PRACTICA No 11

DEGRADACIÓN DE AMINOÁCIDOS: TRANSAMINACIÓN

INTRODUCCION

La transaminación es el proceso que consiste en la transferencia reversible del grupo

amino desde un aminoácido hasta un cetoácido, dando como resultado conversión del
primero en un cetoácido y el segundo en un nuevo aminoácido. Esta reacción es de gran
importancia en el metabolismo de los aminoácidos y es catalizada por enzimas llamadas
TRANSAMINASAS o Aminotransferasas, presentes en la mayoría de tejidos animales. El
cofactor de estas enzimas es el piridoxal fosfato y para casi todas las transaminasas el alfa-
cetoglutarato es el aceptor del grupo amino, formándose por tanto ácido glutámico.

NH3 H O
R-CH-COO- C=O OOC- CH2-CH2- C- COO-
Enzima

O H NH3
R-C-COO- H-C-NH3 OOC-CH2- CH2-CH-COO-
Enzima
L-aminoácido + alfa-cetoglutarato alfa-cetoácido + L-glutámico

El interés clínico está centrado especialmente en dos transaminasas: L-alanina: alfa-

cetoglutarato aminotransferasa (ALT o Transaminasa glutámico Pirúvica TGP) y L-
aspartato: alfa-cetoglutarato aminotransferasa (AST o Transaminasa Glutámico Oxalacética
TGO). Estas enzimas tienen una acción eminentemente intracelular, por lo que la actividad
sérica en condiciones normales es baja o nula. Un aumento de actividad será evidencia de un
deterioro de los tejidos en que se encuentran de los cuales resultan particularmente
importantes corazón e hígado.
 Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado
aumento de la actividad de TGO, debido a la liberación al torrente sanguíneo de esta enzima
tan abundante en el miocardio. En este caso no existirá aumento en la actividad sérica de
TGP o será mínimo.

En hepatitis vírales u otras formas de enfermedad hepática que involucren necrosis de

tejido, habrá también un incremento considerable de la actividad sérica de transaminasas,
incluso antes de la aparición de síntomas clínicos como la ictericia. En este caso TGP será la
enzima predominante debido a su gran concentración en el tejido hepático. Una elevada
actividad de transaminasas puede detectarse también en otras condiciones como: traumas
accidentales o quirúrgicos, pancreatitis aguda, distrofias musculares, etc.

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE ALANINA AMINOTRANSFERASA TGP

(ALT)

Objetivos
 Estudio de la transaminación en suero sanguíneo normal y patológico
 Aplicación del método enzimático espectrofotométrico para la determinación de la
actividad de la TGP sérica.
Método

La determinación de ALT se realiza acoplando su acción transaminasa a la acción de la

enzima Lactato deshidrogenasa (LDH) en presencia de NADH+H.
La alanina aminotrasferasa (ALT) inicialmente llamada transaminasa glutámico pirúvica
(GPT) cataliza la transferencia reversible de un grupo amino de la alanina al α-cetoglutarato
con formación de glutamato y piruvato. El piruvato producido es reducido a lactato en
presencia de lactato deshidrogenasa (LDH) y NADH:

La velocidad de disminución de la concentración de NADH en el medio, determinado

fotométricamente, es proporcional a la concentración catalítica de ALT en la muestra
ensayada
SIGNIFICADO CLÍNICO
La ALT es una enzima intracelular, se encuentra principalmente en las células del hígado y
el riñón. Su mejor aplicación es en el diagnóstico de las enfermedades del hígado. Se
observan niveles elevados en enfermedades hepáticas como la hepatitis, enfermedades de los
músculos y traumatismos. Cuando se emplean en conjunción con la AST ayuda en el
diagnóstico de infartos de miocardio, ya que el valor de la ALT se mantiene dentro de los
límites normales y aumenta en los niveles de AST1,4,5. El diagnostico clínico debe realizarse
teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Procedimiento:
REACTIVOS
R1 Tampón TRIS pH 7,8 Lactato deshidrogenasa (LDH) L-Alanina 100 mmol/L 1200 U/L
500 mmol/L
R2 Substrato NADH α-Cetoglutarato 0,18 mmol/L 15 mmol/L

1. PREPARACIÓN del Reactivo de trabajo (RT):

a) Mezclar: 0.5 ml. de (R2) Substrato + 2 ml. (R1) Tampón.
b) Pipetear en un tubo, mezclar, incubar 1 minuto.
Evaluaremos muestras de suero sanguíneo:
Reactivos Sistemas
M C
Reactivo de trabajo 1,0mL 1,0mL
Muestra (suero sanguíneo) 100 μL ---

2. Condiciones del ensayo:

a) Longitud de onda: . . . . . . . . . .. 340 nm
Cubeta:. .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . 1 cm paso de luz
Temperatura constante . . . . . . ...37ºC
Colocar en una cubeta las soluciones preparadas y llevar al espectrofotómetro
Leer la absorbancia (A) inicial de la muestra, poner en marcha el cronometro y leer la
absorbancia cada minuto durante 3 minutos.

Expresión de Resultados:

Absorbancias
1 Muestra 0.368 0.345 0.330

2 Muestra

Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto (ΔA/min)

ΔA/min x 1750 = U/L de ALT
Unidades: Una Unidad de actividad enzimática (UI) es la cantidad de enzima que convierte
1 μmol de substrato por minuto, en condiciones estándar. La concentración se expresa en
unidades por litro (U/L).

Interrogantes Bioquímicas.

1. Cuál es la distribución celular de la TGO y TGP ?

2. Se hace referencia de que en el hepatocito TGP es una enzima, exclusivamente
citosólica. ¿Está Ud. de acuerdo con esta afirmación? ¿Cuál sería la distribución
intracelular de la TGO? Fundamente su respuesta.

3. ¿Qué papel desempeña el piridoxal fosfato en las reacciones de transaminación? ¿Cuál

es el grupo funcional del cofactor?. Explique su mecanismo

4. ¿Se desprende amoniaco libre en el medio durante una reacción de transaminación?.

Fundamente su respuesta

5. Si se administra glucosa con C14 a un animal, los carbonos marcados se incorporaran

en una proteína. Señale algunas secuencias de reacciones que permitan explicar este
fenómeno.

6. ¿Participan las reacciones de transaminación en la biosíntesis de aminoácidos?

7. ¿Qué pensaría de un ensayo en el cual una muestra biológica como el suero, se mezcla
con aaspartato, alfa-cetoglutarato, NADH y un exceso de Malato Deshidrogenasa?