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ELECTROFORESIS EN

GEL DE AGAROSA Y
POLIACRILAMIDA

Electro:
electricidad

Electroforesis.

Foresis:
Trasladar

Es la migracin de fragmentos de ADN o


ARN por la accin de un campo elctrico en
funcin de su tamao.

OJO, NO CONFUDIR!

HISTORIA
Vin
Thorne:
bioqumico del
Instituto de Virologa
de Glasgow

caracterizar
las
distintas formas de
ADN que se obtenan
de
partculas
purificadas
de
polyomavirus.

TIPOS DE GELES
Agarosa (ADN)

Poliacrilamida
(PROTEINAS)

Gelificacin trmica
Baja Resolucin
Separan fragmentos de
DNA de entre 300 a
10000pb.
Se corren horizonalmente
Son mas fciles de
preparar y manipular

Gelificacin qumica
Alta resolucin.
Separan fragmentos de
DNA <500pb.
Se corren de forma vertial
Son mas complejos de
preparar

ELECTROFORESIS
EN GEL DE
AGAROSA

CARACTERISTICAS

La separacin de las macromolculas depende de


dos variables: carga y masa.
cuanto ms baja es la concentracin de agarosa
mayor es el tamao de las molculas que pueden
separarse, y viceversa
Los geles de agarosa son ideales para analizar el
producto
de digestiones con enzimas de restriccin, lo que
puede combinarse con otras tcnicas como el
Southern blot, as como para analizar los productos
coloide natural que se
de una reaccin de PCR.

Agarosa

extrae de las algas


(Gelidium gracilaria), es
un polisacrido lineal
formado por la repeticin de
la unidad bsica, la
agarobiosa, que comprende

ELECTROFORESIS
EN GEL DE
AGAROSA

Componentes:
Agarosa
Bufer de carga
Bufer de corrida
Frentes de migracin
Muesta de ADN
Bromuro de etidio

ELECTROFORESIS
EN GEL DE
AGAROSA

Etapas de la tcnica
Preparacin de la
Muestra
Preparacin del gel
Preparacin de las
muestras con el
buffer de carga
Carga de la muestra
Corrida del gel

ELECTROFORESIS
EN GEL DE
AGAROSA

Ejercicio: como preparar un ge


de agarosa
Bromuro de tidio: 2l
ADN: 10 l
Buffer TBE 0,5X

Agarosa 1% ---- gr

40 gr-------------100%
X ------------- 1%

ELECTROFORESIS
EN GEL DE
POLIACRILAMIDA

CARACTERSTICAS
En la preparacin del gel, la polimerizacin de los
monmeros de acrilamida produce cadenas lineales. Al
incluir bisacrilamida, sta da lugar a puntos de
ramificacin en el polmero, lo que permite formar una
matriz tridimensional, dando lugar al gel de
poliacrilamida. El tamao de los huecos o poros que
forma la retcula del polmero depende de la
concentracin de acrilamida y del grado de
entrecruzamiento

Desnaturaliza
nte
SDS - PAGE

No
Desnaturaliza
nte

ELECTROFORESIS
EN GEL DE
POLIACRILAMIDA

O Gaal y otros en 1984

N, N, N, NTetrametilen-diamina

PSA: Oxidante; TEMED: reducto

Polimerizacin del gel acrilamid


Es sensible al oxgeno
Cubrir el gel con agua o
n-butanol durante la
polimerizacin previene el
contacto con el oxgeno,
as
como la formacin de
menisco

Se debe ajustar la cantidad de TEMED y PSA para


que la
polimerizacin
no
tenga
lugar
demasiado
deprisa, generando as
demasiado calor

Gel Stacking
(Empaquetador)
Menor concentracin de
acrilamida
Tamao de poro mayor
pH cido-neutro

0,75 mm grosor

Funcin: acumular las


protenas a la entrada del gel
separador para que salgan al
mismo tiempo (Salida
Neutralizada)

Gel Separating (Separador)


Mayor concentracin de acrilamida
Tamao de poro menor
pH alcalino
Funcin:

separar las protenas

A mayor
concentracin
del gel menor
es el poro.

Sistemas de electrofore
El sistema de electroforesis a emplear depende
de los objetivos a alcanzar, los ms empleados son:

Gel uniforme y tampn homogneo: la resolucin es


menor que con los sistemas heterogneos, porque no hay
efecto concentrador en la primera parte de la corrida.
Rpidos y sencillos NO GEL EMPAQUETADOR
Gel y tampn heterogneno: se varan el poro del gel
y los iones del tampn, por lo que se puede concentrar
la muestra SI GEL EMPAQUETADOR

La teora de fue formulada por Jovin.

lmite de Kohlraush

NO DESNATURALIZANT
LAS PROTENAS SE SEPARAN POR:
CARGA ELCTRICA
TAMAO y FORMA

Puesto que utilizamos unas


condiciones de pH alcalinas,
la mayora de las protenas
van a estar
CARGADAS NEGATIVAMENTE

QUIN LLEGAR ANTES A LA MET

VENTAJAS
separa protenas en estado nativo
las protenas siguen siendo funcionales
permite separar complejos proteicos o protenas
multimricas como una unidad

DESVENTAJAS
muchas protenas no migran por no tener carga neta o
se pierden por poseer carga neta positiva
el proceso de separacin es muy lento debido a la
debilidad de la carga neta de las protenas
el proceso de separacin no slo est afectado por el
tamao sino tambin por la forma de la protena

Desnaturalizante
(SDS PAGE)
Se lleva a cabo en condiciones desnaturalizantes:
1.se emplea un agente reductor de puentes ss
generalmente dtt (ditiotreitol) o -mercaptoetanol
2.se emplea el detergente aninico sds
(sodium dodecyl sulfate)
3. generalmente tambin se calienta la
muestramuestra

Los
grupos
alifticos
dodecil se colocan en el
interior, mientras que los
grupos sulfato en la
superficie

LAS PROTENAS SE SEPARAN POR:


TAMAO

CTODO

+
NODO

Preparacin
Para la preparacin del gel separador o inferior (5 ml,
grosor = 0,75 mm), mezclar segn el % deseado:

Iniciar la polimerizacin = add 3 ml de TEMED +


15 ml de persulfato de amonio a la mezcla.
Inmediatamente mezclar y verter la solucin en los vidrios
(molde), hasta 1/3
eliminar la curvatura (menisco) en la superficie, con una
delgada capa (1-2 mm) de agua destilada o de isobutanol
(dejar por 15-20 min)
Decantar el exceso de lquido,.

Mezclar los componentes del gel superior (compactador).

Adicionar la mezcla , colocar el peine y dejar polimerizar.


Preparar las muestras. Estas se pueden analizar en estado
reducido o no reducido, mezclndolas con el respectivo
amortiguador de muestras..
Cargar las muestras: (5-15 ml, correspondiendo por ej. a
10-30 mg en el caso de mezclas complejas, o 3-10 g en
el caso de protenas purificadas).
.Llenar la cmara con el amortiguador de cmara (180 ml
en el tanque inferior y 120 ml en el superior). Colocar el
gel en la cmara y correr las muestras a 200 v (voltaje
constante) hasta que el azul de bromofenol llegue casi al
borde inferior del gel (45-60 min).

Teir el gel durante 1 hr con azul Coomassie R-250.


Eliminar luego el exceso de colorante con varios cambios
del decolorador.
Registrar los resultados por fotografa.

Ventajas
Separacin rpida de las protenas
La separacin no depende de la forma de la protena nativa
Se puede estimar el peso molecular de las protenas
Aunque desnaturalizadas, las protenas pueden usarse para la
fabricacin de anticuerpos (en la mayora de los casos)

Desventajas
Las protenas separadas estn desnaturalizadas
no son funcionales

BIBLIOGRAFA

B . LOMONTE. Electroforesis en gel de poliacrilamida. Cap


13.pp 93.
FIERRO, Francisco. Electroforesis de ADN. Herramientas
moleculares aplicadas en ecologa.
Aaij C. y P. Borst. 1972. The gel electrophoresis of DNA.
Biochimica and Biophysica Acta 269: 192-200.
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA CON SDS
SDS-PAGE . Disponible en: file:///D:/Mis
%20Documentos/Downloads/practicas%20(1).pdf
GARCA. Hilda. Electroforesis en geles de poliacrilamida:
fundamentos,
actualidad e importancia. Laboratorios BETER. 200

GRACIAS!