: Todas las enzimas muestran cierta termolabilidad, aunque para muchas de ellas
el aumento de la temperatura, hasta cierto límite, acelera la velocidad de la reacción. Sin
embargo, dado que son estructuras proteicas, pueden ser desnaturalizadas a medida que se
aumenta la temperatura y perder su actividad biológica. La temperatura a la cual se observa la
máxima actividad enzimática se denomina Temperatura Óptima.

b) El pH: Por su característica proteica, muchas enzimas por el pH de donde se encuentran pueden
cambiar desde un estado ionizado a uno no ionizado, afectando así la actividad biológica de las
mismas. Cada enzima posee un pH característico donde puede realizar su función (pH óptimo)
y cualquier variación del mismo puede afectar la velocidad de la reacción química catalizada.

c) Inductores e inhibidores: Existen sustancias químicas que pueden afectar la interacción del
sustrato y la enzima, ya sea aumentando la actividad enzimática (Inductores) o disminuyéndola
(Inhibidores). Los inhibidores tienen gran utilidad en bioquímica, ya que ayudan a determinar
la especificidad de la enzima por el sustrato, la naturaleza de los grupos funcionales en el
mantenimiento de la estructura activa de la enzima. Estos compuestos no son alterados
químicamente por la enzima.

Otros factores que pueden afectar la acción enzimática son: Cantidad de sustrato,
hidratación de la enzima, regulación alostérica, regulación por producto, etc.

La α-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y que degrada el
almidón. El almidón, principal polisacárido de reserva de las plantas, está compuesto por dos tipos
diferentes de moléculas: amilosa y amilopectina. Ambas tienen como monómero la glucosa (Glu).
La amilosa está formada por largas cadenas de glucosa, donde el C1 de una glucosa está unido al
C4 de la siguiente. Son cadenas lineales y se arrollan en forma helicoidal. La amilopectina está
formada por cadenas de glucosa unidas en C1 con C4 (como la amilosa) pero con múltiples
ramificaciones (uniones C1 con C6). La α-amilasa rompe uniones entre C1 y C4 de dos glucosas.
Por lo tanto, usando almidón como sustrato, libera como productos dextrinas lineales y
ramificadas. Las dextrinas son oligosacáridos compuestos, en este caso, por unas pocas unidades
de glucosa.

La actividad de las enzimas puede evidenciarse ya sea detectando la aparición de producto

o bien la desaparición del sustrato. Para esto pueden usarse test colorimétricos, absorbancia de la
luz de determinada longitud de onda, sustratos marcados radiactivamente, etc., según convenga en
cada caso. En este práctico, para medir la actividad de la α-amilasa, vamos a usar un conocido test
colorimétrico que permite revelar la presencia de almidón en una solución. Por lo tanto, vamos a
seguir la reacción detectando la desaparición del sustrato (evidenciada por el test colorimétrico)

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para determinar la actividad de la enzima. Además, analizaremos cómo afectan las distintas
condiciones en que actúa la enzima (pH, temperatura, concentración de NaCl).

Para esta experiencia se contará con una solución de iodo/ ioduro de potasio (I2/KI)
denominada lugol o solución de Lugol. El almidón en presencia de esta solución adquiere una
coloración azulada característica. Esto tiene una explicación física: el iodo se coloca en el interior
de la hélice que forma la amilosa (en las regiones hidrofóbicas), formando un complejo de color
azul. Cuando la a-amilasa actúa, degrada la amilosa, se desintegra la hélice y por tanto en
presencia de I2/KI ya no dará una coloración azul.

Materiales: Soluciones y reactivos:

- 1 Gradilla. - Solución de almidón al 2%
- 10 tubos de ensayo. - Lugol
- 2 Micropipetas (200 y 1000 µl) - Solución salina fisiológica (0,9%).
- 3 vasos de precipitado ( 50 o 100ml) - Agua destilada.
- Baño de Hielo (0°C). - Saliva humana.
- Baño termoregulado (90°C).
- Estufa a 37°C
- Cubetas para espectrofotometría
- Espectrofotómetro

Metodología:

1. Un voluntario de cada grupo debe juntar aproximadamente 5 ml de saliva en un vaso de

precipitado pequeño y diluirla con solución salina fisiológica hasta obtener 15 ml de “solución
enzimática”.
2. Con los datos de la tabla siguiente, realizar la dilución del sustrato, realizar las lecturas de
absorbancia y construir la curva de calibración para el complejo yodo-almidón.

Tubo Almidón 2% [µl] Concentración Absorbancia 590 nm

1 0

2 250

3 500

4 1.000

5 1.500

NOTA: A cada tubo se le debe de agregar 500 µl de lugol y completar hasta 5 ml con agua
destilada.

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Experimento 1: Determinación de la Actividad Enzimática

1) Tome 2 tubos de ensayo con 1 ml de solución neutra de almidón 2 % (p/v). Coloque el tubo en
un baño térmico a 37°C durante por lo menos 2 min.

2) Manteniendo los tubos con el almidón (sustrato) a 37°C agregarle 1 ml de la saliva diluida
(enzima) al primer tubo y 1 ml de suero fisiológico al segundo tubo; mezclar suavemente.

3) Incubar por 10 min a 37°C.

4) Añadir 500 µl de lugol y completar volumen a 5 ml con agua destilada.

5) Realizar la lectura de la absorbancia en el espectrofotómetro a 590 nm.

6) Determinar la concentración de almidón en cada tubo.

Experimento 2: Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática

1) Tome 4 tubos de ensayos. Añada a cada uno 1 ml de solución saliva diluida.

2) Incube por 5 minutos cada tubo a la temperatura correspondiente:

Tubo 1: 0° grados.
Tubo 2: Temperatura ambiente.
Tubo 3: 37° grados.
Tubo 4: 90° grados.

3) Agregue a cada tubo 1 ml de solución de almidón 2%, mezclar suavemente.

4) Incubar por 10 min a la temperatura correspondiente.
5) Añadir 500 µl de lugol y completar volumen a 5 ml con agua destilada.
6) Realizar la lectura de la absorbancia en el espectrofotómetro a 590 nm.
7) Determinar la concentración de almidón en cada tubo.
.
Con los datos colectados construir curva de calibración y utilizando esta calcular
concentraciones de cada ensayo de modo de poder evaluar y comentar la influencia que ejerce el
cambio de temperatura en el ensayo.

Preguntas
1.- ¿Es la amilasa una enzima del tipo Hidrolasa?.
2.- ¿Es la amilasa una enzima proteica simple o compleja?.
3.- Se afirma en internet que “La enzima humana de las amilasas alfas es una metaloenzima de
calcio, totalmente incapaz de funcionar en ausencia de calcio” ¿Es correcta esta afirmación?.
¿Cómo podría verificarlo?.
4.- A un Tecnólogo médico le piden detectar y medir niveles de amilasa en el plasma. Busque
información respecto de que diagnóstico de enfermedades puede apoyar este test.

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