ELECTROFORESIS de PROTEÍNAS
PEyC 2022
La electroforesis consiste en un método separativo basado
en el tamaño, forma y carga de las moléculas.
¿Qué usamos para la electroforesis de proteínas?
Los soportes de elección para la electroforesis de proteínas son los geles de poliacrilamida
(PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis) debido a su buena resolución.
Además, poseen una serie de ventajas tales como: ser químicamente inertes, estables en un amplio
rango de pH, temperatura y fuerza iónica y fáciles de generar mediante la polimerización de
acrilamida.
El gel de poliacrilamida se puede teñir, documentar o incluso se puede purificar la molécula de interés
cortando literalmente el fragmento del gel.
¿Qué usamos para la electroforesis de proteínas?
Gel de poliacrilamida
La malla porosa de los geles de poliacrilamida permite separar los complejos según su tamaño molecular.
Se obtiene por la polimerización de moléculas de acrilamida y de bisacrilamida.
El tamaño de los poros puede ser regulado variando la concentración de acrilamida y de bisacrilamida.
¿Qué usamos para la electroforesis de proteínas?
Gel de poliacrilamida
La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida puede llevarse a cabo en condiciones nativas
(ND-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE).
Condiciones nativas (ND-PAGE) o nativo/ no disociante
Las muestras sembradas mantienen la actividad biológica y la
conformación.
La separación está dada por densidad de carga y tamaño, no se separan
subunidades.
El pH es crítico porque la densidad de carga depende del pH.
Las proteínas mantienen
su estructura
tridimensional y las
diferentes cadenas
polipeptídicas pueden
permanecer unidas,
separándose en función
de su carga, tamaño y
forma.
Condiciones desnaturalizantes: SDS- PAGE
Una de las técnicas más utilizadas en proteómica y en cualquier laboratorio
que realiza análisis de proteínas, ya sea investigación como clínica, es la
electroforesis SDS-PAGE.
En esta técnica, se usa el detergente SDS, el cual despliega a las
proteínas y se queda pegado a su superficie brindandoles una gran
carga negativa.
Esa gran carga negativa enmascara la carga propia de la proteína: así
todas presentan la misma carga, y la separación se dará unicamente por
la masa molecular de la proteína.
Condiciones desnaturalizantes: SDS- PAGE
La cantidad de SDS que se une a las proteínas es proporcional a su
tamaño entonces los complejos SDS-proteínas obtienen un valor
carga/masa constante y por lo tanto se separan con una velocidad
de acuerdo a su tamaño.
Además del SDS, se emplean
otros agentes desnaturalizantes
como son un agente reductor,
generalmente el 2-
mercaptoetanol o DTT, que
reducen los puentes disulfuro
entre cisteínas.
Condiciones desnaturalizantes: SDS- PAGE
El SDS-PAGE se usa para determinar el
peso molecular de proteínas mediante la
comparación con un estándar de peso
molecular, y para determinar el número y
peso de subunidades de un complejo de
proteínas.
El SDS-PAGE es un método mucho más
resolutivo que la electroforesis en
condiciones nativas; pero como las
proteínas se desnaturalizan, es imposible
detectar si ellas tienen actividad
enzimática.
Electroforesis: SDS-PAGE
Tipos de geles
Continuos: La muestra se siembra directamente en el gel de resolucion. Se
utiliza el mismo buffer para la corrida, las muestras y el gel.
Discontinuos: Gel de siembra (Stacking): Apilamiento de las muestras. El gel permite
que las muestras se concentren.
Gel de resolución (Running): permite la separacion de las proteínas.
Influencia del pH
En la EF el buffer tiene dos funciones:
- Aportar las cargas para la conductividad eléctrica.
-Brindar un pH que va a determinar las cargas de las muestras.
El pI es aquel pH en el
cual la molécula tiene
carga neta cero.
La EF de proteínas se hace a
pH alcalino, en el que la
mayoría de las proteínas
tienen una carga global
negativa.
Materiales: SDS- PAGE
BUFFER LAEMMLI: buffer de carga (x3):
Tris-HCI 0,125 M, pH 6,8; SDS 4%; glicerol 20%; 2-mercaptoetanol 10%; Azul de bromofenol
0,008%.
Se calientan las muestras para asegurar la disociación de las proteínas en sus subunidades.
BUFFER DE CORRIDA:
Tris-HCl 0,025 M, pH 8,8, glicina 0,192 M y SDS 0,1%
SOLUCIÓN DE TINCIÓN
Metanol/acético/H2 0 (5/1/5) con azul de Coomassie (1 g/l).
SOLUCIÓN DE DESTEÑIDO
Metanol/acético/H2 0 (10/10/80).
