PRINCIPIOS DE LAS TÉCNICAS MÁS

USADAS EN BIOLOGÍA
MOLECULAR PARA PROTEÍNAS
PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE
PROTEÍNAS

 1. Introducción
 2.Métodos de rotura celular y
extracción de proteínas
 3. Métodos cromatográficos
 4. Métodos electroforéticos
La mayor parte de las investigaciones bioquímicas requieren la
purificación, al menos parcial, de las sustancias objeto de
estudio.
La molécula que buscamos puede ser extremamente inestable o
encontrarse a concentraciones muy bajas.
Aislamiento y Purificación de Proteínas
Células en suspensión Tejidos

Rotura o Sonicación, Detergentes

Lisis celular Criofractura, Embolo-aspas
Aislamiento y Purificación de Proteínas

Homogenizado

Centrifugación

Diferencial

Gradientes
TÉCNICAS BÁSICAS DE LABORATORIO: CENTRIFUGACIÓN -
INTRODUCCIÓN A LA CÉLULA - YOUTUBE

https://www.youtube.com/watch?v=Iuyo
Gx5A_As&t=4s
Centrifugación

Separar sólidos de líquidos de diferente densidad por

medio de una fuerza giratoria.

Movimiento de rotación que origina una fuerza que

produce la sedimentación de los sólidos o de las
partículas de mayor densidad.

Los componentes más densos de la mezcla se

desplazan fuera del eje de rotación de la centrífuga,
mientras que los componentes menos densos de la
mezcla se desplazan hacia el eje de rotación.
Centrifugación diferencial

 Se basa en la diferencia en la
velocidad de sedimentación de las
moléculas.
 Esta diferencia debe ser grande para
que sea observada al centrifugar. Las
partículas que posean densidades
similares sedimentarán juntas.
 Este método es inespecífico, por lo
que se usa como centrifugación
preparativa para separar
componentes en la mezcla
Centrifugación Diferencial
Coeficiente de
sedimentación
 El coeficiente de sedimentación, s, se define como
la razón entre la velocidad V a la que sedimenta la
molécula (o partícula, en general) y la aceleración
centrífuga aplicada, C. Este coeficiente se relaciona
con el radio r y la densidad d de la molécula, y con
la densidad do y viscosidad letra griega eta del
medio, de acuerdo con la fórmula siguiente:
Centrifugación en
gradiente de densidad
 (isopícnica) separa partículas
en un gradiente de
densidades en función de la
densidad de las mismas.
 Las partículas se mueven en
el gradiente hasta que llegan
a un punto donde la densidad
de éstas con la del gradiente
son idénticas
Centrifugación en Gradientes
Zonas de Velocidad
Centrifugación en Gradientes
Zonas de Velocidad
Ficoll-Paque

 Método más común para separar los

PBMC de los glóbulos rojos. En
función de la diferente densidad de
cada población de células
sanguíneas, pueden separarse
mediante una centrifugación de un
solo paso con el correspondiente
medio de gradiente de densidad.
 How to Isolate PBMCs from Whole Blood Using Density
Gradient Centrifugation (Ficoll™ or Lymphoprep™) -
YouTube

https://www.youtube.com/watch?v=Cl4sT
wKFe9k
Utra-centrifugación
 Una ultracentrifugadora consiste en una cámara al vacío
y refrigerada que contiene un rotor, el cual es manejado
por un motor eléctrico capaz de girar a alta velocidad.
 Las muestras son ubicadas en tubos que se encuentran
dentro del rotor o sujetos a este. La velocidad rotacional
puede alcanzar más de 100.000 rpm
 Análisis de organelas y de moléculas (técnica analitica)
 La velocidad de sedimentación puede ser monitoreada
durante el experimento para calcular la masa molecular,
así como el coeficiente de sedimentación.
 TÉCNICAS PARA LA
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS

CROMATOGRAFÍAS

Las separaciones cromatográficas se basan en las

diferencias de carga, tamaño o afinidad de las diferentes
proteínas.
 COLUMNAS
CROMATOGRAFÍA
Líquida

Fase estacionaria
Matriz

Fase móvil
Solución
Cromatografía por Filtración en gel
(Exclusión por tamaño)
Cromatografía Intercambio
Iónico
Cromatografía de Afinidad
HPLC

Es una cromatografía en fase liquida

El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de

una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones
químicas entre las sustancias analizadas y la columna
cromatográfica.

Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase

móvil. La fase estacionaria es sílica. La fase móvil actúa de
portador de la muestra
HPLC
 Video de cromatografía
 https://www.youtube.com/watch?v=QzySXjxkNlY
Métodos electroforéticos
 Métodos electroforéticos
Las moléculas en un campo eléctrico se
mueven o migran a una velocidad
determinada por su cociente carga: masa
y las propiedades físicas del medio a través
del cual migran.

 Ej:si dos moléculas tienen la misma masa y

forma, cual se moverá más rápido?
 La que tenga mayor carga neta se moverá
más rápido hacia el electrodo de polaridad
opuesta.
 En que consiste ….
 La electroforesis puede ser útil
para comprobar si la proteína
de interés se ha separado del
resto, si está pura.
 Las proteínas también se
pueden caracterizar según
tamaño y carga por la
separación en una corriente
eléctrica (electroforesis)
dentro de geles sólidos
hechos de acrilamida
polimerizada y reticulada.
Electroforesis de proteínas

Condiciones
nativas

Condiciones
desnaturalizantes
 En condiciones Nativas las
proteínas se separan en función
de su carga/masa

en condiciones desnaturalizantes

la electroforesis se realiza en
presencia de un detergente, el
SDS (dodecil sulfato sódico). SDS-
PAGE
 Electroforesis de gel de poliacrilamida SDS
(SDS-PAGE).
Condiciones
desnaturalizantes
La migración se da por
tamaño
SDS page
Electroforesis de gel de poliacrilamida
 El SDS es un detergente
aniónico

 se une a todas las

proteínas en la misma
proporción formando
una especie de micela
cargada
negativamente.
La gran carga negativa del SDS enmascara la carga intrínseca de las
proteínas, con lo que éstas se separan solo en función de su masa e
independientemente de su carga.
Geles de Poliacrilamida con SDS
(SDS-PAGE)

 http://www.youtube.com/watch?v=GY-lZc-XuFs
Para romper los puentes
disulfuro

Agente reductor para puentes

disulfuro
 SDS-PAGE
Permite estimar el
peso molecular al
comparar la distancia
a la que migra a
través del gel, con la
distancia a las que
migran las proteínas
de peso molecular
conocido.

Las proteínas pueden

ser extraídas del gel
para otros análisis.
Detección de las proteínas

 Colorantes orgánicos o a base de plata,

con luz visible
 Colorantes fluoerscente
 El azul de Coomassie es colorante
orgánico mas frecuente.
 PAGE-SDS puede separar proteínas con
diferencias relativamente grandes de
masa, pero no puede resolver con
facilidad proteínas que tengan masa
similares pe: proteínas de 41 KDa de
42KDa.
 Se deben explorar otras características
físicas:
 carga eléctrica determinada por pH y por el
número de grupos cargados
 Masa
 Electroforesis bidimensional
(nativa)
 Separación por:
 Primera dimensión: IEF (isoeléctrico enfoque): separación en gel strip por
pH
Segunda dimensión: Masa Molecular: separación en gel desnaturalizante
con SDS y reductores (como en geles convencionales)

50
Electroforesis bidimensional: usado para comparar proteomas en
células no diferenciadas y diferenciadas o en células normales y
cancerosas, distinguen más de 1000 proteínas al tiempo.

Gradiente de pH inmovilizado Gradiente de pH inmovilizado

(3-12) (5-6)
51
El conocimiento del proteoma, conjunto de
proteínas de un organismo, ha pasado a ser el
reto de la comunidad científica y de las
empresas biotecnológicas.
 El conocimiento de las secuencias de DNA
que integran nuestros genes no tiene un
gran valor, si no se identifica cual es la
función de dichos genes, en su caso, para
que proteínas codifican.

 El programa proteoma busca la

caracterización de todas las proteínas de la
célula humana, identificando su secuencia
de aminoácidos.
Identificación de
proteínas
Identificación de proteínas
• Degradación de Edman
 Identificación estructura primaria (secuencia de
a.a)
 Espectrometría de masas
 La conformación proteica se determina por
métodos físicos sofisticados
 Cristalografía de rayos X
 Microscopía crioelectrónica
 Espectroscopia por resonancia magnética
nuclear (RMN).
Espectrometría de masas
Permite analizar la composición de diferentes
elementos químicos e isótopos atómicos,
separando los núcleos por su relación masa-
carga.
Secuenciación de proteínas
 Cristalografía de rayos X
 Se determina la estructura atómica y molecular de una proteína
cristalizada Difraccion de rayos X de átomos en muchas
direcciones


Espectroscopia por resonancia magnética

nuclear (RMN).
Determinación de la Secuencia Amino-Terminal

 Reactivo de Sanger y
Método Dansyl Chloride:
reactivos que reacciona
con el residuo N-terminal
bajo condiciones
alcalinas. El análisis de los
aminoácidos modificados
son detectados por
fluorescencia. N-terminal de la cadena

 Degradación de Edman:
Se marca el grupo amino
del aminoácido N-
terminal de un
polipéptido , y luego se lo
escinde e identifica
mediante cromatografía Fenilisotiocianato
líquida de alta presión.
Degradación
de Edman
Detección de proteínas
Técnicas de detección de
proteínas
mediante anticuerpos
 Interacción Ag-Ab: tipos de enlaces.
 Técnicas de aglutinación: variantes y
aplicaciones.

 Inmunoensayo: ELISA. Variantes

principales del ELISA y aplicaciones.
Western-blot
 Técnicas con fluorescencia:
Inmunofluorescencia directa e indirecta
 REACCIONES DE AQGLUTINACIÓN

 Interacción antígeno –
anticuerpo → malla →
Precipitación
 Inmunodifusión,
inmunoelectroforesis,
etc…
 Aplicaciones:
cuantificación de
proteínas del suero
 REACCIONES DE AGLUTINACIÓN

 Interacción de Ag en
superficie celular con
anticuerpo
aglutinación de
células y precipitación
de los aglutinados

 Aplicaciones:
tipificación de grupos
ABO, Rh; prueba
embarazo, consumo
de algunas drogas,
etc…
Aglutinación
 ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Es una prueba rápida por la que un anticuerpo o

antígeno se une a una enzima como medio para
detectar una relación entre el anticuerpo y el
antígeno.

La reacción enzimática produce un cambio de

color relativo a la cantidad de proteína
presente.
ELISA (enzimoinmunoensayo)

 Hay diferentes variantes: indirecto, en

sandwich, competitivo

 Aplicaciones: detección de anticuerpos anti-

agentes infecciosos (p. ej: VIH), detección de
anticuerpos en enfermedades autoinmunes
(p. ej: anti-DNA), detección e citocinas
Ag
 ELISA SANDUCHE

Detección de Ag
Unión del Ag

= Antígeno

Detección
 ELISA - Indirecto

Unión del Ac Detección de

Ab / Ac
= Antígeno

Detección
WESTERN BLOT/ Inmunotransferencia o
inmunoblotting

 Al igual que en el ELISA, la Reacción Ag-Ab se

pone de manifiesto por reacción enzimática de
una enzima conjugada al anticuerpo: aparece
color
 A diferencia del ELISA la reacción tiene lugar
sobre un soporte sólido (papel)
 No es cuantitativo, sino cualitativo.
 Se determina el tamaño de la proteína en
estudio, por una electroforesis previa.
 Suele utilizarse como técnica de confirmación.
Western Blot o Inmunoblotting
 INMUNOFLUORESCENCIA

 La Reacción Ag-Ab se
pone de manifiesto por
emisión fluorescente (es
necesario que un
anticuerpo haya sido
combinado a un
fluorocromo en su
porción Fc.
 Inmunofluorescencia

A diferencia de todas las anteriores, no se usa para proteínas en

solución sino para proteínas en tejidos (ya sean de membrana o
intracelulares)
 Inmunofluorescencia

El estudio al microscopio de fluorescencia (tejidos fijados) se utiliza

para la detección de un gran número de autoanticuerpos
Inmunofluorescencia