Western blot

Grupo No 2
 Historia

• Desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la

Universidad de Stanford
• El nombre (Western, occidental en inglés) le fue dado por
W. Neal Burnette
• 1995, aparición de la técnica gracias a la aparición de las
membranas.
• Edwin Southern; nitrocelulosa capaz de capturar ácidos
nucleicos separados previamente por electrofore
• Más tarde, Towbin (1979) y Burnette (1981) demostraron
que también era capaz de unirse a proteínassis.
• Esta técnica es hoy en día imprescindible en
varios campos de la biología, como la biología
molecular, la bioquímica, la biotecnología o la
inmunología.
• Existe toda una industria especializada en la venta
de anticuerpos (monoclonales y policlonales)
contra decenas de miles de proteínas diferentes.
¿Que es western blot?
• Técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra
determinada.
• Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio
que se desee:
peso molecular
estructura
hidrofobicidad
Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son
transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF)
para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella.
Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática,
fluorescencia
De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su
cantidad relativa respecto a otras proteínas.
Optiblot

• Ventajas
– Fáciles de usar
– Pocillos con alta capacidad
– 10 veces mas fuertes que los geles
convencionales
– Larga duración (1-2 años de caducidad
– Compatibles con la mayoría de tanques
Anticuerpos monoclonales
de conejo

• Ventajas
– Alta afinidad: mayor factor de dilución
hasta 1:500000
– Alta especificidad: señal especifica
– Reconoce epitopos diversos: para la
detección de modificaciones post-
traduccionales
Claudet

• Detecta proteínas especificas en una

muestra determinada mediante la
electroforesis en gel que separan las
proteínas,
• COMO FUNCIONA ?
• Las proteínas de la muestra se
separan mediante electroforesis en
gel en función de su peso molecular
Electroforesis

• Las muestras de ADN se cargan en pozos

(ranuras) en un extremo de un gel y se
aplica una corriente eléctrica para
arrastrarlas a través del gel.
• Los fragmentos tienen carga negativa, por
lo que se mueven hacia el electrodo
positivo. Puesto que todos los fragmentos
de ADN tienen la misma cantidad de
carga por masa, los fragmentos pequeños
atraviesan el gel más rápido que los
grandes.
• Cuando un gel se tiñe con un pigmento
que se une al ADN, los fragmentos de
ADN pueden verse como bandas, las
cuales representan un grupo de
fragmentos de ADN del mismo tamaño.
• La transferencia se puede llevar a
cabo en dos tipos y por lo tanto en
dos formas diferentes
• Transferencia húmeda
• Transferencia simiesca
En que casos es útil utilizar
WESTERN BLOT

• Si la proteína esta • se utiliza para

presente en mi muestra diagnosticar
• Como varia el nivel de enfermedades
expresión de la proteína
infecciosas, más
en distintos tejidos o
líneas c frecuentemente
• Si mi muestra es sana o
famoso, el VIH,
patógena celulares LYME….
Protocolo de western BLOT

• Paso 1 : preparación de la muestra

• Paso 2 electroforesis en gel
• Paso 3 transferencia de gel a
membrana
• Paso 4 inmunodeteccion
• Controles recomendados en WB
• Selección de AC
Jasón

Lisis

• Mantener las muestras en hielo o a 4oC

• Los tampones deben prepararse en el momento y mantenerse en
frío.
• Si la proteína de interés está fosforilada
• Elegir un tampón de lisis adecuado en función de la localización
celular de la proteína de interés
• Localización de proteína tampón de lisis recomendado
• Celula entera NP-40
• Citoplasmatica soluble tris-HCL
• Membranal NP-40
Preparación de las muestras
para la electroforesis
• Lisis
• • Células: mantenerlas en hielo, lavar con PBS frío y añadir el
tampón de lisis Después agitar durante 30 minutos a 4 oC
• • Tejido: diseccionar rápidamente el tejido y mantenerlo en hielo.
Congelar inmediatamente en nitrógeno líquido y homogeneizar en
tampón de lisis Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x
300 μl de tampón, y agitar después durante 2 horas a 4 oC
• • Centrifugar a 4 oC durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y
mantenerlo en hielo
• Determinar la concentración de proteínas
• Condiciones reductoras y desnaturalizantes: las muestras son
normalmente tratadas con agentes que rompen las estructuras
tridimensionales de las proteínas
• • Añadir el tampón de carga a la muestra y calentar 5 minutos a
95-100oC o durante 5-10 minutos a 70oC
Condiciones reductoras y
desnaturalizantes

• Un tampón de carga estándar contiene SDS (dodecilsulfato sódico) y

β- mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol)
• • El SDS desnaturaliza la proteína en su estructura primaria y la
recubre de cargas negativas
• • El β-mercaptoetanol y el DTT son agentes reductores que rompen
los puentes disulfuro
• • Todo ello permite que las proteínas se separen en función del peso
molecular mediante SDS-PAGE
• • La reducción y desnaturalización permiten además la accesibilidad
del anticuerpo a su sitio de unión
Protocolo de Western Blot

• Paso 1: Preparación de la muestra

• Paso 2: Electroforesis en gel
• Paso 3: Transferencia gel -
membrana Paso 4: Inmunodetección
Controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
• Problemas técnicos y optimización.
Ejemplos.
• Enlaces a otros productos de interés
SDS-PAGE
Como funciona
• Se aplica un campo eléctrico que provoca el movimiento de las
proteínas hacia el polo positivo
• • El gel de poliacrilamida se coloca en un compartimento que
contiene el tampón de migración. Un tampón de migración suele
contener 25mM Tris; 190mM glicina; 0,1% SDS; pH 8,3
• • Los lisados proteicos se cargan en las calles del gel,
normalmente entre 20 y 40 μg por calle
• • Al haberse tratado las proteínas con SDS las cargas endógenas
de las mismas son despreciables
• • El resultado es que las proteínas se separan en función de su
talla, o peso molecular
• • Las proteínas de menor tamaño quedan menos retenidas en la
matriz del gel y por tanto migran mas rápidamente
 geles

• Constituidos de poliacrilamida, N, N-
metilenbisacrilamida persulfato de amonio y
TEMED
• La estructura del gel puede modificarse
alterando la proporción de acrilamida
• Para proteínas pequeñas, se usa un gel con un
porcentaje elevado de acrilamida, y viceversa
para proteínas de gran tamaño
• Los geles en gradiente se recomiendan en
aquellos casos en los que el tamaño de la
proteína es desconocida
Objetivo de la
transferencia
• Una vez realizada la electroforesis, es necesario
marcar la proteína de interés Para poder visualizarla

• El gel no es una superficie adecuada para poder

marcar las proteínas
• Los anticuerpos no son retenidos en el gel
• Los geles son frágiles y difíciles de manipular
• Por tanto, es necesario transferir las proteínas a un
soporte más adecuado
¿Cómo funciona la
transferencia?
• las proteínas cargadas negativamente migran hacia el polo
positivo bajo el efecto de campo eléctrico.
• se intercala una membrana entre el gel y el electrodo
positivo
• Las proteínas se adhieren a la membrana siguiendo la misma
disposición que en el gel
• Las membranas pueden ser de nitrocelulosa o polifluoruro
de vinilideno (PVDF).
• Estas últimas requieren un pretratamiento con metanol
¿Transferencia en medio
húmedo o semi seco?
Medio húmedo
El gel y la membrana se intercalan y fijan
firmemente entre finas esponjas y papel Absorbente
• Adecuado para proteínas grandes o difíciles de
transferir .
INCONVENIENTE
El proceso de transferencia es mas largo
Semi seca

• Más rápido
INCONVENIENTES
• La membrana puede secarse
afectando a la transferencia de las
proteínas
Transferencia de proteínas >100 kDa

• transferencia en medio húmedo durante la noche a

4 ºC y bajo voltaje
• Añadir 0.1% SDS al tampón de transferencia para
reducir la formación de conglomerados en el gel
• Reducir la cantidad de metanol en el tampón de
transferencia a 10% o incluso menos para evitar la
dispersión de proteínas en el gel
• Si la membrana es de PVDF, el metanol puede
retirarse
• completamente del tampón (sigue siendo
necesario sin embargo su pre-tratamiento con
metanol)
Protocolo de Western Blot

• paso 1: Preparación de la muestra

• Paso 2: Electroforesis en gel
• Paso 3: Transferencia gel – membrana en gel

• Paso 4: Inmunodetección

controles recomendados en WB
Selección de anticuerpos
Problemas técnicos y optimización.
Ejemplos.
Enlaces a otros productos de interés
¿Por qué se utilizan
anticuerpos?

el uso de anticuerpos específicos

soluciona el problema detectando
únicamente la proteína de interés
2
6

Inmunodetección
Bloqueo de la
membrana Leche, BSA, etc…

Epítopo

Incubación con el Proteína Proteína

anticuerpo primario Anticuerpo

Lavado (TBST)

Incubación con
anticuerpo secundario Proteína Proteína
Anticuerpo
conjugado

Lavado (TBST)

Detección
Proteína
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7

Detección
Sustrato (peróxido de hidrógeno + luminol)

Producto (sensible a la luz)

•Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo secundario

conjugado a la enzima HRP, produciendo una señal que se captura en una película
fotográfica

•Los sustratos cromogénicos (4-cloronaftol o DAB) también pueden utilizarse con las enzimas
HRP o AP, dando lugar a un producto coloreado que se deposita en la membrana próximo a la
zona del anticuerpo

•Los anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforos también pueden usarse

siempre y cuando se disponga de un equipo de detección especial

ECL : Enhanced chemiluminescence DAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride

HRP : HorseRadish Peroxidase AP : Alkaline Phosphatase
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8

Protocolo de
Western Blot
Paso 1: Preparación de la muestra

Paso 2: Electroforesis en gel

Paso 3: Transferencia gel - membrana

Paso 4: Inmunodetección

Controles recomendados en WB

Selección de anticuerpos

Problemas técnicos y
optimización. Ejemplos.

Enlaces a otros productos de interés

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9

Controles de carga
Los controles de carga son anticuerpos usados para asegurar que la carga de proteínas en cada calle del gel de SDS
PAGE es constante

Un anticuerpo control de carga detecta una proteína altamente conservada y presente en cantidades similares
independientemente del tipo de muestra

Tipo de Peso molecular

Control de carga muestr (KDa) Precauciones
a

β Actina Célula entera / 42 No es válido para muestras del musculo esquelético. Cambios en las
Citoplasma condiciones de crecimiento celular e interacciones con los
componentes de la matriz extracelular pueden alterar la síntesis de la
proteína actina (Farmer et al, 1983)

GAPDH Célula entera / 30-40 Algunos factores fisiológicos, como hipoxia o diabetes, aumentan el
Citoplasma nivel de expresión de GAPDH en determinados tipos celulares
Tubulina Célula entera / 55 La expresión de tubulina puede variar con la resistencia a
Citoplasma sustancias antimicrobianas y antimitóticas (Sangrajrang S. et al,
1998, Prasad V et al, 2000)

VDCA1/Porinas Mitocondria 31
COXIV Mitocondria 16 Muchas proteínas migran al mismo peso molecular (16KDa) que
COXIV
Lamin B1 Núcleo 66 No es válido para muestras en las que se ha eliminado la
membrana nuclear
Proteína de unión Núcleo 38 No es válido para muestras sin ADN
a TATA (TBP)
3
0

Controles
de carga
Nota: la afinidad del anticuerpo puede variar según la especie o naturaleza de la proteína (nativa o
recombinante), etc…

Todas las calles - anticuerpo anti - Actina – control de

carga (ab8227) diluído 1/1000
Calle 1: Células HeLa (humano) a 20 µg

Calle 2: Células 3T3 (ratón) a 20 µg

Calle 3: Hígado de pescado a 20 µg

Calle 4: Hígado de conejo a 20 µg

Calle 5: Células MDCK (perro) a 20 µg

Calle 6: Células EBTr (bovino) a 20 µg

Calle 7: Células SL-29 (pollo) a 20 µg

Calle 8: Células CHO (Hamster chino) a 20 µg

Embrión de Xenopus a 20 µg
Calle 9:
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1

Controles positivos y negativos

Realizar en paralelo el ensayo de muestras desconocidas con muestras

en las que se ha comprobado el nivel de expresión de la proteína de
interés
• Proteína recombinante
• Células transfectadas con la proteína de interés
• Tejidos o líneas celulares que expresen la proteína
Incluir también una muestra que no exprese la proteína a detectar
• Muestras knockout o siRNA
• Tejidos o líneas celulares que no expresen la proteína
3
2

Péptidos de bloqueo
La pre-incubación del anticuerpo primario con el péptido inmunógeno permite bloquear de
manera específica los sitios de unión del anticuerpo

Las bandas específicas no serán visibles en el blot ya que el anticuerpo pre-incubado no

puede unirse a la proteína en la membrana

Útil para determinar si las bandas observadas corresponden a isoformas, fragmentos de la

proteína o proteínas no específicas

Todas las calles:

Anti-Histona H3 (fosfoS10) [mAbcam 14955] - ChIP Grade (ab14955) a 1 µg/ml

Calle 1: Preparado de Histona, células HeLa

Calle 2: Preparado de Histona de células HeLa tratadas con colcemida

Calle 3: Preparación de histona de células HeLa 0,5µg con péptido de bloqueo

Histona H3 – fosfo S10, trimetil K9 (ab15644) a 1 µg/ml

Calle 4: Preparación de histona de células HeLa tratadas con colcemida 0,5µg

con péptido de bloqueo Histona H3 – fosfo S10, tri metil K9 (ab15644) a 1 µg/ml
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3

Protocolo de
Western Blot
Paso 1: Preparación de la muestra

Paso 2: Electroforesis en gel

Paso 3: Transferencia gel - membrana

Paso 4: Inmunodetección

Controles recomendados en WB

Selección de anticuerpos

Problemas técnicos y
optimización. Ejemplos.

Enlaces a otros productos de interés

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4

Adecuado para
Western Blot
Utilizar anticuerpos que hayan sido previamente testados en Western Blot

Las aplicaciones en las que un anticuerpo ha sido testado se indican en la

ficha técnica del anticuerpo
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5

Inmunógeno y
especificidad
Inmunógeno: proteína específica o secuencia de amino ácidos que se inyecta en un animal
para provocarle una respuesta inmunitaria y producir anticuerpos específicos contra ella

La selección del inmunógeno permite producir un anticuerpo que reconozca y se fije sobre
una región específica de la proteína (epítopo)

Asegurarse que la secuencia del inmunógeno está presente en la proteína de interés

cuando se esté estudiando una isoforma concreta de la proteína, la forma madura o un
precursor de la misma – si no, el anticuerpo no reconocerá la proteína

NERTCRCDKP

NERTCRCDKP
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6

Protocolo de
Western Blot
Paso 1: Preparación de la muestra

Paso 2: Electroforesis en gel

Paso 3: Transferencia gel - membrana

Paso 4: Inmunodetección

Controles recomendados en WB

Selección de anticuerpos

Problemas técnicos y optimización.

Ejemplos.

Enlaces a otros productos de interés

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7
Ausencia de bandas, o bandas
muy débiles
Origen del problema
Incompatibilidad con el anticuerpo
secundario
No hay suficiente proteína o
anticuerpo para producir una señal
Tiempo de incubación insuficiente
para producir una señal
La membrana no se ha bloqueado
correctamente
La proteína no se ha transferido
correctamente del gel a la
membrana
Las proteínas hidrófobas son más
difíciles de transferir
La muestra no expresa la proteína
de interés
El anticuerpo no reconoce
la proteína de interés
Solución
Seleccionar un anticuerpo secundario que sea
compatible con la especie y el isotipo del anticuerpo
primario (ej. Anticuerpo secundario anti-IgM de ratón
con anticuerpo primario IgM hecho en ratón)
Aumentar la cantidad de lisado, de anticuerpo
primario o de anticuerpo secundario (incluso una
combinación de los tres)
Incubar la membrana con el anticuerpo primario
durante la noche a 4ºC
Bloquear durante menos tiempo o usando un agente
de bloqueo diferente. La adición de Tween 20 al
tampón de bloqueo reduce la fijación del anticuerpo
al agente de bloqueo
Comprobar que se ha producido la transferencia
usando un colorante como rojo de Ponceau. Es
posible que sea necesario aumentar o disminuir el
tiempo de transferencia
Para este tipo de proteínas usar membranas de
PVDF
Revisar literatura y bases de datos sobre la proteína
de interés
Verificar que la secuencia del inmunógeno está
presente en la proteína a estudiar
3
8

Ruido de fondo
Origen del problema Solución

Exceso de lisado celular, anticuerpo Reducir la carga de proteína en el gel y/o diluir más
primario o secundario que provocan los anticuerpos
uniones no específicas

Temperatura de incubación del Incubar durante la noche a 4ºC

anticuerpo primario muy elevada

La membrana no se ha bloqueado Aumentar el tiempo de lavado, y añadir un

correctamente detergente, como Tween 20, al tampón de lavado.
Probar otro agente de bloqueo

Uso de una membrana Las membranas de nitrocelulosa suelen dar menos

no adecuada ruido de fondo que las membranas de PVDF

Degradación de la proteína Optimizar la preparación de la muestra. Mantener

las muestras en hielo y añadir una solución recién
preparada de inhibidores de proteasas.
Almacenamiento de muestras a largo plazo puede
dañar las proteínas

Presencia de isoformas o Consultar la literatura y SwissProt

fragmentos de la proteína de interés

Presencia de polímeros Hervir las muestras durante 10 minutos antes de

realizar la electroforesis
Exceso de proteínas y/o
anticuerpos

• 1. demasiadas proteinas por carril

– Hacer diluciones seriadas del material
de partida
2. Exceso de proteinas en el gel
reducir la carga de proteinas
Cuando no hay suficiente cantidad de
proteinas
Aumentar la cantidad de carga en el gel
Utilizar inhibidores de proteasas
Optimizacion del buffer del
bloqueo

• rellena los espacios que no han sido

ocupados por las proteinas o los
anticuerpos inmovilizados en la fase
solida y con la funcion de prevenir
uniones no especificas de los
anticuerpos y evitar asi falsos
positivos y/o problemas de ruidos de
fondo
Burbujas de aire, lavados insuficientes,
transferencia incompleta

• Burbuja de aire atrapadas en la membrana

– Eliminar la burbuja principalmente durante la
trasferencia.
. Lavado insuficiente:
incrementar el numero de lavados y el
volumen de buffer.
• Transferencia incompleta de las proteinas
a la membrana
– Asegurar el correcto contacto entre la
membrana y el gel durante la trasferencia.
– Humedecer la membrana según las
instrucciones.
– Evitar el sobre calentamiento durante la
trasferencia.
– Utilizar controles positivos o marcadores de
peso molecular.
Proteinas en estado nativo
• Algunos anticuerpos presentan mayor
afinidad por las estructuras nativas de
las proteínas que por las formas
desnaturalizadas (son aquellas
proteinas que han perdido su
estructura)
• Efectos:
• Cambios en la propiedad hidrodinamica
• Disminucion de su solubilidad
• Perdida de las propiedades biologicas.
• Las proteínas no siempre muestran
una única banda al peso molecular
esperado Posibles motivos:
fragmentación de la proteína,
modificaciones post-traduccionales,
expresión de isoformas, propiedades
isoeléctricas
Protocolo de Western Blot
• Paso 1: Preparación de la muestra
• Paso 2: Electroforesis en gel
• Paso 3: Transferencia gel –
membrana
• Paso 4: Inmunodetección
Gracias