UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
“Dr. Wilfredo Erwin Gardini Tuesta”

ACREDITADA POR SINEACE

RE ACREDITADA INTERNACIONALMENTE POR RIEV

BASES MOLECULARES Y CELULARES DE LA

MEDICINA II

SEMESTRE ACADÉMICO: 2023-I

DOCENTES RESPONSABLES DE LA ASIGNATURA

FILIAL ICA : Mg EDWIN A. LI HERNÁNDEZ

 Semana 14

TÉCNICAS EN BIOLOGÍA
MOLECULAR I
 FRACCIONAMIENTO DEL CONTENIDO DE UNA CÉLULA
MEDIANTE CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

⚫ El aislamiento de una organela particular en gran cantidad suele lograrse mediante la

técnica de CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL, que depende del principio de que, en tanto
sean más densas que el medio circundante, las partículas de diferente tamaño y forma
viajan hacia el fondo de un tubo centrifugado a distintas velocidades cuando se colocan en
un campo de centrifugación.

⚫ Cuando una célula se rompe por homogeneización, las membranas citoplasmáticas se

fragmentan y los bordes de los fragmentos de la membrana se fusionan para formar
vesículas esféricas menores de 100 nm de diámetro.

⚫ Las vesículas obtenidas de diferentes organelos (núcleo, mitocondria, membrana

plasmática, retículo endoplasmático, etc.) tienen diferentes propiedades, que les permiten
separarse entre sí. Esta técnica se conoce como fraccionamiento subcelular.
Para efectuar esta técnica se procede primero a la rotura mecánica de las células con un
HOMOGENEIZADOR.

Las células se homogeneizan en una solución amortiguada isotónica (que a menudo contiene
sacarosa), lo que previene la rotura de las vesículas de membrana por ósmosis.

Homogeneizador Centrífuga
VALORES NORMALES DE LAS DIVERSAS
ETAPAS DE CENTRIFUGACIÓN:

Velocidad baja: 1000 veces la fuerza de

gravedad durante 10 minutos.

Velocidad media: 20000 veces la fuerza de

gravedad por 20 minutos.

Velocidad alta: 80000 veces la fuerza de la

graviedad por 1 hora.

Velocidad muy alta: 150000 veces la fuerza de

la gravedad por 3 horas.

Video sobre centrifugación:

https://www.youtube.com/watch?v=LWZMmCgC5rQ
 AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y FRACCIONAMIENTO DE
PROTEÍNAS

⚫ La proteína debe aislarse en un estado relativamente puro antes de poder obtener información de la
estructura o la función de una proteína particular.
⚫ La purificación completa de una proteína determinada suele requerir el uso de técnicas sucesivas que
aprovechan las diferentes propiedades de las proteínas que se separan.

PRECIPITACIÓN SELECTIVA
⚫ Por lo general el primer paso en la purificación aprovecha las diferencias en la
solubilidad entre las proteínas mediante la precipitación selectiva de la proteína
deseada.
⚫ La solubilidad de una proteína en una solución determinada depende de un
equilibrio relativo entre las interacciones proteína-solvente que la mantienen en
solución y de las interacciones proteína-proteína que hacen que se agregue y
precipite de la solución.
⚫ La sal que más se utiliza para la precipitación selectiva de proteínas es el
SULFATO DE AMONIO.
 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA

CROMATOGRAFÍA: designa varias técnicas en las que una mezcla de

componentes disueltos se fracciona a su paso por cierto tipo de matriz
porosa.

En las técnicas de cromatografía líquida, los componentes en una

mezcla pueden relacionarse con una de dos fases alternativas:
una FASE MÓVIL, consistente en un solvente en movimiento, y una
FASE ESTACIONARIA, que es la matriz a través de la cual se mueve el
solvente.
La fase inmóvil consiste en materiales que se empacan en una
columna.

Las proteínas que van a fraccionarse se disuelven en un solvente y

luego se pasan por la columna.

Los materiales que conforman la fase inmóvil contienen sitios a los

que las proteínas en solución pueden unirse.
 Cromatografía de intercambio iónico
⚫ Depende de los enlaces iónicos de proteínas con un material matriz inerte, como la
celulosa, que contiene grupos con carga eléctrica unidos por enlaces covalentes.

⚫ Dos de las resinas de intercambio iónico más usuales son la dietilaminoetilcelulosa (DEAE)
y la carboximetilcelulosa (CM).

➢ La DEAE-celulosa tiene cargas positivas, por lo que se une con moléculas de carga
negativa; es un INTERCAMBIADOR DE ANIONES.

➢ La CM-celulosa posee carga negativa y es un INTERCAMBIADOR DE CATIONES.

⚫ La resina se empaca en una columna y se permite que la solución de proteína pase por la
columna en un amortiguador cuya composición promueve la unión de algunas o todas las
proteínas con la resina.
Las proteínas se unen con la resina en
forma reversible y pueden desplazarse
por el aumento en la fuerza iónica del
amortiguador (que agrega iones para
competir con los grupos cargados de las
macromoléculas para sitios en la resina)
o por el cambio de su pH.

Las proteínas se extraen de la columna

en orden, de la que tiene una unión
menos fuerte a la unida con mayor
fuerza. Cromatografía de intercambio iónico
Intercambiador de aniones
 Cromatografía de filtración en gel
La filtración en gel separa proteínas (o ácidos nucleicos) con base en su tamaño efectivo.

El material de separación consiste en cuentas o perlas diminutas que se empacan en una columna a través de la
cual la solución de proteína pasa lentamente.

Los materiales que se emplean en la filtración por gel se componen de polisacáridos con enlaces cruzados
(dextranos o agarosa) de distinta porosidad, lo que permite que las proteínas se difundan dentro y fuera de las
cuentas.
Cómo purificar una proteína globular con una masa
molecular de 125 kDa :

Un modo en que la proteína podría purificarse consiste

en pasar la mezcla por una columna de cuentas
Sephadex G-150, que permite la entrada de proteínas
globulares < 200 kDa.

Cuando la mezcla de proteínas pasa por el lecho de la

columna, la proteína de 250 kDa es incapaz de entrar a
las cuentas y permanece disuelta en la fase solvente
móvil.

Las otras dos proteínas pueden difundirse a los

intersticios entre las cuentas y su paso por la columna
se retrasa.
Conforme más solvente pasa por la columna, estas
proteínas se mueven hacia abajo y salen por el fondo, Cromatografia de filtración en gel. Separación de 3 proteínas
globulares con diferente masa 250, 125 y 75 kDa.
pero lo hacen a distintas velocidades. Entre las
proteínas que entran a las cuentas, las especies más
pequeñas se retrasan más que las grandes.
 Cromatografía por afinidad

La cromatografía por afinidad aprovecha las propiedades

estructurales únicas de una proteína, lo que permite que
una especie de proteína se retire de manera específica de
la solución mientras que las demás quedan en ésta.

Las proteínas interactúan con sustancias específicas:

enzimas con sustratos, receptores con ligandos, antígenos
con anticuerpos, etc.

Cada uno de estos tipos de proteínas pueden retirarse de

la solución si la mezcla de proteínas se pasa a través de
una columna en la que la molécula específica de
interacción (sustrato, ligando, anticuerpo, etc.) se une
mediante enlaces covalentes con un material inerte e
inmovilizado (la matriz).
 ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

La separación electroforética de proteínas casi siempre se realiza por electroforesis en gel de

poliacrilamida (PAGE), en la que las proteínas son impulsadas por una corriente que se aplica
a través de una matriz gelatinosa.
La matriz se compone de polímeros de acrilamida que establece enlaces cruzados para
formar un tamiz molecular.

El movimiento relativo de las proteínas por un

gel de poliacrilamida depende de la densidad de
carga (carga por unidad de masa) de las
moléculas.
Mientras mayor sea la densidad de carga, la
proteína se impulsa con más fuerza por el gel y
por tanto la migración es más rápida.
No obstante, el tamaño y la forma también Cámara de electroforesis
influyen.
➢ Las muestras de proteína suelen disolverse en una solución de sacarosa cuya densidad impide que la muestra
se mezcle con el amortiguador y luego se carga en los pozos con una pipeta fina.

➢ Se aplica una corriente directa al gel, lo que ocasiona que las proteínas se muevan en la poliacrilamida en
carriles paralelos.
Cuando se realiza con dodecil sulfato de amonio (SDS), como casi siempre sucede, las proteínas se mueven como
bandas a velocidades inversamente proporcionales a su masa molecular.

➢ Una vez que la electroforesis se completa, el gel se retira y se realiza la tinción.

Video sobre electroforesis:
https://www.youtube.com/watch?v=KvocAloxKSI