Caso de estudio.

Introduccion a la electroforesis en gel de proteínas.

Las proteínas están involucradas en todos los aspectos de la vida
celular. Las proteínas funcionan para transportar materiales a través
de las membranas, catalizar reacciones químicas, organizar el ADN,
apoyar el movimiento de materiales dentro de una célula e incluso
impulsar el movimiento de toda la célula. La técnica de electroforesis
en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio o SDS-PAGE es
una técnica estándar para el análisis de la composición proteica de
una muestra. La naturaleza de la muestra variará según el
experimento específico. Las proteínas difieren en el número y tipo de
aminoácidos que se ensamblan para formar una cadena polipeptídica.
La química de las cadenas laterales de aminoácidos (grupos R)
determina el plegamiento de proteínas y la carga general de la
proteína. SDS-PAGE funciona separando proteínas en función de su
tamaño relativo. Para ello, es necesario eliminar el plegamiento de
proteínas y las diferencias a cargo de las distintas proteínas. Las
muestras de gel de proteína se tratan con el detergente no iónico,
dodecil sulfato de sodio (SDS). SDS recubre las proteínas con una
carga neta negativa, enmascarando cualquier carga normalmente
presente en la superficie de la proteína. La muestra también se trata
para interrumpir el plegamiento de proteínas mediante la adición de
reactivos químicos como ditiotreitol (DTT) o beta mercaptoetanol
(BME) y calor. DTT y BME funcionan para romper los enlaces disulfuro
dentro de la proteína. La combinación de SDS, DTT / BME y calor
desnaturalizará o desplegará la proteína. La muestra de proteína se
carga en un pocillo o espacio que se forma en la parte superior del gel
de poliacrilamida. La poliacrilamida se reticula químicamente para
formar una matriz o gel gelatinoso. La densidad del gel se puede
variar basándose en el porcentaje de composición de poliacrilamida.
Los geles de alto porcentaje de acrilamida (densos) son útiles para
examinar proteínas pequeñas, mientras que los geles de menor
porcentaje de acrilamida (delgados) son mejores para examinar
proteínas más grandes. Geles con concentración de acrilamida de
alrededor del 8-10% son estándar para la mayoría de las aplicaciones
de investigación.
El poder de SDS-PAGE proviene de su capacidad para separar una
mezcla de proteínas en bandas individuales. Las proteínas salen del
pozo y atraviesan la matriz de poliacrilamida en respuesta a una
corriente eléctrica. Recuerde que todas las proteínas de una muestra
se han tratado con SDS y, por lo tanto, ahora están cargadas
negativamente. Las proteínas cargadas negativamente migrarán
desde un ánodo hacia un cátodo en un circuito eléctrico. La velocidad
con la que migran las diversas proteínas dependerá del grado de
reticulación del gel de acrilamida. A las proteínas más pequeñas les
resultará más fácil moverse a través de la matriz reticulada, mientras
que las proteínas más grandes se moverán mucho más lentamente.
La red El efecto es la separación de proteínas según el tamaño, con
proteínas más pequeñas en la parte inferior de un gel y proteínas más
grandes cerca de la parte superior. El tamaño de una proteína se
puede estimar comparando la distancia que ha migrado una proteína
en relación con el movimiento de los estándares de peso molecular.
Estos estándares son una mezcla de proteínas de peso molecular
conocido (en unidades de kilodaltons o kDa). Los geles de proteínas
deben teñirse para visualizar las bandas de proteínas individuales
antes de que puedan analizarse. Existen varios protocolos de tinción;
sin embargo, un método muy común es el uso de un tinte llamado
Coomassie Blue. El colorante de Coomassie tiene la ventaja de unirse
a las proteínas en una proporción de 1: 1. Esto significa que la
intensidad de tinción de una banda de proteína en el gel es una
medida de la concentración de esa proteína en particular en la
muestra.
 Nombra los aminoácidos que contribuirían con una carga
positiva a la superficie de una proteína.
 ¿Qué aminoácidos están involucrados en la formación de un
enlace disulfuro?
 Realice una búsqueda de imágenes de un gel de poliacrilamida
y el aparato utilizado para ejecutar el gel.
 Explique por qué una proteína pequeña migra más rápido que
una proteína más grande en un gel.

ANTECEDENTES Los glóbulos rojos (glóbulos rojos) están

especializados para transportar oxígeno a todas las partes de un
organismo. Los glóbulos rojos son inusuales, ya que carecen de la
mayoría de los orgánulos que esperaría encontrar en una célula
eucariota típica. Estas "células" en realidad no son más que una
membrana plasmática que rodea un citoplasma lleno de la proteína
transportadora de oxígeno, la hemoglobina. Al romper los glóbulos
rojos (lisis) se libera hemoglobina y se deja una preparación pura de
membranas plasmáticas de glóbulos rojos o fantasmas de glóbulos
rojos. Debido a que estas células deben poder moverse a través de
pequeños capilares, su membrana plasmática está reforzada por una
colección especial de proteínas de la membrana periférica. Las
proteínas a / b espectrina, ankryin, actina y proteína 4.1 se unen entre
sí, formando un andamio en forma de jaula o citoesqueleto de
membrana en la superficie citoplasmática de la membrana plasmática
de glóbulos rojos. El citoesqueleto de la membrana está anclado a la
membrana plasmática a través de su unión al transportador de
aniones de banda 3. proteínas que existen como proteínas
transmembrana en la membrana plasmática de glóbulos rojos. Las
arañas que pertenecen al género Loxoceles se conocen comúnmente
como arañas reclusas pardas. A pesar de su reputación, hay pocas
muertes relacionadas con picaduras de araña reclusa parda
(envenenamiento); sin embargo, su veneno puede causar serios
problemas de salud. La forma cutánea de la picadura se localiza en la
piel y aparece como una llaga dolorosa que puede ir seguida de
necrosis o pérdida de tejido. Si el veneno se transporta al torrente
sanguíneo, puede causar la lisis de los glóbulos rojos, lo que da como
resultado la forma viscerocutánea o sistémica de la picadura, que
causa anemia, ictericia y fiebre. El veneno de araña es una mezcla de
muchas proteínas, algunas de las cuales funcionan como proteasas.
Una proteasa es un tipo de enzima que cataliza la descomposición de
proteínas en función de su capacidad para reconocer secuencias
cortas específicas de aminoácidos. Este estudio de caso ilustra cómo
se utilizó la técnica de SDS-PAGE para examinar el efecto del veneno
de araña en las células sanguíneas.

 Nombre los componentes celulares típicamente asociados con

las células eucariotas.
 Describe la diferencia entre una proteína de membrana integral
y periférica.
 Investigar / revisar la estructura del citoesqueleto de la
membrana RBC. Tenga en cuenta las interacciones entre los
diversos componentes proteicos.
 La anemia se produce cuando la cantidad de glóbulos rojos
disponibles es demasiado baja. Predecir algunos síntomas
probables que estarían asociados con la anemia.
 Sugiera una razón por la que los glóbulos rojos que carecen de
hemoglobina se denominan "fantasmas".
  Las proteasas catalizan la reacción inversa que se produce
durante la traducción. Explique cómo esta reacción haría que
una proteína se desintegrara.

MÉTODOS
Fantasmas de glóbulos rojos
Se recogieron muestras de sangre de cuatro pacientes que habían
presentado previamente la forma viscerocutánea de envenenamiento
por Loxoceles, y cuatro individuos que no habían sido envenenados.
Los glóbulos rojos se lavaron tres veces con solución salina a 4 ° C y
se lisaron usando tampón fosfato 50 mM (pH 8,3) a 4 ° C. Las
membranas fantasmas se lavaron mediante centrifugación repetida a
25.000 g hasta que se obtuvo una solución incolora de fantasmas. Los
fantasmas de membrana se almacenaron a -70 ° C hasta su uso.

Ensayos de digestión de veneno

El veneno de loxoceles se obtuvo de las arañas mediante
electroestimulación de los colmillos. Se incubaron 80 mg de
membranas fantasma de RBC con 2,5 mg de veneno de Loxoceles
crudo en tampón fosfato 50 mM a 37ºC durante 0, 30, 60 ó 120 min.
Otros digestiones utilizaron 100 mg de fantasmas de membrana
incubados durante 60 min con concentraciones crecientes de veneno
de Loxoceles. Se agregaron inhibidores de proteasa, N-etilmaleimida
(NEM), fluoruro de parametilsulfonilo (PMSF) o ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) a 80 mg de fantasmas de glóbulos
rojos normales en presencia de 2,5 mg de veneno de Loxoceles y se
incubaron durante 120 min. Antivenenos, inibhidores de proteasas a
globulos rojos sanos.
Electroforesis en gel de proteínas
Las muestras se solubilizaron mediante incubación en tampón de
muestra de gel que contenía SDS al 1%, glicerol al 10%, DTT 80 mM y
EDTA 1 mM en tampón Tris. Las muestras se hirvieron durante 10 min
y luego se aplicaron a un gel de poliacrilamida-SDS. La electroforesis
se realizó a 25 V durante 17 h. Los geles se tiñeron con azul de
Coomassie R250 al 0,05% y se escanearon usando un densitómetro.
 Realice una búsqueda para encontrar la composición química
(receta) de la solución salina fisiológica.
Cada 100 ml de solución contienen:
 
Cloruro de sodio (D.C.I.) 0,9 g
 
La osmolaridad calculada de la solución es de 307 mOsm/l y el pH de 4,5-7,0. El
contenido teórico en sodio y en cloruro es de 154 mmol/l.
 
Excipientes de declaración obligatoria:
 
-              Hidróxido de sodio c.s.p. ajuste de pH (para el medicamento acondicionado en
bolsas flexibles de polipropileno “Fleboflex” y “Fleboflex Luer”

La solución salina al 0.9 % también denominada Suero Fisiológico, es

la sustancia cristaloide estándar, es levemente hipertónica respecto al
líquido extracelular y  tiene un pH ácido. La relación de concentración
de sodio (Na+) y de cloro (Cl ) que es 1/1 en el suero fisiológico, es
favorable para el sodio respecto al cloro ( 3/2 ) en el líquido
extracelular  (  Na+ > Cl  ). Contiene 9 gramos de ClNa o 154 mEq de
Cl y 154 mEq de Na+ en 1 litro de H2O, con ina osmolaridad de 308
mOsm/L.

 Explique por qué el tratamiento de los glóbulos rojos con 50 mM

el tampón de fosfato haría que se lisasen.
50 mM phosphate buffer (pH 8.3) TONICIDAD
Dado la diferencia de ph, concentración de iones, hipotónica,menos concentración de
soluto, solucion hipotónica, entra agua y explotan o lisan
 ¿Qué color vería después de la lisis de los glóbulos rojos?
Roja oscuro. Hemoglobina da el color rojo intenso o incolora?
 ¿Por qué fue necesario eliminar toda la hemoglobina de la
preparación de membrana fantasma?
Es necesario ya que se va a realizar SDS page, proteínas de
membrana que son las que se van a ver afectadas por las
proteasas del veneno.

RESULTADOS
 Utilice la información de la figura 3.1.1 para estimar el peso
molecular (en kDa) de b espectrina, Banda 3 y actina.
B espectrina 200KDA, Actina 45KDA
 Predecir en qué se parecen y en qué se diferencian las
proteínas ayb espectrina.
son la misma proteína periférica, se diferencian en el
tamaño, alfa mas grande
 Compare el patrón de migración de proteínas en el gel que
se muestra en Figura 3.1.2 con la que se muestra en la
Figura 3.1.1. ¿Qué podría explicar ¿la diferencia?
La concentración de veneno loxeles que corta las cadenas
de péptidos o porteinas
 ¿Cuál de las bandas de proteínas en la Figura 3.1.2
corresponde al veneno proteínas? Justifica tu respuesta.
La banda 1, ahí dice, averiguar tamaño de péptido loxeles
 ¿Qué explica la diferencia en la intensidad de tinción de la
banda principal de proteína del veneno entre el carril 2 y el
carril 5 de la Figura 3.1.2?
Que se han fragmentado en tamaños de ese kda
 Proponer una explicación del cambio en la apariencia de la
banda de proteína indicada con la punta de flecha en la
Figura 3.1.2.
Veneno actuando sobre alguna enzima
 Resuma los resultados del experimento que se muestra en la
Figura 3.1.2.
Bla bla
 ¿Por qué las bandas de proteínas asociadas con el veneno
de Loxoceles no son visibles en el gel de la Figura 3.1.3?
Anti proteasas

 Describa el efecto de la exposición prolongada al veneno de

Loxoceles en el citoesqueleto de la membrana de los
eritrocitos como se ilustra en la Figura 3.1.3. ¿Se ven
afectadas otras proteínas?

 ¿Cómo se relacionan los datos de la tabla 3.1.1 con los

datos de la figura 3.1.3?

 Analice si las diferencias entre los valores informados en la

Tabla 3.1.1 deben considerarse significativas.

 ¿Existe daño a largo plazo en el citoesqueleto de la

membrana de los eritrocitos de pacientes con antecedentes
 de picadura de araña Loxoceles? Utilice los datos de la
figura 3.1.3 y la tabla 3.1.1 para justificar su respuesta.

 ¿Cuál de las condiciones probadas en el experimento que se

muestra en la Figura 3.1.4 resultó en la inhibición de la
degradación de la Banda 3?

 Diseñe un experimento que determine cuál de las

bandas de proteínas del veneno es responsable de la
pérdida de la Banda 3.

Aislar cada una de las bandas y purificar y hacer electroforesis de fantasmas con
cada una de las bandas y ver en cual se da la proteólisis de la banda 3.

 Los investigadores concluyen que la proteína del

veneno responsable de la pérdida de la Banda 3 es una
metaloproteasa. Realice una búsqueda para obtener más
información sobre esta clase de enzimas. Discuta si la
afirmación está respaldada por los datos presentados en
este estudio de caso.

 Predecir cómo la pérdida de la banda 3 podría afectar la

membrana de los glóbulos rojos citoesqueleto. ¿Cómo
se pueden traducir estos cambios en síntomas?
asociado con el envenenamiento?
Al fraccionarse la banda 3, que es una proteína de
membrana, el liquido extracelular puede entrar libremente y
hacer explotar los eritrocitos o dañar la membrana lo que
envia señales a macrófagos para digestion, esto a su vez
libera la hemoglobina que en el interior del macrófago se
rompe en globina y el grupo hemo, que por un camino
metabolico forma bilirrubina, lo que aumenta la
concentración y se genera ictericia. Tambien la coagulación.
Hemolisis, cambio morfologico, adoptan formas que no
deben tener. TONICIDAD

 Analice qué tan bien el sistema experimental utilizado en

este estudio se ajusta a las condiciones que existirían en
condiciones fisiológicas normales. ¿Qué variables
podrían verse influenciadas por el diseño de estos
experimentos? Primero, depende mucho del lugar en el
 que se produzca la mordida de la araña. Variables, lugar
de la mordida, tamaño de la araña, si es hembra o
macho, si ha realizado una mordída antes.

 ¿Cuáles son las implicaciones médicas de este estudio?

¿Cuál sugeriría que es el "siguiente paso" para la
investigación sobre este tema?

La proteasa dependiente de calcio del veneno de Loxosceles

gaucho actúa preferentemente sobre la proteína transmembrana
de la banda 3 de glóbulos rojos.
Se incubaron ochenta microgramos de fantasmas de glóbulos rojos
(RBC) de pacientes que habían presentado previamente la forma
cutánea de loxoscelismo (que presentaba dermonecrosis localizada) y
la forma viscerocutánea de loxoscelismo (que presentaba
dermonecrosis, hemoglobinuria, hematuria e ictericia) y de los
controles con 2,5 µg Veneno crudo de Loxosceles gaucho en tampón
fosfato 5 mM, pH 7,4, a 37ºC. Entre todas las proteínas de membrana,
la proteólisis cuantitativa de la importante proteína transmembrana
integral 3 aumentó con la dosis de veneno y con el tiempo de
incubación de 30 a 120 min, como lo demostró la densitometría en gel.
Se obtuvieron datos cuantitativos similares para los fantasmas de
glóbulos rojos de pacientes y de sujetos de control, hecho que se
opone a la posibilidad de factores genéticos que favorecen la forma
viscerocutánea hemolítica. Estas Los datos sugieren que las formas
clínicas pueden ser diferentes tipos de la misma enfermedad, siendo
la forma viscerocutánea el resultado de grandes cantidades de veneno
inyectado intravascularmente y la forma superficial el resultado de la
acción del veneno in situ. Dado que la proteína 3 es una proteína de
membrana integral de mantenimiento, cuya deficiencia genética
conduce a anemia hemolítica, es razonable relacionarla con la
hemólisis que se produce en la forma viscerocutánea de loxoscelismo.
La proteasa del veneno responsable del proceso no se inhibió
después de 120 min de incubación con fluoruro de parametilsulfonilo
0.2 mM o con netilmaleimida 0.2 mM, pero fue inhibida por ácido
etilendiaminotetraacético 25 mM (un agente quelante de calcio) en
tampón fosfato 5 mM a pH 7.4, que sugiere que la enzima es una
metaloproteasa dependiente del calcio.

Introducción
La picadura de la araña Loxosceles sp puede ocasionar dos variantes
clínicas de envenenamiento: una forma cutánea, que aparece como
una lesión local dolorosa seguida de necrosis, y una forma
viscerocutánea o sistémica que, además de la lesión local, presenta
anemia hemolítica junto con hemoglobinuria, hematuria, ictericia y
fiebre. Dado que esta forma solo ocurre en un pequeño porcentaje de
los casos, se ha afirmado que un factor genético puede desempeñar
un papel etiológico en su aparición. Por lo tanto, dado que la hemólisis
podría atribuirse a una deficiencia hereditaria de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa, Barretto et al. (1) investigaron pacientes con la forma
viscerocutánea, pero encontraron que solo dos de siete eran
deficientes en glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, hecho que
descartaba un papel de esta deficiencia en el desencadenamiento de
la hemólisis. Es bien sabido que la estructura y función de la
membrana de los glóbulos rojos (RBC) dependen de la red de
proteínas de la membrana y de la deficiencia hereditaria de
espectrinas, anquirinas, banda 3, banda 4.1 y banda 4.2 puede dar
lugar a trastornos graves de la membrana que desencadenan anemias
hemolíticas crónicas. Las espectrinas, anquirinas, banda 4.1 y banda
4.2 son proteínas periféricas o proteínas que pertenecen al
citoesqueleto interno y, junto con otras proteínas de membrana, el
citoesqueleto está anclado a las proteínas integrales. Estas proteínas
integrales, como la banda 3 y las glicoforinas, están firmemente
incrustadas en la bicapa lipídica de la membrana. La banda 3 funciona
como un verdadero anclaje interno para el citoesqueleto y también
presenta un dominio extracelular (2). Dado que se ha reportado la
presencia de algunas proteasas en el veneno de la araña más
prevalente en el área de São Paulo, Loxosceles gaucho (3),
determinamos el efecto de su veneno sobre las proteínas de la
membrana de los eritrocitos, lo que puede explicar el efecto hemolítico
que ocurre en la forma más grave de la enfermedad.

Material y métodos
Se recogieron muestras de sangre de cuatro pacientes que habían
presentado previamente la forma viscerocutánea, de cuatro que
habían presentado la forma cutánea de la enfermedad y de cuatro
controles. Los glóbulos rojos se lavaron tres veces con solución salina
a 4ºC y posteriormente se lisaron 1:40 con tampón fosfato 50 mM, pH
8,3, a 4ºC. Las membranas (fantasmas) se lavaron con el mismo
tampón de lisis al menos cinco veces a 25.000 ga 4ºC hasta obtener
una solución incolora de fantasmas (4). Los fantasmas se dividieron
en alícuotas y se almacenaron a -70ºC. No se utilizaron inhibidores de
proteasa durante la preparación fantasma. El veneno de L. gaucho se
obtuvo mediante electroestimulación de glándulas de araña en el
Instituto Butantan y se evaluó su contenido en proteínas. Se incubaron
80 microgramos de proteína de RBC fantasmas con 2,5 µg de veneno
crudo en tampón fosfato 50 mM, pH 8,3, a 37ºC durante 0, 30, 60 y
120 min. Se realizaron otros experimentos con cantidades crecientes
de veneno utilizando la misma concentración de fantasmas. Las
muestras se solubilizaron y se aplicaron a gel de poliacrilamida-SDS
(5), se realizó electroforesis en tampón Trisglicina 50 mM, pH 8,3, a 25
voltios durante 17 h, y se tiñeron los geles con azul de Coomassie
R250 al 0,05% y se escanearon con Densitómetro celomático.

Se utilizaron los siguientes inhibidores de proteasa de Sigma, St.

Louis, MO, EE. UU., Para identificar la clase de proteasa implicada en
la proteólisis: N-etilmaleimida 0,2 mM (NEM, un inhibidor de cisteína
proteasa), fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM (PMSF, un inhibidor
de serina proteasa) y ácido etilendiaminotetraacético 25 mM (EDTA,
un inhibidor de metaloproteasas). También se incubaron RBC
fantasmas (80 µg) de los controles con estos inhibidores de proteasa
en tampón fosfato 5 mM, pH 7,4, a 37ºC con 2,5 µg de veneno de L.
gaucho durante 120 min. En el momento en que se realizó la
investigación no existía un Comité de Ética en el Instituto Butantan
pero se obtenido de todos los pacientes.

Resultados
Para investigar el efecto del veneno de L.gaucho sobre las proteínas
de la membrana de los eritrocitos, se incubaron 80 µg de RBC
fantasmas de pacientes con las formas cutánea y viscerocutánea, así
como de sujetos control, con 2,5 µg de veneno durante 30, 60 y 120
min (Figura 1). La degradación de la proteína fantasma 3 de RBC
aumentó con el tiempo de incubación con veneno de araña, como se
puede ver en la Figura 1 y la Tabla 1. La separación de las proteínas
del veneno también se puede observar en el carril 1 de la figura,
mostrando siete bandas. Los otros carriles se refieren a otro
experimento que se realizó con fantasmas de 100 µg incubados
durante 60 min con concentraciones crecientes de veneno, mostrando
un aumento de la proteólisis de la banda 3 con concentraciones
crecientes de veneno. (Figura 2). Se ha reportado degradación de la
banda 3 cuando solo se incuban hemolizados crudos a 37ºC, pH 8.0,
durante 19 y 24 h (6), hecho que se atribuyó a las proteasas
endógenas de eritrocitos. Sin embargo, los experimentos actuales con
veneno no excedieron los 120 min, y por lo tanto, cualquier actividad
de proteasa de glóbulos rojos endógenos ciertamente sería
insignificante en comparación con la actividad de proteasa de veneno,
y la proteólisis observada en este estudio puede atribuirse ciertamente
a la acción de la veneno. El experimento con inhibidores de proteasa
mostró que ni NEM ni PMSF inhibieron la proteólisis de la banda 3. Sin
embargo, el EDTA inhibió la proteólisis de la banda 3, como se
muestra en la Figura 3. Estos datos sugieren que la (s) proteasa (s)
putativas en el veneno de L. gaucho es (son) metaloproteasas
dependientes del calcio, ya que el EDTA quela fuertemente el calcio.
Como puede verse en las Figuras 1, 2 y 3, la degradación de la banda
3 siempre se observó además de una degradación de la espectrina
mucho menor y débil. Discusión En todos los experimentos, la
proteína 3 mostró una proteólisis sólida, pero las otras proteínas de
membrana no parecieron sufrir proteólisis. Como la banda 3 es una
importante proteína transmembrana integral, cuya deficiencia genética
conduce a una anemia hemolítica esferocítica grave, es razonable
relacionar la proteólisis de la banda 3 con la hemólisis que se produce
en la forma viscerocutánea in vivo. Por tanto, la hipótesis de un rasgo
genético que predispondría a algunos individuos a una proteólisis de
banda 3 preferencial en la forma viscerocutánea de la enfermedad
parece poco probable. Sin embargo, si un rasgo genético no es
responsable de la forma viscerocutánea, ¿cuál sería el factor
etiológico hemolítico involucrado? ¿Y por qué solo un pequeño
porcentaje de pacientes presenta anemia hemolítica después de la
¿mordedura de araña? Si se acepta que el efecto del veneno en la
banda transmembrana 3 es el factor etiológico, sugerimos que la
forma viscerocutánea podría ser el resultado de una mayor cantidad
de veneno inoculado en el sitio de la picadura. Cantidades mayores de
circulante el veneno puede dañar la membrana de los glóbulos rojos y
desencadenar anemia hemolítica. Se sabe que las arañas Loxosceles
hembras son más grandes que machos y producen el doble de
veneno (7). Una araña hembra adulta con mucho veneno, es decir,
que aún no ha mordido a ningún otro animal, y una mordedura que
llegara a una vena pequeña propagaría el veneno a través de la
circulación, posiblemente explicando la hemólisis que solo ocurre en
unos pocos individuos. Todos los pacientes con la forma cutánea o
viscerocutánea de la enfermedad presentan necrosis local, por lo que
la forma viscerocutánea podría ser la manifestación clínica más grave
de la misma enfermedad, no dependiente de ningún factor genético
predisponente sino de mayores cantidades de veneno inoculado en el
sitio. de la picadura. Además, el veneno de Loxosceles sp puede ser
más fuerte que el de otras especies y se pueden inocular cantidades
variables de veneno en el lugar de la picadura. Se sabe que L. laeta
es la más grande de las arañas Loxosceles brasileñas. De hecho, las
arañas L. laeta sometidas a electroestimulación pueden producir 60 µg
de veneno y L. intermedia y L. gaucho pueden producir 30-40 µg (8),
lo que sugiere que las manifestaciones clínicas podrían estar
relacionadas con la cantidad de veneno. inoculado. De hecho, en
Chile, donde L. laeta es la especie más prevalente (9,10), la incidencia
de la forma viscerocutánea de loxoscelismo es del 13% entre todos los
pacientes. En Brasil, L. gaucho es la especie más común en São
Paulo y la incidencia de la forma viscerocutánea es del 3,1%. En
Curitiba, donde L. intermedia es la especie más común, la la
incidencia de la forma viscerocutánea alcanza el 0,15% entre todos los
pacientes (11). En el estado de Santa Catarina, donde L. laeta es, con
mucho, la especie más prevalente, la incidencia de la forma
viscerocutánea alcanza el 13,1% (12). Tambourgi y col. (13)
informaron de hemólisis in vitro mediada por complemento por la
proteína de veneno F35 purificada, así como hemólisis in vitro
dependiente de la dosis. En otro estudio, Tambourgi et al. (14)
informaron de hemólisis dependiente del complemento humano in vitro
y dermonecrosis de ratón BALB / c inducida por esfingomielinasa de
veneno. Por tanto, una hemólisis mediada por complemento causada
por veneno y una acción directa del veneno sobre la proteína de la
banda de membrana 3, o ambos, pueden ocurrir. En consecuencia,
cualquier individuo podría presentar tanto la forma cutánea como la
viscerocutánea dependiendo del volumen de veneno inoculado y de la
actividad proteolítica del veneno. Así, una mordedura superficial puede
conducir a la forma cutánea, y una mordedura más profunda con un
gran volumen de veneno que llega a un vaso superficial puede
desencadenar la forma viscerocutánea. También podrían jugar
diferentes tamaños de picaduras de araña un papel importante y uno
más grande puede causar una picadura más profunda. La acción
proteolítica del veneno sobre el dominio extracelular de la banda 3
puede alterar las propiedades de la membrana haciéndolas sensibles
a la activación del complemento, con la consecuente hemólisis
intravascular. Curiosamente, la forma cutánea, una lesión muy
localizada, no presenta hemólisis intravascular (15), lo que indica que
el veneno no llega al compartimento intravascular en esta forma
clínica. Por lo tanto, sugerimos que los dos mecanismos pueden ser
se activa secuencialmente, con una acción proteolítica directa inicial
en la banda 3 seguida de una activación adicional del complemento. El
presente estudio ha demostrado que la banda 3 de los fantasmas RBC
es especialmente sensible a las proteasas del veneno de Loxosceles.
La sugerencia de que el veneno inoculado por vía intravascular
conduce a la hemólisis requiere estudios experimentales adicionales in
vivo.
Loeta

Se ha logrado una purificación parcial del veneno de la araña chilena Loxosceles laeta. Se ha
demostrado que el componente activo no es dializable, precipita con TCA y su actividad se
pierde con el tratamiento con pepsina. La filtración en gel revela cuatro picos de elución. La
actividad se encontró en solo uno de ellos, lo que dio una banda distinta y dos débiles en una
electroforesis realizada en geles de poliacrilamida. El extracto crudo revela once bandas. El
homogeneizado dializado obtenido de las glándulas del veneno carece de las siguientes
actividades enzimáticas: fosfolipasa A, fosfolipasa C, fosfodiesterasa, proteasa, colagenasa.
Inhibe la activación in vitro de aminoácidos con la formación de ARN de transferencia de
aminoacilo. El hallazgo de actividad adenosintrifosfatasa en el extracto crudo pero no en la
fracción activa apunta a que esta inhibición es independiente de la capacidad patogénica.

“Los intentos de explicar la resistencia de algunas especies animales, Rattus norvegicus, a la

acción del veneno mediante la existencia de un factor sérico que lo neutralizaría o inactivaría,
no han tenido éxito.

"La reacción del complemento ensayada por el método de hemólisis es fuertemente inhibida
por el veneno. Los hallazgos experimentales brindan una fuerte evidencia de apoyo a la
hipótesis de que el veneno bloquearía un sitio receptor en el complejo antígeno-anticuerpo