MÉTODOS EXPERIMENTALES APLICADOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

AÑO 2022

FACULTAD DE QUÍMICA Y FARMACIA

Radioinmunoensayos (RIA)

Radioinmunoensayos

ELISA

Western Blot
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WESTERN BLOT

¿En que consiste la técnica de Western Blot ?

El Western blot, o inmunoblot, es una tecnica analatica usada

para detectar proteinas especificas en una muestra
determinada (una mezcla compleja de proteinas, como un
extracto tisular).

Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de

la biología, como la biología molecular, la bioquímica, la
biotecnología o la inmunología.

El resultado aporta información sobre el peso molecular de la

proteína y su cantidad relativa en la muestra respecto a otras
proteinas.
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WESTERN BLOT

Con relación a las técnicas para cuantificar proteinas, que diferencia existe
entre:

q Bradford

q Wester blot

q ELISA
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WESTERN BLOT

¿En qué casos es útil utilizar Western Blot?

§ ¿Está la proteína de interés presente en mi muestra?

§ El tratamiento con un determinado agente “X”,

¿aumenta o reduce el nivel de expresión de mi
proteína?

§ ¿Mi muestra es sana o patológica?

§ ¿Cómo varía el nivel de expresión de la proteína en

distintos tejidos o líneas celulares?
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WESTERN BLOT
¿En qué casos es útil utilizar Western Blot?

§ Cómo varía el nivel de expresión de la proteína en distintos tejidos o líneas celulares

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WESTERN BLOT

1. Extracción de proteinas 2. Cuantificación de proteinas 3. Condiciones reductoras y desnaturalizantes

? ?

4. Preparación del gel 5. Separación por electroforesis 6. Transferencia de las proteinas e

inmunodetección
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WESTERN BLOT
2. Cuantificación de proteinas

§ Cuantificación a 280 nm, ya que las proteinas absorben a esta longitud de onda (la muestra debe estar pura, otras moléculas pueden
interferir).

§ Ensayos colorimétricos:

- Los ensayos colorimétricos involucran la adición de un reactivo químico

que reaccionan con determinados residuos aminoacídicos, generando un
cambio de color en la solución, que es medido utilizando un
espectrofotómetro.

- Para determinar la concentración de proteínas totales de la muestra a

analizar los resultados de absorbancia se interpola a un curva de
calibración construida utilizando una proteína estándar.

Por lo general albúmina sérica bovina (BSA bovine seric albumin)

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WESTERN BLOT
2. Cuantificación de proteinas

§ Ensayos colorimétricos:

- Ensayo de Lowry (750 nm): se trata de una reacción de redox con los enlaces
peptídicos y con los los aminoácidos Tyr, Trp y Cys. Es rápido, sencillo y
relativamente sensible.

- Ensayo BCA (Bicinchoninine acid assay) (562nm): es más sensible que Lowry y
puede realizarse en un amplio rango de temperaturas. También es sencillo,
pero requiere de tiempos de incubación un poco más largos.

- Ensayo de Bradford (595nm): es el doble de sensible que los dos anteriores.

Es un método rápido y muy sencillo y además no presenta interferencia con
sustancias reductoras como el DTT y el ß-mercaptoetanol, que sí interfieren
con los anteriormente mencionados. La desventaja es que es altamente
sensible a detergentes y lípidos.
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WESTERN BLOT
3. Condiciones reductoras y desnaturalizantes
Las muestras son normalmente tratadas con agentes que rompen las estructuras tridimensionales de las
proteínas (dímeros, estructuras terciarias)

§ Añadir el tampón de carga a la muestra y calentar 5 minutos a 95-100ºC o durante 5-10 minutos a 70ºC

El tampon de carga para condiciones desanturalizantes contiene glicerol, azul de bromofenol, SDS, Tampón Tris Peps-
tatina A, DTT o Beta-mercaptoetanol.

• El SDS desnaturaliza la proteína en su estructura primaria y la recubre de cargas negativas

• El -mercaptoetanol y el DTT son agentes reductores que rompen los puentes disulfuro
• Todo ello permite que las proteínas se separen en función del peso molecular mediante SDS-PAGE
• La reducción y desnaturalización permiten además la accesibilidad del anticuerpo a su sitio de unión

No se debe olvidad tener un control de tamaño de proteinas

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WESTERN BLOT
Preparación del gel

Componentes del gel para la electroforesis SDS-PAGE

§ Acrimalida/bisacrilamida: son moleculas que polimerizan para formar cadenas. La bisacrilamida forman uniones
con las cadenas de acrilamida para formar un entramado.

§ Tris-HCL: mantiene el pH adecuado

§ SDS: se une a las proteinas y da lugar a una linealizacion y a una uniformidad de la carga negativa de esta. Es un
detergente desnaturalizante de las proteínas. Aporta carga negativa a las proteínas de forma proporcional al
tamaño de la proteína. Rompe los enlaces de hidrogeno. Destruye la estructura secundaria y terciaria de las
proteinas.

§ TEMED (Iniciador)

§ Persulfato amonico (Catalizador)

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WESTERN BLOT

Preparación del gel

§ Para la electroforesis SDS-PAGE, hace uso de gel de poliacrilamida y de tampón con dodecilsulfato (SDS)

§ Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de la acrilamida por acción de un agente
entrecruzador, la bis-acrilamida en presencia de un iniciador (TEMED) y un catalizador (persulfato).

§ La velocidad de polimerización viene determinada por la concentración de persulfato (catalizador) y TEMED

(iniciador).

§ La mayoría de las proteínas se separan bien en el rango de 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor tamaño de
poro) es mejor para separar proteínas de gran tamaño.

Montaje del sistema

https://www.youtube.com/watch?v=q5dWKCH01Fs

Preparación de los geles

https://www.youtube.com/watch?v=o2Q90emklAI
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WESTERN BLOT
Separación por electroforesis

En función del estado de las proteínas (nativo o desnaturalizado) a lo largo del proceso electroforético éstas se
clasifican en electroforesis nativas o desnaturalizantes:

§ una electroforesis desnaturalizante, la más común, es la que somete a las proteínas a migración asegurando la
completa desnaturalización (pérdida de la estructura tridimensional). En esta situación la migración es
proporcional a la carga y al tamaño de la molécula pero no a su forma. El agente desnaturalizante más empleado
es el sodiododecilsulfato o SDS, un detergente.

§ Gracias al SDS la mayoría de las proteínas adquieren una relación carga/masa idéntica por lo que se obtiene un
fraccionamiento que obedece a: la diferencia de peso, a la longitud de la cadena (tamaño) y la forma de la
proteína.

§ Una electroforesis nativa es la que se somete a las proteínas a migración sin desnaturalización. En esta
situación las proteínas migran en función de su carga, de su tamaño y de su forma.
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WESTERN BLOT
Separación por electroforesis

Catodo

Anodo

https://www.youtube.com/watch?v=xzZ692bvpyg
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WESTERN BLOT
Detección de las proteinas

§ Tras la electroforesis, el gel debe ser teñido (lo más habitual con
Coomassie blue o tinción argentea, permitiendo la visualización de
proteínas separadas por su procesamiento posterior).

§ Tras la tinción las diferentes proteínas aparecerán como bandas distintas

en el gel.

§ Es común correr marcadores moleculares de tamaño molecular conocido

en una calle aparte del gel para calibrarlo y determinar el peso de las
proteínas desconocidas comparando la distancia recorrida con la del
marcador.

§ Aun así se pueden dar falsos positivos y negativos., un contaminante que

migre conjuntamente puede aparecer en la misma banda que la proteína
deseada. Esta co migración también puede hacer que la proteína migre en
una posición diferente o que no sea capaz de penetrar en el gel.
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WESTERN BLOT
Transferencia de las proteinas

§ Las proteínas ya separadas son transferidas a una memabrana de nitrocelulosaque las une con firmeza y en
forma no especifica por difusión, aunque la mas utilizada en la actualidad es la electrotransferencia.

§ La electrotransferencia que se basa en aplicar una corriente eléctrica y la utilización de un tampón de

transferencia para llevar las proteínas desde el gel a la membrana.

¿ Por que se deben pasar las proteínas a una

membrana de nitrocelulosa?
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WESTERN BLOT
Transferencia de las proteinas

§ Una vez lograda la transferencia de la banda de proteínas a la membrana de nitrocelulosa por alguno de los dos
tipos de transferencia descriptos se corrobora el éxito de dicha transferencia por tinción con algún colorante
como el Panceau que es fácil de remover.
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WESTERN BLOT
Inmunodetección
§ Los sitios de adsorción de la nitrocelulosa no ocupados por proteínas se bloquean con una proteína no
específica como la caseína (proteína de la leche) para prevenir la adsorción no específica de los anticuerpos
que luego se incorporan.

§ La membrana es sumergida en una solución que contiene al anticuerpo específico primario que se asociara a la
proteína de interés.

§ Luego de eliminar por lavado el exceso de anticuerpo primario la membrana se incuba con un segundo
anticuerpo dirigido contra el anticuerpo específico.

§ Este segundo anticuerpo esta acoplado de manera covalente a una enzima detectable con facilidad por
métodos espectrofotométricos.

§ Luego de eliminar el exceso de anticuerpo secundario, la enzima acoplada al anticuerpo se detecta mediante
una reacción cromogenica en la membrana, lo que hace que aparezcan bandas coloreadas sobre la nitrocelulosa
en el lugar donde estaba la proteína de interés.

https://www.youtube.com/watch?v=fK-qK6RCW9g
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WESTERN BLOT

Finalmente, se detecta la union antigeno-anticuerpo:

§ Anticuerpo secundario unido a una enzima (cataliza una reacción colorimétrica). Densitometria
o espectrometría.

§ Anticuerpo secundario unido a una enzima (reacción quimioluminiscente). Si se coloca una

película fotográfica sobre la membrana, la exposición a la luz que se desprende en la reacción
permite detectar la actividad enzimática. Densitometria.

§ Anticuerpo secundario unido a fluorocromos. Estos compuestos emiten una cantidad de luz
constante (estado estático) cuando se excitan de manera constante, permitiendo una detección
muy precisa y una cuantificación del antígeno más exacta que la de la quimioluminiscencia. En la
detección con marcadores fluorescentes se procede a la excitación lumínica de éstos que les
provoca una excitación. La fluorescencia es considerada uno de los métodos de análisis más
sensibles.

§ Uso de proteinas radioactivas que se unen al anticuerpo primario (caro, peligroso y lento)