FACISA.

ELECTROFORESIS
T.L.C.Q.
PRUEBAS ESPECIALES
CUARTO SEMESTRE
SECCIÓN A
LIC. HEYDI VELASQUEZ
GRUPO 06
 

QUETZALTENANGO MARTES 24 DE NOVIEMBRE DE 2020

ELECTROFORESIS

• ELECTROFORECIS

• Una técnica que se usa para separar fragmentos de ADN y otras

macromoléculas por tamaño y carga.
FUNDAMENTOS

• El principio de la electroforesis consiste en la migración

proporcional de las moléculas a través de un gel u otro tipo de
matriz porosa, según su peso molecular o tamaño; movimiento
generado por el campo eléctrico.
GENERALIDADES

• La cámara de electroforesis es un dispositivo que permite la

generación de un campo eléctrico alrededor de un gel en el que
se depositan las muestras.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS

• VENTAJAS:

 Alta eficiencia
 Muy bajo volumen de muestra.
 Poca cantidad de reactivo.
• DESVENTAJAS:
 Si el papel es fino, se desgarra con facilidad.
 Si el papel es grueso, las ondas se distorsionan.
PROCEDIMIENTO Y REACTIVOS

La electroforesis es un método de separación de biomoléculas como

el ADN o ARN de acuerdo a su tamaño, permitiendo además su
aislamiento cortando la zona de interés. La electroforesis en ácidos
nucleicos es muy versátil, porque permite una observación directa de
cada fragmento separado directamente en el gel, ya que, su tinción
mediante un compuesto llamado bromuro de etidio, hace visible al
ADN o ARN mediante la emisión de luz ultravioleta.
• una corriente eléctrica se aplica sobre el gel de agarosa el ADN
tiene una carga negativa y migra hacia el polo positivo. La agarosa
es un polímero lineal de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. El gel se
obtiene disolviendo la agarosa en un buffer de TAE o TBE y se
funde usando un microondas, hasta obtener una solución
homogénea y transparente
• la migración de los fragmentos de ADN variarán dependiendo del
tamaño, conformación molecular , concentración de la agarosa en
el gel, voltaje, dirección del campo eléctrico, presencia de
colorantes añadidos que se intercalan en el ADN y de la
composición del buffer en el gel.
• Cuando el ADN se deposita en los pozos del gel debe mezclarse
con un buffer de carga este permite

• 1) aumentar la densidad de la muestra para depositarse en el fondo

del pozo

• 2) teñir la muestra para facilitar su carga dentro del gel

• 3) identificar la distancia recorrida por las muestras.

• La migración del colorante contenido en el buffer de carga en
un gel con 0.5–1.4% Agarosa

• Los colorantes migrarán partiendo del mismo punto que el ADN y

ayudan a indicar la posición de corrimiento del ADN en el gel de
agarosa.
 MATERIALES

• Matraz de 250 mL

• Probeta 100 mL

• Micropipetas

• Microondas

• Cámara de electroforesis horizontal

• Guantes de nitrilo

• Balanza analíticá
REACTIVOS

• ⋇ Agarosa ⋇ Azul de bromofenol ⋇ Bromuro de etidio ⋇ EDTA ⋇ GelRe ⋇

Glicerol ⋇ Persulfato ⋇ Poliacrilamida ⋇ SDS ⋇ Tampón de carga ⋇ Tampón
TAE ⋇ Tampón Tris-Gly ⋇ Tampón Tris-HCl ⋇ TEMED ⋇ Tris ⋇ Verde cianol ⋇
Xileno-cianol ⋇
PREPARACACION DE UN GEL DE AGAROSA

• Para preparar un gel de agarosa al 1% se debe pesar 1g de agarosa y este se disuelve en

100 mL de buffer TAE 1X o TBE 1X.

• Calentar la mezcla contenida en un matraz ex profeso, en un horno de

microondas dando pulsos de 30 segundos hasta lograr una mezcla homogénea. NOTA:
evite la ebullición violenta de la mezcla. 

• Colocar la bandeja en el caster gel y gire la palanca de levas. Cerciórese de que cierra

herméticamente. NOTA: se debe nivelar el “gel caster” antes de colocar la bandeja
• Vacíar con mucho cuidado la mezcla caliente de agarosa/buffer caliente evitando hacer
burbujas y colocar un peine en un extremo. NOTA: no agregar muy caliente la mezcla
sobre la bandeja

• Se deja enfriar hasta que polimeriza el gel

• Se colocan de 2-20 µg/µL de  muestras de ADN en cada pozo con buffer de carga
• Se corre el gel a 70 volts por una hora o una hora y media. NOTA: el tiempo y el voltaje
requerirán de una estandarización 

• Se retira el gel y se deja tiñendo 30 min. en la disolución del buffer que anteriormente
se ha seleccionado y se agrega bromuro de etidio . El EtBr se agrega a una
concentración entre 200-500 ng/mL en el gel de agarosa. NOTA: El EtBr es mutagénico
y  por lo tanto se debe manejar con mucho cuidado. Se puede utilizar SYBR-green
desde que se carga la muestra y es 25 veces más sensible que el EtBr usando un
transiluminador estándar a 300 nm. 

•  
FORMA DE REPORTAR LOS RESULTADOS

• Las proteínas fijadas en geles de poliacrilamida se observan como bandas azules de diferentes pesos
moleculares.

• El peso molecular de una proteína se mide en kilodaltons.

• Puede ser determinado comparado la banda con un patrón de proteínas estándar de peso conocido
denominado marcador de peso molecular.

• La distribución de las proteínas depende de la concentración del gel, po lo tanto, el operador deberá
seleccionar el marcador de peso molecular mas adecuado.

• Algunas proteínas suelen migrar anormalmente y muchas veces aparecen con un mayor peso del
esperado.

• Las proteínas degradadas desnaturalización de las proteínas por causa de un agente químico catalizador
INTERFERENTES DE SALES

• Las sales pueden interferir en el proceso de isoelectroenfoque, por lo que deben

reducirse tanto como sea posible. Las sales provocan un aumento en la
conductividad. El enfoque de las proteínas en la primera dimensión no puede
llevarse a cabo hasta que los iones de las sales se hayan desplazado hasta los
extremos de las tiras. Cuando hay mucha concentración de sales en la tira, hay
regiones en las que las proteínas no se enfocan ocasionando distorsiones
horizontales en los geles finales.
CONTAMINACIÓN

• Durante todo el proceso de obtención de la muestra para su

posterior análisis por espectrometría de masas, es fundamental la
limpieza en el material usado . Es imprescindible el uso de guantes
para evitar contaminaciones con otras proteínas, como las
queratinas, que se encuentran en pelo, piel, determinado tipo de
ropa etc., ya que dificultan la identificación de la proteína de interés.
PRUEBAS MÁS UTILIZADAS DE ELECTROFERESIS EN EL
LABORATORIO

• EN LA MEDICINA FORENSE: En medicina forense para

determinar la identidad de las personas, ejemplo que
puedan haber participado en un delito, mediante la
vinculación de su patrón de ADN su patrón de
electroforesis- a uno que esté en una base de datos.
• EN PROYECTOS DEL GENOMA HUMANO: El proyecto genoma
humano se llevó a cabo con algo que se llama electroforesis
capilar, mediante la separación de ADN en piezas más cortas y su
separación en geles de electroforesis que permite a los patrones de
A, C, T y G ser caracterizados.
• INVESTIGACION DE PROTEINAS:También son muy importantes
en la investigación de proteínas, y en la investigación de
mutaciones genéticas, porque cuando las proteínas o el ADN están
mutados, son con frecuencia más o menos largos, y por lo tanto,
aparecen en un gel de electroforesis de manera diferente de lo
normal
GRACIAS.