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3 ELCTROFORESIS
OBJETIVOS
Someter las muestras de proteínas a procesos químicos y físicos que permitan su
ó ptimo fraccionamiento en la electroforesis vertical.
Fraccionar las proteínas de acuerdo a su peso molecular en una matriz de
poliacrilamida usando un campo eléctrico.
INTRODUCCIÓN
El proyecto genoma humano se llevó a cabo con algo que se llama electroforesis capilar,
mediante la separació n de ADN en piezas má s cortas y su separació n en geles de
electroforesis que permite a los patrones de A, C, T y G ser caracterizados. También son
muy importantes en la investigació n de proteínas, y en la investigació n de mutaciones
genéticas, porque cuando las proteínas o el ADN está n mutados, son con frecuencia má s o
menos largos, y por lo tanto, aparecen en un gel de electroforesis de manera diferente de
lo normal. Las pruebas de diagnó stico para muchos casos todavía se realizan mediante
electroforesis. Es una técnica muy utilizada en la investigació n bá sica, muy importante
para la comprensió n de la funció n de genes y proteínas, pero ahora ha irrumpido en el
á rea de diagnó stico clínico y forense.
Una electroforesis se realiza generalmente en una especie de caja que tiene una carga
positiva en un extremo y una carga negativa en el otro. Y como todos aprendimos en las
clases de física, cuando se pone una molécula cargada en un entorno así, las moléculas
negativas van a la carga positiva, y viceversa. Al analizar las proteínas en un gel, en una de
estas cajas, por lo general se toma la proteína completa para ver lo grande que es. Cuanto
má s corta, má s migran en el gel, de modo que las proteínas pequeñ as terminará en la parte
inferior del gel, porque han ido má s lejos, y las má s grandes terminará n quedá ndose en la
parte superior. En el caso del ADN, el ADN es una molécula muy larga, así que no se puede
hacer un gel de una molécula entera de ADN de una célula. Es tan grande que nunca se
metería en el gel, así que lo que hacen los científicos es cortar el ADN con cosas como las
enzimas de restricció n, que cortan el ADN en pedazos má s manejables, y entonces esas
piezas, dependiendo de lo grande que sean, migran má s o menos por el gel y terminan má s
arriba o má s abajo (Austin, s.f.).
Es importante señ alar que la electroforesis en asociació n con otras técnicas tales como
PCR, e hibridació n, brinda una gran ayuda en el campo de la salud y al desarrollo científico
y biotecnoló gico. Gracias a esta técnica es posible visualizar las bandas de ARN o ADN de
pató genos, detectar cambios o mutaciones a nivel genético, visualizar una nueva proteína,
entre otros.
Materiales
Micropipetas para volú menes de 20 µL, 200 µL y 1000 µL.
Tubos de polipropileno de 1,5 mL y 15 mL de capacidad.
Guantes.
Cocinilla de asbesto.
Vaso de precipitació n de 500 mL.
Gradilla para tubos de 1,5 mL.
Buffer de la muestra (Anexo A).
Puntas de 20 µL, 200 µL y 1000 µL.
Metodología
1. Mezclar la proteína con el buffer de la muestra concentrada por cuatro veces (4x)
en proporció n 3:1 (tres partes de la muestra y una de buffer).
2. Asegurar la tapa de los tubos con lá mina extensible de parafina y someter la
muestra a una temperatura de 100° C durante 5 minutos. Para tal efecto colocar
los viales en una gradilla para microtubos dentro de un recipiente o vaso de
precipitació n con agua hirviendo.
3. Controlar la temperatura con un termó metro adecuado.
4. Finalizado el procedimiento, retirar los tubos del vaso de precipitació n y
centrifugarlos por diez segundos a 12 000 rpm. Mantenerlos en una gradilla para
microtubos dentro de un recipiente con hielo hasta el proceso de electroforesis.
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
Materiales
Micropipetas para volú menes de 20 µL.
Cá mara de electroforesis vertical y accesorios.
Fuente de poder.
Buffer de electroforesis para proteínas (Completar con 100 mL de agua bidestilada.)
Guantes.
Gradilla para tubos de 1,5 mL.
Puntas para micropipeta de 20 µL.
Envase con lejía al 10% para descarte de puntas.
Metodología
1. Todo el procedimiento requiere el uso de guantes a fin de evitar la degradació n de
las moléculas por la acció n de las proteasas presentes en la mano.
2. Sumergir el sistema contiendo los geles polimerizados en un tanque conteniendo
buffer de electroforesis o de resolució n para proteínas 1X. Dicho tanque lleva dos
electrodos: uno positivo y otro negativo (frecuentemente representados por
colores rojo y negro, respectivamente) que será n conectados a una fuente poder.
Al momento de sumergir los geles en el tanque, asegurarse que los pocillos del gel
estén totalmente cubiertos por el buffer.
Interior de una cá mara de electroforesis vertical en operació n: a) Durante la colocació n de la muestra en el pocillo
del gel, b) Despué s de aplicar un voltaje determinado el cual genera el empacamiento uniforme de las proteínas, c,
d y e) las proteínas migran hacia el á nodo y se distribuyen en el gel a manera de bandas.
3. Mediante el uso de puntas de hasta 20 µL y 30 µL de capacidad proceder a
depositar cuidadosamente la muestra en los pocillos evitando la contaminació n del
pocillo contiguo.
4. Considerar el uso de un marcador está ndar de proteínas para la medició n del peso
molecular de la muestra. Dicho marcador debe ser sometido a los mismos
tratamientos de la proteína, excepto cuando se trate de un marcador previamente
teñ ido en que el que se obviará el uso del buffer de la muestra.
5. Una vez finalizada la colocació n de las proteínas en cada pocito del gel, cubrir el
tanque con la tapa y conectar los cables correspondientes de los electrodos en la
fuente de poder.
6. Encender la fuente de poder y proceder a seleccionar el voltaje y amperaje
correspondientes.
7. Para el cálculo del voltaje es importante conocer la distancia en centímetros del gel
desde la parte superior hasta la parte inferior de la matriz. La distancia
multiplicada por voltios (8V - 15 V) permitirá determinar el voltaje total. El voltaje
ó ptimo dependerá de la naturaleza de la molécula de ADN que se piensa separar,
en consecuencia, se recomienda estandarizar este procedimiento.
8. El valor del amperaje o corriente eléctrica (medida en amperios o miliamperios)
dependerá de la fuerza ió nica del buffer. En el caso de trabajar con buffer Tris-
Glicina 1X, el valor recomendado es de 25 a 30 miliamperios.
9. Realizar la electroforesis hasta que el frente de corrida (visualizado como una línea
azul por el colorante del buffer) haya llegado a los límites de la parte inferior del
gel.
10. Finalizada la electroforesis proceder al desmontaje del equipo empezando con
desconectar los electrodos de la fuente de poder ya apagada y removiendo el
sistema que contiene el gel de poliacrilamida.
11. Levantar lentamente uno de los espaciadores de tal manera que se vaya realizando
la separació n de los vidrios que contienen el gel.
12. Separar el gel de empacamiento del gel de resolució n realizando un corte
transversal.
13. Hacer una pequeñ a muesca en una de las esquinas del gel, a fin de que sirva de
orientació n para ubicar el orden en que fueron cargadas las muestras.
14. Remover el gel. Para realizar este proceso se requiere de mucho cuidado pues el
gel es muy frá gil y puede romperse con facilidad especialmente cuando se seca o es
de baja concentració n. Para desprender el gel del vidrio remojarlo nuevamente con
buffer de electroforesis o agua destilada y usar uno de los espaciadores a manera
de espá tula para levantarlo por una de las puntas. Coger el gel cuidadosamente
(usar guantes) y luego sumergirlo en un envase conteniendo el colorante azul
brillante de coomasie.
15. El buffer de electroforesis puede ser devuelto a su frasco original para su posterior
uso, pudiendo ser reciclado hasta cinco veces, después de los cuales se deberá
preparar una nueva solució n dado que puede afectar el tiempo de corrida de la
prueba.
16. Los vidrios, los espaciadores y el tanque deberá n ser lavados con abundante agua y
detergentes especiales que puedan ser fá cilmente removidos. Posteriormente,
enjuagarlos con agua destilada y secarlos a temperatura ambiente o en una estufa
a 37°C.
ELECTROFORESIS DE ADN
ELECTROFORESIS VERTICAL
Materiales
Cá mara de electroforesis vertical y accesorios.
Micropipetas de 20 µ, 200 µL y 1 000 µL.
Lámina extensible de parafina.
Puntas de polipropileno con capacidad para 20 µ, 200 µ y 1 000 µl.
Buffer de resolució n stock TBE 5X (Llevar a un volumen de un litro con agua
bidestilada)
Buffer de resolució n TBE 1X.
Poliacrilamida al 30%.
APS al 10%.
TEMED
Metodología
Materiales
Micropipetas para volú menes de 20 µl.
Cá mara de electroforesis.
Fuente de poder.
Poliacrilamida al 30%.
TEMED.
APS 10%.
Buffer de electroforesis para ADN TBE (Llevar a un volumen de un litro con agua
bidestilada).
Metodología
Asegurarse de usar guantes durante la manipulació n de las muestras, los reactivos y el
equipo.
1. Sumergir el sistema conteniendo los geles polimerizados en su tanque
correspondiente. Existen dos tanques de electroforesis y cada uno de ellos lleva
dos electrodos: uno de polo positivo y otro de polo negativo que será n conectados
a una fuente de poder. Asimismo, contiene el buffer de electroforesis para ADN, en
este caso el buffer TBE 1X (Figura N° 9). Al momento de sumergir los geles en el
tanque, asegurarse que los pocillos del gel estén totalmente saturados de buffer.
2. Para colocar el ADN en los pocillos es importante mezclar cinco volú menes de
solució n que contiene el ácido nucleico con un volumen del buffer de la muestra de
ADN concentrada 6 veces o buffer de muestra 6X. Añ adir un volumen de buffer de
la muestra repartidos en alícuotas, de acuerdo al nú mero de muestras que se
colocará n en los pocillos, sobre un pedazo de lámina extensible de parafina