Manual de “Prácticas de Bioquímica 1” UNAP - FFB

PRACTICA Nº 06

DEMOSTRACION DEL EFECTO DE LOS FACTORES QUE

MODIFICAN LA VELOCIDAD DE LA ACTIVIDADENZIMATICA

I. GENERALIDADES
En general todas las enzimas, cualquiera sea el tipo de reacción en que intervenga, presentan
características comunes, en cuanto a los factores que participan favoreciendo, retardando o
impidiendo su actividad. Dichos factores se investigan teniendo en cuenta la velocidad de
acción enzimática sobre un sustrato adecuado y en determinadas condiciones.

Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más o menos clara
de la influencia de los factores (tiempo, temperatura, concentración de enzima, pH, etc.); sobre
la serie infinita de enzima que se conoce, en este patrón general como se comprenderá varía en
forma característica para cada enzima en particular.

Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcan constantes de
tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectado por la variación que
puedan sufrir los otros.

OBJETIVOS
 Estudiar algunos de los factores que inciden en la velocidad de una reacción enzimática

II. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MATERIALES
Tubos de ensayo de 13 ml Gradilla Vaso precipitado (100, 400ml)
Pipetas (1ml, 2ml, 5ml y 10ml) Lunas de reloj Probeta de 50ml
Pizetas Embudo de vidrio Erlenmeyer de 100ml Espátula
EQUIPOS
Equipo de Baño María Cocina eléctrica Balanza analítica
MATERIAL BIOLOGICO
Solución enzimática (amilasa salival al 10% dializada)

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REACTIVOS
Agua destilada Buffer fosfato 0.1 M pH 6.6 Buffer acetato 0.1 N pH 4.6
Buffer acetato 0.1 N pH 9 HCl 0.05 N Solución de cloruro de sodio 0.2 %
Solución yodada: Yoduro de potasio 0.5% y yodato de potasio 0.367 mg%
Solución Cúprico alcalina Solución Fosfomolíbdica Solución de almidón al 1%

III. METODO - PROCEDIMIENTO

1. OBTENSION DE LA ENZIMA:
PROCEDIMIENTO:
Se obtiene la muestra salival en un vaso de precipitación la cual es posteriormente filtrada con
algodón o papel filtro delgado para evitar alteraciones de la muestra.
2. DEMOSTRACION DEL EFECTO DE FACTORES SOBRE LA ACTIVIDAD
ENZIMATICA:
Preparar un set de 8 tubos de ensayo de 12 ml según cuadro adjunto:
I II III IV V VI VII VIII
Solución de almidón al 1% 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 2 ml 1 ml
Buffer acetato 0.1N pH 4.6 5 ml
Buffer acetato 0.1N pH 6.6 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml
Buffer acetato 0.1N pH 9 5 ml
Solución de NaCl 0.2% 1.4 ml 1.4 ml 1.4 ml 1.4 ml 1.4 ml 1.4 ml 1.4 ml
H2O destilada 2.6 ml 3.4 ml 2 ml 2.6 ml 2 ml 2 ml 1 ml 2 ml
Mezclar.
Llevar los tubos del I – VII a Baño María a 37ºC X 5 minutos.
Al tubo VIII mantenerlo en Baño frío entre 0 – 4ºC X 5 minutos.
Solución enzimática 0.6 ml 0.6 ml 0.2 ml 0.6 ml 0.6 ml 0.6 ml 0.6 ml
Mezclar. Y continuar la incubación controlando el tiempo desde el momento en que se agregó
el preparado enzimático.
Los controles de la actividad enzimática se realizarán a los 10´ y 30´ de acuerdo a los
siguientes sistemas:
CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
A) Control del sustrato no transformado
Se realiza por la reacción con Yodo.

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Para este objetivo debemos de armar 2 series de tubos de ensayos de ensayos de 13 ml

marcados de igual manera que los anteriores tubos del sistema de incubación enzimática.
Una de las series será marcando además con 10´ y la otra serie con 30´.
Agregar a ambas series 5 ml de HCl 0.05 N
1) Control de la actividad enzimática a los 10´ de incubación
Usar la serie de tubos correspondiente a los 10´
a.- Cumplidos los primeros 10´ de incubación, debemos transferir 0.5 ml del incubado a los
correspondientes tubos de la serie 10 minutos.
b.- Agregar a cada tubo control 0.5 ml de solución yodada. Mezclar.
c.- Observar y anotar los resultados de la reacción valorando en forma de cruces una
disminución ligera del color respecto al patrón I
2) Control de la actividad enzimática a los 30´ de incubación.
Usar la serie de tubos correspondiente a los 30´.
a.- Cumplidos los primeros 30´ de incubación, debemos transferir 0.5 ml del incubado a los
correspondientes tubos de la serie 30 minutos.
b.- Agregar a cada tubo control 0.5 ml de solución yodada. Mezclar.
c.- Observar y anotar los resultados de la reacción valorando en forma de cruces una
disminución ligera del color respecto al patrón I
B) Control de los Productos Formados o de transformación
Se realiza por la capacidad reductora de los oligosacáridos y monosacáridos resultantes sobre
el cobre y la subsecuente de este con el fosfomolíbdato.
Este control se realiza con los tubos VI y VII de incubación enzimática a los 10 y 30 minutos
de incubación.
Armar 2 series de dos tubos de ensayos de ensayos de 13 ml marcados una serie con 10´ y la
otra serie con 30´ indicando el numero VI, VII en cada uno de ellos.
1.- Control a los 10 minutos:
COMPONENTES VI 10´ VII 10´
Solución Cúprico alcalina 1 ml 1 ml
Sistema Incub. Enz. 10´ tubo VI y VII transferir al respectivo tubo 0.5 ml 0.5 ml
Mezclar, colocar en Baño Maria de agua hirviendo por 10 minutos enfriar rápidamente en
agua corriente.

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Agregar solución fosfomolíbdica 1ml a cada uno de los tubos, mezclar agitando
enérgicamente.
Agregar 5 ml de agua destilada y mezclar.
Observar y anotar los resultados de las reacciones valorándolas por la intensidad del color
desarrollado.
2.- Control a los 30 minutos:
COMPONENTES VI 30´ VII 30´
Solución Cúprico alcalina 1 ml 1 ml
Sistem Incub Enz 30´ tubo VI y VII transferir al respectivo tubo 0.5 ml 0.5 ml
Mezclar, colocar en Baño Maria de agua hirviendo por 10 minutos enfriar rápidamente en
agua corriente.
Agregar sol. fosfomolíbdica 1ml a cada uno de los tubos, mezclar agitando enérgicamente.
Agregar 5 ml de agua destilada y mezclar.
Observar y anotar los resultados de las reacciones valorándolas por la intensidad del color
desarrollado.

IV. RESULTADOS

V. DISCUSION

VI. CONCLUSIONES

VII. RECOMENDACIÓN

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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