Western blot

El Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, es una técnica analítica usada en

biología celular y molecular para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de
proteínas, tal como la que se presenta en extractos celulares o de tejidos. La técnica utiliza tres
etapas para lograr esto: separación por tamaño, transferencia a un soporte sólido y, finalmente,
visualización mediante la marcación de proteínas con el uso de anticuerpos primarios o
secundarios apropiados.1 ​

Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología, como la biología
molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología.

Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: Resultado del Western blot: una
peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de membrana con las proteínas
electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de separadas en la electroforesis
unidas, de las que sólo se
nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos
disciernen aquellas contra las se ha
contra ella. Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática o
añadido un anticuerpo.
fluorescencia, entre otros métodos. De esta misma forma se puede estudiar la presencia de la
proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a las otras proteínas.2 3​ ​

La técnica «Western blot» fue desarrollada en la Universidad de Stanford. El nombre (Western, occidental en inglés) le fue dado
por W. Neal Burnette, y consiste en un juego de palabras con una técnica análoga pero que usa ADN, el Southern (sureño en inglés)
blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras técnicas que fueron nombradas siguiendo este
criterio son el Northern (norteño en inglés) (en el que se separa e identifica ARN), el Eastern (oriental en inglés) blot y el
Southwestern (del suroeste en inglés) blot.2 4​ ​

Índice
Pasos del Western blot
Preparación de la muestra
Electroforesis en gel
Transferencia
Difusión simple
Transferencia al vacío
Electrotransferencia
Bloqueo
Detección
Método en dos pasos
Anticuerpo primario
Anticuerpo secundario
Radiactividad
Anticuerpo unido a una enzima
Marcaje fluorescente
Sistema avidina/estreptavidina
Detección con oro
Método en un paso
Análisis
Detección colorimétrica
Detección quimioluminiscente
Detección radioactiva
Detección fluorescente
Exploraciones secundarias
Aplicaciones
Investigación
Diagnóstico
Protocolos
Véase también
Referencias
Enlaces externos
Pasos del Western blot

Preparación de la muestra

Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:

Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un tampón de extracción. Después se procede a homogeneizarlos, sea
con una licuadora (para grandes volúmenes de muestra), con un homogenizador (para muestras pequeñas) o por
sonicación. Por último se centrifuga para obtener las proteínas en el sobrenadante, la fracción no precipitada.5 ​
Las células pueden lisarse por uno de esos métodos mecánicos. También pueden usarse detergentes, sales o tampones
que favorezcan la lisis y solubilicen las proteínas. Este proceso debe realizarse a baja temperatura (~4 °C) para evitar la
desnaturalización proteica y con la adición de inhibidores de proteasas y fosfatasas para evitar la digestión de las
proteínas y de las fosfoproteínas por las enzimas celulares. Para separar proteínas de compartimentos y orgánulos
celulares es preciso combinar técnicas mecánicas - como filtraciones y centrifugaciones - y bioquímicas.1 6​ ​

Electroforesis en gel

Las proteínas de la muestra serán separadas mediante una electroforesis en gel en función de uno o varios (en las electroforesis
bidimensionales) de estos criterios: punto isoeléctrico, peso molecular y carga eléctrica. La naturaleza de la separación depende del
tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.

La electroforesis en gel más frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de poliacrilamida y de tampón con dodecilsulfato
(SDS). En esta técnica las proteínas sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la pérdida de las estructuras
secundaria y terciaria y mantiene los polipéptidos en este estado desnaturalizado. De este modo, la estructura tridimensional de las
proteínas no influye en la electroforesis, y pueden separarse únicamente en función del tamaño.

Transferencia

Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una
membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusión, por vacío o por acción de un campo
eléctrico (electrotransferencia).

Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de unir proteínas de forma inespecífica (es
decir, se adhieren a todas las proteínas con idéntica afinidad):

las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las interacciones membrana - proteína,
se sabe con cierta seguridad que se trata de interacciones no covalentes de naturaleza hidrófoba.
en las membranas de PVDF, la unión está basada en interacciones hidrofóbicas y de dipolos entre la membrana y las
proteínas. Como particularidad, deben ser humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos,
debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.
Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que las de PVDF, aunque son también más frágiles, tienden a tornarse
quebradizas cuando se secan y no pueden ser sometidas a varias pruebas consecutivas.7 ​

También pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel activado. Sin embargo, no son tan usados como los
anteriores.

Difusión simple

En la transferencia por difusión simple se ponen en contacto las superficies del gel electroforético y de la membrana y, sobre ésta,
se dispone un taco de papeles de filtro. Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto
pesado. Este montaje se coloca sobre un tampón, que ascenderá por capilaridad hacia el papel de filtro arrastrando consigo las
proteínas. Al llegar a la membrana, quedarán retenidas en ella.

Este protocolo no está muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de proteína transferida a la membrana es muy baja,
mucho menor que con la electrotransferencia. Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una modificación que permite
obtener múltiples transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar varias pruebas sobre geles virtualmente
idénticos. Esta modificación es viable cuando no es necesaria una transferencia cuantitativa de proteína.8 7​ ​

Transferencia al vacío

En esta técnica, se añade el poder de succión de una bomba conectada a un sistema de secado de planchas de gel, el cual lleva las
proteínas desde el gel hasta la superficie de la membrana de nitrocelulosa. Este método es válido tanto para proteínas de alto como
de bajo peso molecular.9 7​ ​

Electrotransferencia

Este método se basa en una corriente eléctrica y un tampón de transferencia para llevar las proteínas desde el gel hacia la
membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o ánodo al positivo o cátodo):
esponja, varios papeles de filtro empapados en tampón de transferencia, gel, membrana, más papeles de filtro empapados y otra
esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, se dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente
eléctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible,... Las proteínas del gel se desplazan hacia el polo
positivo y quedan atrapadas por la membrana.3 ​

Tras la transferencia, se suele proceder a la tinción del gel con Azul de Coomassie (un colorante de proteínas) para comprobar que
en efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la membrana.

La electrotransferencia es hoy en día la técnica de transferencia más usada gracias a la velocidad del proceso y al elevado porcentaje
de proteína que se transfiere (especialmente en comparación con las otras técnicas).

Bloqueo

Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse a las proteínas de forma inespecífica, es preciso bloquear los lugares de
unión que han quedado libres tras la transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la
detección puede unirse a ellos, dificultando la distinción del complejo antígeno-anticuerpo que se forma con la proteína que se
busca.

En el bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas, típicamente de albúmina de suero bovino o ASB (más
conocida por sus siglas en inglés, BSA), leche en polvo o caseína, con una diminuta fracción de detergente, como Tween 20 o Tritón
X-100. Las proteínas en solución se unirán a todos aquellos lugares de unión de la membrana que no estén ya ocupados por las
transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo sólo podrá unirse a su antígeno específico, reduciendo así el ruido de fondo y
los falsos positivos.

Detección
En la detección se comprueba la presencia en la membrana de una determinada proteína. Para ello se emplea un anticuerpo
específico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reacción colorimétrica (produce color). De esta
forma, se hace patente la unión con el antígeno, la proteína, así como su localización.

El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la detección en un único paso, lo cual es útil en
ciertos campos.

Método en dos pasos

Los dos pasos de los que consta este método de detección son la unión del anticuerpo primario y la del anticuerpo secundario.

Anticuerpo primario

El primer paso es permitir la unión de un anticuerpo primario contra la proteína buscada. Este se consigue inoculando dicha
proteína o uno de sus epítopos (regiones capaces de desencadenar la respuesta inmune) a un animal (como un conejo o una cabra)
o a un cultivo celular. Además, como la proteína se ha desnaturalizado durante la electroforesis en gel, es preciso que el anticuerpo
reconozca específicamente la proteína desnaturalizada. La presencia del elemento extraño debería desencadenar una respuesta
inmune cuyo resultado incluya la producción del anticuerpo, primario en este caso, ya que reconoce la proteína.

Así pues, tras el bloqueo se incuba en agitación moderada la membrana con una disolución de anticuerpo primario (0,5 - 5 μg/ml).
La disolución consiste en un tampón salino, con cloruro de sodio por lo general, con un pH cercano a la neutralidad, una pequeña
fracción de detergente y, en ocasiones, proteínas disueltas, como ASB o leche en polvo. La membrana junto con la disolución
pueden ser introducidas en una pequeña bolsa de plástico. Esta incubación puede durar desde 30 minutos a una noche entera. La
temperatura a la que puede tener lugar es igualmente variada; en general, las elevadas temperaturas favorecen las uniones más
específicas.[cita requerida]

Anticuerpo secundario

Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se expone al anticuerpo secundario. Este reconoce
de forma específica una región concreta del anticuerpo primario. Suelen estar marcados para ser detectables (unión a biotina, a una
enzima reporter como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa del rábano (HRP), etc.). Varios de estos anticuerpos se unirán a cada
anticuerpo primario, amplificando la señal.

Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas de origen animal. Por ejemplo, un anticuerpo
secundario "anti-ratón" es aquel capaz de reconocer casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones. Igualmente hay
anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo"... Su uso presenta ciertas ventajas: económicas, por permitir a un laboratorio compartir una
única fuente de anticuerpos secundarios; y dan resultados mucho más consistentes.

También pueden emplearse proteínas no anticuerpos, como las proteínas A y G.

Radiactividad

Es una alternativa al uso de anticuerpos secundarios que consiste en proteínas de unión a anticuerpos marcadas radiactivamente.
Esta proteína puede ser, por ejemplo, la proteína A de Staphylococcus aureus4 ​ o la proteína G10 ​ marcadas con 125I (un isótopo
radiactivo de yodo). Las proteínas mencionadas tienen la capacidad de unirse a anticuerpos de forma inespecífica, por lo que se
unirán al primario.

Este método apenas se usa actualmente, por ser significativamente más caro, peligroso y lento que los otros. Sin embargo, presenta
ventajas: es muy sensible, da bandas que permiten una precisa cuantificación; y la imagen autoradiográfica puede ser reproducida
fácilmente y con gran precisión para su publicación.7 ​

Anticuerpo unido a una enzima

Un mecanismo de detección simple y rápido consiste en unir al anticuerpo
secundario enzimas que catalicen la transformación de un sustrato soluble en un
producto insoluble. De esta forma, en el posterior análisis quedará una mancha allí
donde esté la proteína de interés. Enzimas como la peroxidasa de rábano (HRP) o
una fosfatasa alcalina son válidas para este mecanismo.7 ​Por ejemplo, la peroxidasa
puede catalizar la oxidación del 4-cloronaftol en presencia de un 1% de peróxido de
hidrógeno. El resultado es que el primero forma una mancha de precipitado
oscura.11 ​Otras técnicas, como ELISA o ELISPOT, también emplean este método de
detección.

Otro método más sofisticado consiste en la unión de una enzima que catalice una Unión del anticuerpo primario a la proteína de
reacción quimioluminiscente. Las anteriormente citadas enzimas también son interés. A este se une la proteína A o la proteína
válidas en este caso, aunque cada una usa un agente quimioluminiscente diferente. G para ser detectada.
En el caso de la peroxidasa, cataliza la oxidación del luminol en presencia de
peróxido de hidrógeno. La fosfatasa alcalina cataliza la defosforilación del
adamantil-1-2-dioxetano fosfato, reacción que genera luz. Si se coloca una película
fotográfica sobre la membrana, la exposición a la luz que se desprende en la
reacción permite detectar la actividad enzimática.

Marcaje fluorescente

Otro método basado en el mismo principio emplea anticuerpos unidos a

fluorocromos del infrarrojo cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) -
furanona (MDPF) o el rojo Nilo. Estos compuestos emiten una cantidad de luz
constante (estado estático) cuando se excitan de manera constante, permitiendo
una detección muy precisa y una cuantificación del antígeno más exacta que la de la Anticuerpo secundario unido a la peroxidasa de
rábano, de modo que puede catalizar la reacción
quimioluminiscencia, que se realiza durante un estado dinámico.
quimioluminiscente.
El rojo Nilo no puede usarse para teñir bandas en membranas de PVDF; sin
embargo es posible realizar la tinción en el gel SDS - PAGE y luego transferirlo a la
membrana de PVDF. Esto último presenta una ventaja, y es que no es necesario realizar una tinción del gel para comprobar la
transferencia proteica.12 ​

Sistema avidina/estreptavidina

Otra opción es emplear un anticuerpo primario unido covalentemente a moléculas de biotina. Después la detección se llevará a
cabo con una proteína de unión a la misma, como la estreptavidina o la avidina.

Detección con oro

Otra técnica, conocida como Golden blot, consiste en la detección de los anticuerpos primarios con proteína A unida a partículas de
oro. El resultado es una membrana con manchas rojas, causadas por el oro, allí donde está la proteína.13 ​ La sensibilidad del
método puede incrementarse con una tinción fotoquímica de plata: el oro cataliza la reducción de los iones plata a plata metálica en
presencia de otro agente reductor, como la hidroquinona; la plata forma de este modo unas manchas visibles bajo microscopio
óptico. Se consigue así una sensibilidad comparable a la de las técnicas radiactivas.7 14
​ ​

Método en un paso

Históricamente la detección se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad que supone producir anticuerpos primarios y
secundarios en procesos separados. Esto ofrece a investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a flexibilidad se refiere, y
añade un efecto amplificador al proceso. Sin embargo, debido a la llegada de los análisis de proteínas de alto rendimiento y los
menores límites de detección ha crecido el interés por desarrollar sistemas de detección en un solo paso que aumentarían la rapidez
del proceso al tiempo que reducen los consumibles. Esto requiere un anticuerpo que reconozca al mismo tiempo la proteína de
interés y una "etiqueta" detectable. Se incuba de manera similar al anticuerpo primario del proceso en dos pasos, y, tras una serie
de lavados, ya se puede detectar directamente.

Análisis

Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la detección de aquellas que sí se han unido a la proteína de interés.

Detección colorimétrica

La detección colorimétrica depende de la incubación del Western blot con un sustrato que reacciona gracias a la enzima reporter
(una peroxidasa, por ejemplo) unida al anticuerpo secundario. Pasa así de ser un compuesto soluble a una forma insoluble de otro
color que precipita cerca de la enzima tiñendo así la membrana. Se procede después a un lavado en el que se elimina el tinte
soluble. La cuantificación proteica se evalúa por densitometría (cuan intensa es la mancha) o por espectrometría.
Detección quimioluminiscente

La detección quimioluminiscente requieren la incubación de la membrana con un sustrato, que emitirá luminiscencia al ser
expuesto al reporter que trae unido el anticuerpo secundario. La luz captada por una película fotográfica o, más recientemente, por
cámaras CCD, que toman una imagen digital del Western blot. Se analiza la imagen por densitometría para evaluar la cantidad
relativa de mancha y cuantifica el resultado en términos de densidad óptica. Actualmente hay programas que permiten realizar
análisis más profundos si se aplican ciertos estándares, como la obtención del peso molecular.

Detección radioactiva

Los marcadores radiactivos no requieren sustratos enzimáticos; en su lugar se coloca una película fotográfica contra el Western blot
y la actividad radiactiva del marcador provoca la aparición en ella de regiones oscuras. Estas se corresponderán con las bandas de
las proteínas de interés. Su alto precio y su riesgo para la salud y la seguridad han provocado su desuso en los últimos tiempos.

Detección fluorescente

En la detección con marcadores fluorescentes se procede a la excitación lumínica de éstos que les provoca una excitación. Ésta es
detectable por un fotosensor, como una cámara CCD equipado con los filtros de emisión apropiados. Se consigue así una imagen
digital del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso molecular o la cuantificación proteica. La fluorescencia es
considerada uno de los métodos de análisis más sensibles.

Exploraciones secundarias

Una característica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de nitrocelulosa, es su capacidad de quitar los anticuerpos y
volver a explorar la membrana con otros anticuerpos. Aunque hay protocolos que permiten hacer lo mismo en membranas de
nitrocelulosa, la robustez de las de PVDF facilita la eliminación de los anticuerpos, permitiendo una mayor reutilización antes de
que el ruido de fondo sea tan grande que impida continuar con los experimentos. Otra diferencia es que, a diferencia de la
nitrocelulosa, el PVDF debe ser empapado en etanol, isopropanol o metanol al 95% antes de ser usado. Además, las membranas de
PVDF tienden a ser más delgadas y más resistentes a los daños durante su uso.

Aplicaciones

Investigación

Actualmente, el Western blot es una de las técnicas más usadas en el estudio de la biología molecular.

Diagnóstico
Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el Western Blot se usa como prueba confirmatoria
cuando el ELISA da un resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una población donde la prevalencia del virus
es muy baja. Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se transfieren a
una membrana las proteínas de células que, se sabe, están infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay que
probar con esta membrana. Este paso es equivalente a la incubación con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en
el suero, serán estos los que realicen el papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la
membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-señal. La aparición de bandas
indica la presencia de proteínas contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es
seropositivo.
Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente llamada "enfermedad de las vacas
locas".
Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.
En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la presencia del FIV en gatos.
En la práctica clínica, el Western Blot se utiliza para diagnosticar enfermedades infecciosas, más frecuentemente famoso, el
VIH. Algunos laboratorios clínicos inmunofluorescencia emplean técnicas de Western Blot como confirmación así como
 pruebas (tales como la detección de anticuerpos circulantes anti-colágeno VI anticuerpos en la epidermólisis ampolla adquirida
o varios anti-proteínas propias en pénfigo paraneoplásico). A menudo, estas aplicaciones clínicas son suplantadas por más
productivos ELISA con costo reducido y rendimiento acelerado.

Protocolos
Western Blotting Protocol from Protocolmonkey (http://www.protocolmonkey.com/protocols/view_protocol.php?id=1)
Modified Western blotting protocols from Biotechniques (https://web.archive.org/web/20091207015645/http://www.e-biotek.co
m/protein/244-western-blot-protocol.html)
Western Immunoblot protocols from Cell Signaling Technology (http://www.cellsignal.com/support/protocols/index.html#wester
n)
Dr. Mark Barton Frank Lab protocol (http://www.protocol-online.org/prot/Molecular_Biology/Protein/Western_Blotting/)
Kamps's Western Blotting Protocol (https://web.archive.org/web/20110720041622/http://carmen.salk.edu/~sefton/Hyper_protoc
ols/western.html)
https://web.archive.org/web/20100420005952/http://www.natureprotocols.com/2006/09/15/western_blot_analysis_of_subce.php
http://www.prosci-inc.com/Western-Blot-Protocol.html
CSH Protocols collection: Immunoblotting (http://cshprotocols.cshlp.org/cgi/collection/immunoblotting)

Véase también
ELISA
Northern blot
Southern blot
Southwestern blot

Referencias
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«Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting»
[Western blot: Técnica, teoría y solución de problemas] (http
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de diazobenciloximetil y detección con antisuero: un método
para estudiar la especificidad de anticuerpos y estructura
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