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GUÍA No.

3 ELCTROFORESIS

OBJETIVOS
 Someter las muestras de proteínas a procesos químicos y físicos que permitan su
ó ptimo fraccionamiento en la electroforesis vertical.
 Fraccionar las proteínas de acuerdo a su peso molecular en una matriz de
poliacrilamida usando un campo eléctrico.

INTRODUCCIÓN

La electroforesis es una técnica que se utiliza de forma generalizada en la que,


fundamentalmente, se aplica corriente eléctrica a moléculas bioló gicas, ya sean ADN,
proteínas o ARN y se separan en funció n de si son má s grandes o má s pequeñ as. Se utiliza
en una gran variedad de aplicaciones como en medicina forense para determinar la
identidad de las personas que puedan haber participado en un delito, mediante la
vinculació n de su patró n de ADN -su patró n de electroforesis- a uno que esté en una base
de datos.

Representació n grá fica

El proyecto genoma humano se llevó a cabo con algo que se llama electroforesis capilar,
mediante la separació n de ADN en piezas má s cortas y su separació n en geles de
electroforesis que permite a los patrones de A, C, T y G ser caracterizados. También son
muy importantes en la investigació n de proteínas, y en la investigació n de mutaciones
genéticas, porque cuando las proteínas o el ADN está n mutados, son con frecuencia má s o
menos largos, y por lo tanto, aparecen en un gel de electroforesis de manera diferente de
lo normal. Las pruebas de diagnó stico para muchos casos todavía se realizan mediante
electroforesis. Es una técnica muy utilizada en la investigació n bá sica, muy importante
para la comprensió n de la funció n de genes y proteínas, pero ahora ha irrumpido en el
á rea de diagnó stico clínico y forense.

Una electroforesis se realiza generalmente en una especie de caja que tiene una carga
positiva en un extremo y una carga negativa en el otro. Y como todos aprendimos en las
clases de física, cuando se pone una molécula cargada en un entorno así, las moléculas
negativas van a la carga positiva, y viceversa. Al analizar las proteínas en un gel, en una de
estas cajas, por lo general se toma la proteína completa para ver lo grande que es. Cuanto
má s corta, má s migran en el gel, de modo que las proteínas pequeñ as terminará en la parte
inferior del gel, porque han ido má s lejos, y las má s grandes terminará n quedá ndose en la
parte superior. En el caso del ADN, el ADN es una molécula muy larga, así que no se puede
hacer un gel de una molécula entera de ADN de una célula. Es tan grande que nunca se
metería en el gel, así que lo que hacen los científicos es cortar el ADN con cosas como las
enzimas de restricció n, que cortan el ADN en pedazos má s manejables, y entonces esas
piezas, dependiendo de lo grande que sean, migran má s o menos por el gel y terminan má s
arriba o má s abajo (Austin, s.f.).

Es importante señ alar que la electroforesis en asociació n con otras técnicas tales como
PCR, e hibridació n, brinda una gran ayuda en el campo de la salud y al desarrollo científico
y biotecnoló gico. Gracias a esta técnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de
pató genos, detectar cambios o mutaciones a nivel genético, visualizar una nueva proteína,
entre otros.

En esta guía se incluye a parte del procedimiento técnico de la electroforesis, el modo de


preparació n de soluciones de electroforesis.

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS

PREPARACIÓN DEL GEL DE RESOLUCIÓN

Asegurarse de usar guantes durante la manipulació n de las soluciones.


1. Marcar el límite hasta donde la matriz de acrilamida será vertida, trazando una
línea horizontal en el vidrio con un marcador indeleble. Para saber la ubicació n
exacta de la línea, colocar el peine entre ambos vidrios y medir entre uno y cinco
centímetros (dependiendo del tamañ o de la cámara) por debajo de los dientes del
peine.

2. Realizar la preparació n del gel de resolució n a una concentració n de acuerdo a las


necesidades, mezclando los componentes en el orden que se indica a continuació n:
3. Aproximadamente 5 mL de solució n deberá n ser preparados en caso de trabajar
con geles pequeñ os de aproximadamente 8 - 10 cm de ancho por 5 - 7 cm de largo
y un espesor de 0,7 - 0,8 mm. La concentració n de poliacrilamida a usar dependerá
de las necesidades del operador.
4. Una vez finalizada la preparació n de la solució n, añ adir los catalizadores APS y
TEMED uno por uno, tratando de mezclar cada reactivo de manera uniforme en
todo el volumen.

PREPARACIÓN DEL GEL DE EMPACAMIENTO

Asegurarse de usar guantes durante la manipulació n de las soluciones.


1. Mezclar los componentes del gel. (Al 5% de acuerdo su volumen).
2. Una vez finalizada la preparació n de la solució n, agitar moderadamente sin hacer
burbujas a fin de asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente
en todo el volumen de la solució n.
3. Agregar la poliacrilamida entre los vidrios de la cá mara y sobre el gel de resolució n
ya polimerizado. Inmediatamente después, colocar el peine entre ambos vidrios
secando con papel toalla los restos de poliacrilamida que lleguen a derramarse.
4. Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 a 30 minutos
usando como control de la polimerizació n la solució n de poliacrilamida que quedó
remanente en el tubo.
5. Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos
ya formados con chorro suave de agua destilada.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA BIOLÓGICA

Materiales
 Micropipetas para volú menes de 20 µL, 200 µL y 1000 µL.
 Tubos de polipropileno de 1,5 mL y 15 mL de capacidad.
 Guantes.
 Cocinilla de asbesto.
 Vaso de precipitació n de 500 mL.
 Gradilla para tubos de 1,5 mL.
 Buffer de la muestra (Anexo A).
 Puntas de 20 µL, 200 µL y 1000 µL.

Metodología
1. Mezclar la proteína con el buffer de la muestra concentrada por cuatro veces (4x)
en proporció n 3:1 (tres partes de la muestra y una de buffer).
2. Asegurar la tapa de los tubos con lá mina extensible de parafina y someter la
muestra a una temperatura de 100° C durante 5 minutos. Para tal efecto colocar
los viales en una gradilla para microtubos dentro de un recipiente o vaso de
precipitació n con agua hirviendo.
3. Controlar la temperatura con un termó metro adecuado.
4. Finalizado el procedimiento, retirar los tubos del vaso de precipitació n y
centrifugarlos por diez segundos a 12 000 rpm. Mantenerlos en una gradilla para
microtubos dentro de un recipiente con hielo hasta el proceso de electroforesis.

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS

Materiales
Micropipetas para volú menes de 20 µL.
Cá mara de electroforesis vertical y accesorios.
Fuente de poder.
Buffer de electroforesis para proteínas (Completar con 100 mL de agua bidestilada.)
Guantes.
Gradilla para tubos de 1,5 mL.
Puntas para micropipeta de 20 µL.
Envase con lejía al 10% para descarte de puntas.

Metodología
1. Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar la degradació n de
las moléculas por la acció n de las proteasas presentes en la mano.
2. Sumergir el sistema contiendo los geles polimerizados en un tanque conteniendo
buffer de electroforesis o de resolució n para proteínas 1X. Dicho tanque lleva dos
electrodos: uno positivo y otro negativo (frecuentemente representados por
colores rojo y negro, respectivamente) que será n conectados a una fuente poder.
Al momento de sumergir los geles en el tanque, asegurarse que los pocillos del gel
estén totalmente cubiertos por el buffer.

Interior de una cá mara de electroforesis vertical en operació n: a) Durante la colocació n de la muestra en el pocillo
del gel, b) Despué s de aplicar un voltaje determinado el cual genera el empacamiento uniforme de las proteínas, c,
d y e) las proteínas migran hacia el á nodo y se distribuyen en el gel a manera de bandas.
3. Mediante el uso de puntas de hasta 20 µL y 30 µL de capacidad proceder a
depositar cuidadosamente la muestra en los pocillos evitando la contaminació n del
pocillo contiguo.
4. Considerar el uso de un marcador está ndar de proteínas para la medició n del peso
molecular de la muestra. Dicho marcador debe ser sometido a los mismos
tratamientos de la proteína, excepto cuando se trate de un marcador previamente
teñ ido en que el que se obviará el uso del buffer de la muestra.
5. Una vez finalizada la colocació n de las proteínas en cada pocito del gel, cubrir el
tanque con la tapa y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la
fuente de poder.
6. Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje y amperaje
correspondientes.
7. Para el cálculo del voltaje es importante conocer la distancia en centímetros del gel
desde la parte superior hasta la parte inferior de la matriz. La distancia
multiplicada por voltios (8V - 15 V) permitirá determinar el voltaje total. El voltaje
ó ptimo dependerá de la naturaleza de la molécula de ADN que se piensa separar,
en consecuencia, se recomienda estandarizar este procedimiento.
8. El valor del amperaje o corriente eléctrica (medida en amperios o miliamperios)
dependerá de la fuerza ió nica del buffer. En el caso de trabajar con buffer Tris-
Glicina 1X, el valor recomendado es de 25 a 30 miliamperios.
9. Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida (visualizado como una línea
azul por el colorante del buffer) haya llegado a los límites de la parte inferior del
gel.
10. Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con
desconectar los electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el
sistema que contiene el gel de poliacrilamida.
11. Levantar lentamente uno de los espaciadores de tal manera que se vaya realizando
la separació n de los vidrios que contienen el gel.
12. Separar el gel de empacamiento del gel de resolució n realizando un corte
transversal.
13. Hacer una pequeñ a muesca en una de las esquinas del gel, a fin de que sirva de
orientació n para ubicar el orden en que fueron cargadas las muestras.
14. Remover el gel. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado pues el
gel es muy frá gil y puede romperse con facilidad especialmente cuando se seca o es
de baja concentració n. Para desprender el gel del vidrio remojarlo nuevamente con
buffer de electroforesis o agua destilada y usar uno de los espaciadores a manera
de espá tula para levantarlo por una de las puntas. Coger el gel cuidadosamente
(usar guantes) y luego sumergirlo en un envase conteniendo el colorante azul
brillante de coomasie.
15. El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior
uso, pudiendo ser reciclado hasta cinco veces, después de los cuales se deberá
preparar una nueva solució n dado que puede afectar el tiempo de corrida de la
prueba.
16. Los vidrios, los espaciadores y el tanque deberá n ser lavados con abundante agua y
detergentes especiales que puedan ser fá cilmente removidos. Posteriormente,
enjuagarlos con agua destilada y secarlos a temperatura ambiente o en una estufa
a 37°C.

ELECTROFORESIS DE ADN
ELECTROFORESIS VERTICAL

Materiales
 Cá mara de electroforesis vertical y accesorios.
 Micropipetas de 20 µ, 200 µL y 1 000 µL.
 Lámina extensible de parafina.
 Puntas de polipropileno con capacidad para 20 µ, 200 µ y 1 000 µl.
 Buffer de resolució n stock TBE 5X (Llevar a un volumen de un litro con agua
bidestilada)
 Buffer de resolució n TBE 1X.
 Poliacrilamida al 30%.
 APS al 10%.
 TEMED

Metodología

Asegurarse de usar guantes durante la manipulació n de las soluciones.


1. No será necesario marcar el límite hasta donde será vertida la poliacrilamida,
debido a que el gel usado es continuo.
2. Realizar la preparació n del gel siguiendo el orden que se indicó anteriormente
para las proteínas.
3. Aproximadamente 5 mL de la solució n deberá n ser preparado en caso de trabajar
con geles pequeñ os (aproximadamente 8 - 10 cm de ancho x 5 - 7 cm de largo y un
espesor de 0,7 - 0,8 mm). La concentració n de poliacrilamida para ADN dependerá
de los objetivos de trabajo del operador.
4. Una vez finalizada la preparació n de la solució n, agitar moderadamente sin hacer
burbujas a fin de asegurar que el TEMED y el APS se distribuyan uniformemente
en todo el volumen.
5. Agregar un volumen de la solució n de poliacrilamida entre las placas de vidrio
hasta el tope. Inmediatamente después, colocar el peine de tefló n entre ambos
vidrios secando con papel toalla los restos de poliacrilamida que se lleguen a
derramar.
6. Dejar polimerizar la poliacrilamida a temperatura ambiente por 15 - 30 minutos,
usando como control la solució n de poliacrilamida que quedó remanente en el
tubo.
7. Una vez formado el gel, retirar el peine cuidadosamente y lavar todos los pocillos
ya formados con chorro suave de agua destilada.

ELECTROFORESIS DE ADN EN GELES DE POLIACRILAMIDA

Materiales
 Micropipetas para volú menes de 20 µl.
 Cá mara de electroforesis.
 Fuente de poder.
 Poliacrilamida al 30%.
 TEMED.
 APS 10%.
 Buffer de electroforesis para ADN TBE (Llevar a un volumen de un litro con agua
bidestilada).

 Buffer de la muestra para ADN (Disolver en 10 mL de TAE 1X).


 Guantes.
 Gradilla para tubos de 1,5 mL.
 Puntas para micropipeta de 20 µl.

Metodología
Asegurarse de usar guantes durante la manipulació n de las muestras, los reactivos y el
equipo.
1. Sumergir el sistema conteniendo los geles polimerizados en su tanque
correspondiente. Existen dos tanques de electroforesis y cada uno de ellos lleva
dos electrodos: uno de polo positivo y otro de polo negativo que será n conectados
a una fuente de poder. Asimismo, contiene el buffer de electroforesis para ADN, en
este caso el buffer TBE 1X (Figura N° 9). Al momento de sumergir los geles en el
tanque, asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente saturados de buffer.
2. Para colocar el ADN en los pocillos es importante mezclar cinco volú menes de
solució n que contiene el ácido nucleico con un volumen del buffer de la muestra de
ADN concentrada 6 veces o buffer de muestra 6X. Añ adir un volumen de buffer de
la muestra repartidos en alícuotas, de acuerdo al nú mero de muestras que se
colocará n en los pocillos, sobre un pedazo de lámina extensible de parafina

Acto seguido, añ adir cinco volú menes


de cada una de las muestras de ADN sobre las alícuotas de buffer de la muestra y
mezclar totalmente.
3. Mediante el uso de puntas de 20 µl proceder a cargar cuidadosamente la muestra
en los pocillos evitando la contaminació n del pocillo contiguo.

Interior de una cámara de


electroforesis vertical para ADN en
operación. A: Durante el depósito de
la muestra de ADN mezclado con el
buffer de muestra. B-D: Aplicación
del voltaje y migración del ADN a
través del gel poliacrilamida. E: Las
moléculas de ADN se agrupan en la
matriz formando una banda que
puede ser visualizada por fluorescencia tiñiendo el ADN con bromuro de etidio y aplicando luz
ultravioleta.

4. Considerar el uso de un marcador de peso molecular está ndar de ADN para la


determinació n del peso molecular de la muestra. Preparar el marcador de acuerdo
a las intrucciones del fabricante. Una vez finalizada la colocació n del ADN en los
pocillos, cubrir el tanque con la tapa y conectar los cables correspondientes de los
electrodos en la fuente de poder.
5. Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje adecuado. El
voltaje dependerá principalmente de las necesidades del operador y del tipo de
ADN que es utilizado. Para el caso de productos de PCR, el voltaje puede estar
comprendido entre 75 a 100 voltios. Es importante señ alar que en la electroforesis
de ADN el valor del voltaje debe ser constante, a diferencia del valor del amperaje
que dependerá principalmente del valor del voltaje.
6. Luego de seleccionar las condiciones de voltaje, iniciar el proceso de la
electroforesis. Durante el proceso se evidenciará n dos frentes de corrida de
diferente color y distancia de migració n. Ambos colores, azul oscuro y azul claro
corresponden a los colorantes azul de bromofenol y xilene cianol, respectivamente,
que conforman el buffer de la muestra. El xilene cianol en geles de poliacrilamida
al 8% migra de manera similar a un fragmento de ADN de 160 pb, mientras que el
azul de bromofenol a esta misma concentració n de poliacrilamida es equivalente a
un fragmento de 45 pb.

7. Detener la electroforesis hasta que ambos frentes de corrida se localicen en la


posició n deseada por el operador (este proceso debe ser estandarizado).
8. Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con la
desconexió n de los electrodos de la fuente de poder, removiendo el sistema que
contiene el gel de poliacrilamida.
9. Levantar lentamente uno o ambos espaciadores a la vez, de tal manera que se vaya
realizando la separació n de los vidrios que contienen el gel.
10. Remover el gel de uno de los vidrios. Para realizar este proceso se requiere de
mucho cuidado, pues el gel es muy frá gil y puede romperse con facilidad. Para
desprender el gel del vidrio, remojarlo nuevamente con buffer de electroforesis y
usar uno de los espaciadores a manera de espá tula para levantarlo por una de las
puntas. Desplazar el gel hacia un envase limpio para su respectiva tinció n en
bromuro de etidio o en nitrato de plata.
11. Los vidrios, los espaciadores y el tanque deberá n ser lavados con abundante agua y
detergente que no deje residuos. Posteriormente enjuagarlos con agua destilada y
secarlos a temperatura ambiente o en una estufa a 37° C.
BIBLIOGRAFÍA
Yá bar-Varas, C. A. (2003). MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS PARA
PROTEÍNAS Y ADN. Divisió n de Biología Molecular Centro Nacional de Salud
Pú blica Instituto Nacional de Salud. Lima, Perú
Austin, Christopher P., M.D. National Human Genome Research Institute. Extraído de
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Electroforesis

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