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GRUPO T # 6
CRISTINA BRAVO ALEMAN
JUSTINA MAGDALENA TITO
BLANCA PACO OPORTO
Doctora: ISABEL MAMANI MAGNE
Carrera: BIOQUIMICA Y QUÍMICA FARMACEUTICA Página 1 de 10
Asignatura: ANÁLISIS CLINICO II

ELECTROFORESIS

1. INTRODUCCION

Las proteínas son el principal componente estructural y funcional de las células y tienen numerosas
e importantes funciones dentro del organismo que van desde su papel catalítico (enzimas) hasta su
función en la motilidad corporal (actina, miosina), pasando por su papel mecánico (elastina,
colágeno), de transporte y almacén (hemoglobina, mioglobina, citocromos), protección
(anticuerpos), reguladora (hormonas), etc.

En el suero existen cientos de proteínas producidas por diversos órganos. A excepción de las
proteínas del complemento hemolítico, las inmunoglobulinas y una gran variedad de hormonas, casi
todas las proteínas son sintetizadas en el hígado y vertidas al sistema circulatorio. Muchas de estas
proteínas o son filtradas por el riñón o son metabolizadas en diversas células y órganos.

Es por esto que las proteínas están presentes en todas las células y en los distintos líquidos
corporales: suero o plasma (66-83g/L), orina (100-200 mg/L), líquido cefalorraquídeo (15-45 mg/dL).

La proporción de las fracciones proteicas individuales cambia en el transcurso de un gran número

de enfermedades (Hematológicas, Inmunológicas, Renales, Hepáticas, Gastrointestinales,
Nutricionales, Afecciones en medula ósea) lo que conlleva a que la cuantificación de las mismas
sea de valor considerable en el diagnóstico clínico. Los procedimientos más utilizados actualmente
en el laboratorio clínico para el estudio de las proteínas son: Turbidimetría y nefelometría,
Inmunodifusión, Electroforesis, Inmunoelectroforesis, Inmunoelectroforesis en cohete,
Inmunofijación, y Cromatografía.

2. ¿QUÉ ES LA ELECTROFORESIS?

Es una de las técnicas más sencillas utilizadas para la separación y posterior cuantificación del
contenido proteico de las muestras biológicas. Esta técnica se basa en la propiedad de las
proteínas para moverse según su peso molecular y su carga eléctrica al colocar una muestra de
suero del paciente en una matriz (Gel agarosa o Acetato de celulosa) y aplicar un voltaje (aplicando
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un campo eléctrico). Cuando una mezcla (suero de pH 7.4, presenta proteínas con carga + y -) es
colocada en un campo eléctrico con pH alcalino (8.9), todas las proteínas quedan con carga
eléctrica negativa y migran del Cátodo (-) hacia el Ánodo (+).

3. CLASIFICACION

 ELECTROFORESIS DE FRENTE MÓVIL O LIBRE.- Históricamente es el origen de la

electroforesis tal y como hoy la conocemos. El campo eléctrico se aplica a disoluciones o
suspensiones. Actualmente está en desuso. Tiene poco poder de resolución.

 ELECTROFORESIS DE ZONA (CONVENCIONAL).- La muestra se desplaza sobre un soporte

sólido inerte que permite que las moléculas migren en discretas zonas o bandas. Para revelar las
proteínas separadas por electroforesis, el soporte se trata con colorantes (Violeta ácido, Azul
Coomassie, Negro amido).

Las bandas de proteínas adsorben el colorante mientras que las proteínas quedan teñidas con el
colorante. Se mide densitométricamente, integrando las áreas correspondientes a cada fracción
proteíca y calculando el porcentaje de cada fracción sobre el total de proteínas.

TIPOS DE SOPORTE.-

EN PAPEL.- En desuso.

ACETATO DE CELULOSA.- Ventajas: presenta poca adsorción, necesita cantidades

pequeñas de muestra, porosidad uniforme, transparente, sin contaminantes y resultados
precisos.

- Inconvenientes: débil resolución y electroosmosis. Se ha quedado obsoleta.

GEL DE AGAROSA.- Es un polisacarido, cuyas disoluciones poseen la propiedad de

permanecer liquidas por encima de 50º C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel
está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en
gran cantidad de medio líquido. El tamaño de poro no opone impedimento al paso de las
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moléculas (soporte no restrictivo tipo I). Se usa usualmente para separar moléculas
grandes.

- Ventajas: No presenta fenómenos de adsorción, pequeña cantidad de muestra, mejor

visualización y resolución.

- Inconvenientes: electroosmosis.

GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE).- Es un soporte empleado frecuentemente en

electroforesis, ya que es con el que mejor se logra separaciones electroforéticas. Es
químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida
y reproducible. Forma geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua,
relativamente no iónicos y que permite buena visualización de las bandas durante tiempo
prolongado.

- Tiene la ventaja que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de

manera controlada el tamaño del poro.

- El tamaño de poro opone resistencia al paso de las moléculas (soportes restrictivos tipo
II), ya que el tamaño del poro es similar al de las proteínas, de tal modo que existe un
efecto de tamizado molecular y la separación electroforética depende de la densidad de
carga de las moléculas y de su tamaño.

- Inconvenientes: Neurotoxicidad.

SDS-PAGE: Se fundamenta en eliminar las cargas de las proteínas por tratamiento con
SDS (sodiododecilsulfato) que las desnaturaliza y se fijan a el, tomando carga neta
negativa. La migración de los derivados proteína-SDS hacia el ánodo es inversamente
proporcional al logaritmo de su PM. La relación carga/masa es aproximadamente igual
para todas las proteínas de la muestra, por lo que el tamaño de esta es un factor
determinante de la separación.

- La electroforesis con SDS es un excelente método para identificar y monitorizar las

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proteínas durante un proceso de purificación y para la determinación del PM de las

diferentes subunidades proteícas.

La electroforesis convencional ha sido y continúa siendo de gran utilidad; sin embargo este tipo
de separación electroforética es lenta, laboriosa, poca reproducibilidad, difícil de automatizar, y
además no proporciona resultados cuantitativos precisos.

 ELECTROFORESIS CAPILAR (AUTOMATIZADO).- Constituye una alternativa electroforética de

creciente implantación en los laboratorios clínicos. La electroforesis capilar se realiza en
capilares hechos de sílice fundido. Los grupos silanol (SiO) cargados negativamente presentes
en este material dan origen a una carga negativa en la superficie del capilar y es responsable del
FEO. Es una de las técnicas más importantes y más utilizada debido a su simplicidad y elevado
poder de separación.

Los factores que causan la movilidad de los solutos son: La movilidad electroforética y El flujo
electroendosmótico (FEO).

Ventajas: Técnica automatizada, ofreciendo resultados reproducibles y precisos. Separa

cualquier tipo de tamaño: moléculas de alto y bajo PM (al contrario que la convencional, que
solo separa moléculas grandes). Utiliza volúmenes muy pequeños de muestra (0.1-10 nL),
mientras que la convencional, utiliza del orden de μL. No requiere el uso de colorantes, ya
que las proteínas se detectan directamente por espectrofotometría. Resolución muy elevada.
La velocidad de separación es mucho mayor que en la convencional.

Los componentes básicos son: Fuente de alimentación (alto voltaje), Capilar cubierto de
poliimida (10-50 cm), Dos recipientes para el tampón donde se acopla el capilar, Los dos
electrodos conectados a la fuente, Detector (espectrofotómetro).

4. FUNDAMENTO

La electroforesis consiste en la migración de partículas cargadas sometidas a la influencia de un

campo eléctrico, de tal forma que las moléculas con carga positiva migran al electrodo con carga
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negativa (cátodo) y las moléculas con carga negativa migran al electrodo con carga positiva (ánodo).
La velocidad de esta migración se encuentra influenciada por las características de la biomolécula
que migra (la carga que transporta), la intensidad del campo eléctrico y las características del medio
en la que tiene lugar la migración. Por lo tanto, la movilidad electroforética de una molécula es
directamente proporcional a la carga que presenta e inversamente proporcional a su tamaño y a la
viscosidad del medio en el que transcurre la electroforesis.

5. DESCRIPCION DE EQUIPOS.-

 ELECTROFORESIS DE ZONA.- La realización de una separación electroforética requiere:

FUENTE ELECTROFORÉTICA.- Genera el campo eléctrico. Son dispositivos que

proporcionan una corriente eléctrica estabilizada. Proporcionan corriente eléctrica de 0 – 150
mA y de 0 – 500 voltios, y permiten controlar tato el amperaje como el voltaje.

TAMPON O MEDIO DE ELECTROFORESIS.- Este debe encontrarse en contacto con los

electrodos (cátodo y ánodo) y debe bañar el sistema. Mantiene el pH del sistema constante,
lo que permite que los componentes de la mezcla de moléculas migren al cátodo o al ánodo
durante la separación dependiendo de su carga a dicho pH, estando también los iones de
dicho tampón sometidos a migración en el campo eléctrico.

SOPORTE.- Contiene las muestras, en el se realiza la separación propiamente dicha. Este

equipo consta de un recipiente o cubeta en el que se introducen el medio de soporte de las
muestras en el que se producirá la separación electroforética.

6. REACTIVOS UTILIZADOS PÀRA LA DETECCION Y/O CUANTIFICACION DE BIOMOLECULAS

BIOMOLECULA REACTIVO

PROTEINAS Negro amido

Azul de bromofenol

Azul Coomassie G-250

Ponceau S

Nitrato de plata
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GLUCOPROTEINAS Ácido periódico

Negro sudán
LIPOPROTEINAS
Oil red

Bromuro de etidio
ACIDOS NUCLEICOS
Azul de metileno

POLISACARIDOS Yodo

7. APLICACIONES EN EL LABORATORIO

En el laboratorio clínico, la aplicación mas importante de la electroforesis consiste en separar las

proteínas presentes en el suero, orina y otros fluidos biológicos (LCR, líquido sinovial).

En clínica el suero es la muestra de elección. Se puede usar plasma pero, en ese caso se observará
una banda adicional de fibrinógeno. También se puede analizar orina y líquido cefalorraquídeo si se
aumenta su contenido proteico (hasta 20 - 30 g/l) por ultracentrifugación, diálisis u otras técnicas de
concentración.

 ANALITOS (PROTEINAS) BASICOS RESPONSABLES DE LA FORMACION DE LAS BANDAS

DE LA ELECTROFORESIS DE PROTEINAS (PROTEINOGRAMA).-

ANALITO DISMINUCION AUMENTO

PRE-ALBÚMINA Desnutrición Reaccion inflamatorias.

Hepatopatías, Infección crónica,

ALBUMINA (Alfa-1, Alfa-2, Neoplasias, Nefropatía, Hemorragia,
Deshidratacion, Reaccion inflamatoria.
Beta-1, Beta-2) Inanición, Desnutrición, Enfisema
pulmonar.

Proceso hemolítico agudo, Anemia

ALFA-LIPOPROTEINAS Proceso inflamatorio agudo o crônico, Condiciones
megaloblástica, Daño hepático severo
(HDL) neoplásicas, Infarto al miocárdio, Síndrome nefrótico.
(Cirrosis, Hepatitis, Tumor hepático)

Desnutricion, Sindrome de menkes,

CERULOPLASMINA AR, Leucemia, S. de Hodgkin.
Enfermedad de wilson.

Hemólisis intravascular severa, Lesion

Se asocia con un mal pronóstico después de una
HEMOPEXINA isquêmica cerabral, Encefalomielitis
hemorragia subaracnoidea.
autoinmune.
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PRÉ-BETA Hipercolesterolemia, Riesgo cardiovascular, Diabetes

Abetalipoproteinemia
LIPOPROTEÍNAS (VLDL) mellitus tipo 2, Síndrome nefrótico.

Hipofibrinolisis, Trombosis, Enfermedad

PLASMINÓGENO hepática, Sepsis, Fiebre hemorrágica, Hiperfibrinólisis, Cuadros hemorrágicos, Aterosclerosis.
Coagulopatía intravascular diseminada.

Hepatopatias crónicas, Enfermedades autoinmunes

Enfermedad de Hodgkin, Leucemia
INMUNOGLOBULINAS (IgA, (Lupus, AR, S. de sjogren, Esclerodermia), Infecciones
granulocítica crónica, Mieloma múltiple,
IgG, IgM, IgD, IgE) crónicas (TB, Lepra, Paludismo, Linfogranuloma
Macroglobulinemia de waldenstrom.
venéreo).

Ateroesclerosis y otras enfermedades cardiacas,

BETA-LIPOPROTEINAS
Enfermedad cardiovascular, Hipercolesterolemia,
(LDL)
Hipertrigliceridemia, síndrome de resistencia insulínica.

Enfermedad hepática, Nefrosis, Anemia

TRANSFERRINA crônica, Neoplasias, Procesos Mujeres lactantes para compensar el déficit de hierro.
infecciosos.

COMPLEMENTO (C3, C4) Lupus, A.R. Bence Jones.

Anemia megaloblástica, Enfermedad

HAPTOGLOBINA severa hepática, Hemocromatosis, Síndrome nefrótico.
Anormalidades genéticas.

Enfermedades inflamatorias, Enfermedades del tracto

Enfermedades hepáticas, Enfermedades gastrointestinal, Daño tisular ((tumores malignos, infarto
OROSOMUCOIDE
que conllevan una pérdida de proteínas. de miocardio, trauma, cirugía), Enfermedades
reumáticas, Enfermedad de Crohn.

Daño hepático (cirrosis), EPOC, Enfisema

ALFA-ANTITRIPSINA Procesos inflamatorios agudos.
hereditario.

 PARAMETROS DE REFERENCIA DE LOS COMPONENTES DE LA ELECTROFORESIS.-

CONCENTRACION
COMPONENTES CONCENTRACION (%)
(g/dl)
PROTEINAS TOTALES 6.0 – 8.0 100.0

PRE-ALBUMINA 0.016 – 0.040 16.0 – 40.0 mg/dl

ALBUMINA 3.2 – 5.2 52 – 65

GLOBULINAS ALFA-1 0.1 – 0.3 2–5

GLOBULINAS ALFA-2 0.4 – 1.0 7 – 13

GLOBULINAS BETA 0.5 – 1.1 8 – 14

GLOBULINAS GAMA 0.8 – 1.8 12 – 23

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8. CUIDADOS QUE SE DEBE TENER (PARÁMETROS QUE AFECTAN LA ELECTROFORESIS)

 EXTERNOS:

Campo eléctrico.

Temperatura: Aumento de la Tª descenso η aumento μ.

Longitud del capilar: Interesa que sean cortos (10-50 cm) para obtener tiempos breves de
análisis.

 SOLVENTE:

Constante dieléctrica (ε): Aumento ε aumento μ.

Viscosidad (η): Descenso η aumento μ (por disminuir la resistencia por fricción).

Fuerza iónica (FI): Aumento FI descenso μ (intensidad de carga alrededor del Ion central).

pH: Da el grado de ionización de la partícula.

 SUSTANCIA PROBLEMA:

Carga de la partícula: Influenciado por el solvente (por el pH).

Forma y tamaño: aumento de tamaño, disminución de movilidad.

También es muy importante tener en cuenta que cada fracción está formada por un conjunto de
proteínas con una movilidad electroforética semejante aunque muy distintas en cuanto a su
estructura y función. Además, excepto la albúmina, el resto de las fracciones corresponden a grupos
de proteínas, por ello, aunque el resultado de la fracción sea normal, puede existir variación
porcentual en sus componentes. Conviene corroborar los resultados del proteinograma con ensayos
inmunológicos más específicos como la inmunodifusión radial o la inmunoelectroforesis.

 INMUNOELECTROFORESIS.- Es una inmunodifusión en la que se aplica una corriente eléctrica

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para separar las proteínas de la muestra. Esta técnica se realiza en dos fases:

• Electroforesis para separar las proteínas de la muestra en función de su carga.

• Aplicación de un antisuero, mono o poliespecífico, en un surco paralelo a la dirección del

campo eléctrico. El o los anticuerpos difunden durante 18-24h. Si se produce el reconocimiento
Ag-Ac se forman bandas de precipitación.

Se utiliza fundamentalmente para analizar, cualitativamente, alteraciones de distintas proteínas,

especialmente inmunoglobulinas en suero, orina o líquido cefalorraquídeo.

 INMUNODIFUSION RADIAL.- Es una técnica cuantitativa, s e basa en la formación de bandas

de precipitación Ag-Ac en medios semisólidos (generalmente de agarosa). La formación de
inmunocomplejos se ve afectada por variables como: pH, temperatura, fuerza iónica del
medio, características propias del Ac como afinidad y avidez y, la más importante, la
concentración relativa de Ag y Ac. La zona óptima de concentración para la formación del
precipitado Ag-Ac se llama zona de equivalencia. se añade un antisuero específico a la
agarosa que, a su vez, se vierte sobre placas. Se forman pozos en el gel y se colocan en
ellos estándares de proteínas y problemas (antígenos). El antígeno difunde en el gel durante
varias horas y va reaccionando con el Ac. En la zona de equivalencia se produce un anillo de
precipitación. Para visualizar el resultado de la inmunodifusión, una vez terminada la difusión
se lava el gel y se tiñe con colorantes para proteínas (ej. negro amido o azul brillante de
Coomassie).

9. BIBLIOGRAFIA

http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0212-16112006000500002

http://www.ehu.eus/biofisica/juanma/mbb/pdf/bqtym.pdf
http://www4.ujaen.es/~esiles/TEMA3PROTEINASalumno.pdf
http://www.hgucr.es/wp-content/uploads/2011/12/tecnicas_de_separaci%C3%B3n_prote
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%C3%ADca.pdf
https://es.slideshare.net/cbejarl/estudio-de-proteinas-sericas