WESTERN BLOT

WESTERN BLOT

Mtodo de biologa molecular para

detectar una protena de inters
usando un anticuerpo especfico.

El fundamento es una discriminacin

de los antgenos frente a los que se
dirigen los anticuerpos presentes en
la muestra .
WESTERN B!T
WESTERN B!T

Requiere"
#
$nticuerpo monoclonal o policlonal.
#
Solucin que contenga la protena.

%asos esenciales"
#
Transferencia de protenas de un gel a la
matri&
#
Marcado del eptope con un anticuerpo
especfico.
WESTERN B!T
WESTERN B!T

Se basa en la separacin de las

protenas 'antgenos( obtenidas del
)*+,- procedentes del lisado del
culti.o del .irus .

a protena .iral as obtenida se

coloca en un gel de poliacrilamida en
forma de l/minas delgadas 0 luego
se efect1a una electroforesis .
WESTERN B!T
WESTERN B!T

2espus se transfieren a una tira de

nitrocelulosa.

Estas tiras se e3ponen al suero

4umano diluido5 despus de una
incubacin se la.an 0 se .uel.en a
incubar con una *g6 anti4umana
marcada con una en&ima que con la
e3posicin a un re.elador en&im/tico
producir/ una banda coloreada en
las &onas correspondientes a los
anticuerpos especficos que
contenga la muestra.
WESTERN B!T
WESTERN B!T

as tiras pueden contener un

n1mero .ariable de bandas "
Principales bandas del Western blot
2enominacin %rotena gen
gp-78 %resursora de la en.oltura en.
gp-98 6lucoproteina e3terna
gp:- 6lucoproteina transmembrana
p;; %recursora gag
p:8
p9: %roteina principal
p-< %roteina de la matri&
p77 Transcriptasa in.ersa pol
p;-
p=- Endonucleasa
>riterios mnimos de
>riterios mnimos de
positi.idad
positi.idad
>riterios mnimos de ?2$

?2$" E3istencia por lo menos de tres

bandas" p9:5 p=- 0 gp:- u otra
glucoprotena

$R>" E3istencia de al menos =

bandas una por cada uno de los =
genes estructurales

>2>" $l menos dos bandas" p9:5

gp:- 0 gp-78@-98

>RSS" $l menos una banda del core

'gag@pol( 0 otra de en.oltura 'en.(

!MS" $l menos dos bandas de

en.oltura
%reparacin de la muestra
%reparacin de la muestra

as muestras pueden ser tomadas de un teAido entero o de un

culti.o celular.

Bna pequeCa cantidad del teAido se introduce en un buffer de

e3traccin. 2espus se procede a 4omogenei&arlos5 sea con una
licuadora 'para grandes .ol1menes de muestra(5 con un
4omogeni&ador 'para muestras pequeCas( o por sonicacin.

%or 1ltimo se centrifuga para obtener las protenas en el

sobrenadante5 la fraccin no precipitada.

as clulas pueden lisarse por uno de esos mtodos mec/nicos.

Tambin pueden usarse detergentes5 sales o tampones que

fa.ore&can la lisis 0 solubilicen las protenas.

$ .eces se aCaden in4ibidores de proteasas 0 fosfatasas que

e.itan la digestin por las en&imas celulares de las protenas 0 de
las fosfoprotenas5 respecti.amente.
Azul de
Bromofenol
Calentador Licuadora o
homogenizador MUESTRA
Tubos de
microcentrifugacin
uente de te!idos
Buffer de
e"traccin
Electroforesis en gel
Electroforesis en gel

as protenas de la muestra ser/n separadas mediante

una electroforesis en gel en funcin de uno o .arios de
estos criterios" punto isoelctrico5 peso molecular 0
carga elctrica. a naturale&a de la separacin depende
del tratamiento de la muestra 0 de la naturale&a del
gel.

a electroforesis en gel m/s frecuente5 conocida como

S2S,%$6E5 4ace uso de gel de poliacrilamida 0 de
tampn con dodecilsulfato 'S2S(.

En esta tcnica las protenas sufren un tratamiento por

agentes reductores que pro.ocan la prdida de las
estructuras secundaria 0 terciaria 0 mantiene los
polipptidos en este estado desnaturali&ado.

2e este modo5 la estructura tridimensional de las

protenas no influ0e en la electroforesis5 0 pueden
separarse 1nicamente en funcin del tamaCo.
uente de
energ#a
Bandas de
$rote#nas
se$aradas
Buffer del
%nodo
Buffer del
c%nodo
&el
'olo ()* 'olo (+*
Muestra
,eringa
C%mara de
electrodo
negati-o
Tan.ue
Transferencia
Transferencia

%ara que las protenas sean accesibles a la deteccin por

anticuerpos5 se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a
una membrana de nitrocelulosa o de %)2?.

Esta transferencia puede reali&arse por difusin5 por .aco o por

accin de un campo elctrico 'electrotransferencia(.

as membranas que se emplean en el Western blot se

caracteri&an por su capacidad de unir protenas de forma
inespecfica 'es decir5 se ad4ieren a todas las protenas con
idntica afinidad(
las membranas de nitrocelulosa5 aunque no se conoce
e3actamente la naturale&a de las interacciones membrana ,
protena5 se sabe con cierta seguridad que se trata de
interacciones no co.alentes de naturale&a 4idrfba.
en las membranas de %)2?5 la unin est/ basada en
interacciones 4idrofbicas 0 de dipolos entre la membrana 0
las protenas. >omo particularidad5 deben ser 4umedecidas
con metanol o etanol antes de e3ponerlas a tampones
acuosos5 debido a su alta 4idrofobicidad 0 a la ausencia de
surfactantes.
2ifusin simple
2ifusin simple

En la transferencia por difusin simple se

ponen en contacto las superficies del gel
electrofortico 0 de la membrana 05 sobre
sta5 se dispone un taco de papeles de
filtro.

Este protocolo no est/ mu0 e3tendido

actualmente5 puesto que la cantidad de
protena transferida a la membrana es mu0
baAa5 muc4o menor que con la
electrotransferencia.

Sin embargo5 4a ganado cierta popularidad

por una modificacin que permite obtener
m1ltiples transferencias de un mismo gel5
permitiendo de esta forma reali&ar .arias
pruebas sobre geles .irtualmente idnticos.

Esta modificacin es .iable cuando no es

necesaria una transferencia cuantitati.a de
protena.
Transferencia al .acio
Transferencia al .acio

En esta tcnica5 se aCade el poder de succin

de una bomba conectada a un sistema de
secado de planc4as de gel5 el cual lle.a las
protenas desde el gel 4asta la superficie de
la membrana de nitrocelulosa.

Este mtodo es ./lido tanto para protenas de

alto como de baAo peso molecular
Electrotransferencia
Electrotransferencia

Este mtodo se basa en una corriente elctrica

0 un tampn de transferencia para lle.ar las
protenas desde el gel 4acia la membrana.

%ara ello5 se apilan en el orden descrito los

siguientes elementos 'del polo negati.o o
c/todo al positi.o o /nodo(" esponAa5 .arios
papeles de filtro empapados en buffer de
transferencia5 gel5 membrana5 m/s papeles de
filtro empapados 0 otra esponAa.

Este montaAe5 llamado coloquialmente

sandDic45 se dispone en el sistema de
transferencia 0 se aplica una corriente elctrica5
de magnitud acorde a los materiales
empleados5 al tiempo disponible5

as protenas del gel se despla&an 4acia el polo

positi.o 0 quedan atrapadas por la membrana
buffer de transferencia
'olo (+*
'olo ()*
'a$el filtro
'a$el filtro
'a$el filtro
Membrana
&el
Membrana con
$rote#nas
transferidas
Bloqueo
Bloqueo

%uesto que la membrana escogida necesita poder

unirse protenas de forma inespecfica5 es preciso
bloquear los lugares de unin que 4an quedado
libres tras la transferencia.

En caso contrario5 el anticuerpo 'de naturale&a

proteica( empleado en la deteccin puede unirse a
ellos5 dificultando la distincin del compleAo
antgeno,antgeno que se forma con la protena
que se busca.

En el bloqueo se incuba la membrana con una

solucin de protenas5 tpicamente de alb1mina de
suero bo.ino o $SB 'm/s conocida por sus siglas
en ingls5 BS$(5 lec4e en pol.o o casena5 con una
diminuta fraccin de detergente5 como TDeen 98 o
Tritn E,-88.

as protenas en solucin se unir/n a todos

aquellos lugares de unin de la membrana que no
estn 0a ocupados por las transferidas desde el
gel.

2e este modo5 el anticuerpo slo podr/ unirse a su

antgeno especfico5 reduciendo as el ruido de
fondo 0 los falsos positi.os.
2eteccin
2eteccin

En la deteccin se comprueba la
presencia en la membrana de una
determinada protena. %ara ello se
emplea un anticuerpo especfico contra
ella unido a en&ima que5 en presencia de
su sustrato5 catalice una reaccin
colorimtrica 'produce color(. 2e esta
forma5 se 4ace patente la unin con el
antgeno5 la protena5 as como su
locali&acin.

El proceso tradicionalmente se 4a
reali&ado en dos pasos5 aunque a4ora es
posible la deteccin en un 1nico paso5 lo
cual es 1til en ciertos campos.
Secuencia
del Western
Blot
$plicaciones
$plicaciones
$ctualmente5 el Western blot es una de las tcnicas
m/s usadas en el estudio de la biologa molecular

El Western Blot se usa como prueba confirmatoria

cuando el E*S$ da un resultado positi.o en un grupo
que no es de riesgo o en una poblacin donde la
pre.alencia del .irus es mu0 baAa.

Se emplea como prueba definiti.a de la encefalopata

espongiforme bo.ina5 com1nmente llamada
Fenfermedad de las .acas locasF.

$lgunas clases de la prueba para la enfermedad de

0me usan el Western blot.

En .eterinaria5 ocasionalmente se emplea el Western

blot para confirmar la presencia del ?*) en gatos.
TEST DE WESTERN BLOT PARA PRUEBA
DEL VIH

Objetivo- Detectar anticuerpos especficos

contra el VIH1/2

Fundamento

est Inmunolineal o !"I#$ en banda% &ue

detecta anticuerpos

"isado viral de c'lulas infectadas%

sometidos a electrofor'sis en (el de
poliacrilamida ) transferido a *ojas de
nitrocelulosa

%!S*T*)!
,

Si dos bandas presentan intensidad G-H en
relacin al control 5
,
Bna banda de en.oltura 0 la p9:
,
%resencia de bandas gp-985 gp:-5 p=-5 p9:
0 p-< para +*)-
,
%rotenas gp-8; 0 gp=7 para +*)9
(p12+ (p,1 p-1 p2, p1.
-/ 1/ //-
0ontrol
(p1+1 (p-2
I
*N2ETERM*N$2!
,
Si dos o mas bandas presentan
intensidad H@,
,
Si una banda presente intensidad J-H
0 el resto son negati.os en relacin al
control
0riterios de interpretaci3n
I
NE6$T*)!
I
Si todas las bandas presentan .aloracin
JH@,
I
$usencia de protenas
-/ 1/ //-
0ontrol
-/ 1/ //-
0ontrol
4p12+ p2,
K 6racias