Western blot 1

Western blot
El Western blot, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para
detectar proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla
compleja de proteínas, como un extracto tisular). Mediante una
electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que
se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi
tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son
transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa
o de PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos
específicos contra ella.[1][2] Finalmente, se detecta la unión
antígeno-anticuerpo por actividad enzimática, fluorescencia entre otros Resultado del Western blot: una membrana con
las proteínas separadas en la electroforesis unidas,
métodos. De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en
de las que sólo se disciernen aquellas contra las
el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas. se ha añadido un anticuerpo.

Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la

biología, como la biología molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología. Existe toda una industria
especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de proteínas
diferentes.[3][4]
El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de Stanford.[2] El nombre
(Western, occidental en inglés) le fue dado por W. Neal Burnette,[5] y consiste en un juego de palabras con una
técnica análoga pero que usa DNA, el Southern (sureño) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor,
Edwin Southern. Otras técnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern blot (en el que se
separa e identifica RNA), el Eastern blot, el Southwestern blot.

Antecedentes
Antes de la aparición del Western blot, ya existían diversas técnicas capaces de detectar un antígeno determinado en
una muestra, como la inmunoelectroforesis, la inmunodifusión doble de Ouchterlony, la inmunoprecipitación...
La aparición del Western no fue posible hasta la aparición de las membranas. En 1975, Edwin Southern demostró
que la nitrocelulosa era capaz de capturar ácidos nucleicos separados previamente por electroforesis. De esta forma,
se permitía el análisis de una mezcla compleja de moléculas de ADN, como un genoma tratado con enzimas de
restricción.[6] Se desarrolló así el Southern blot, usando el nombre del descubridor como epónimo; es por ello que
tanto esta técnica como sus derivadas (Western blot, Northern blot...) se escriben con mayúscula.
Más tarde, Towbin (1979) y Burnette (1981) demostraron que también era capaz de unirse a proteínas. Ya en 1986,
Millipore desarrolló la primera membrana de PVDF diseñada para la transferencia de proteínas, la membrana de
transferencia ImmobilonTM PVDF. Porteriormente fue llamada membrana de transferencia Immobilon-PTM para
diferenciarse de otras membranas.
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Pasos del Western blot

Preparación de la muestra
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:
• Una pequeña cantidad del tejido se introduce en un buffer de extracción. Después se procede a
homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes volúmenes de muestra), con un homogenizador (para
muestras pequeñas) o por sonicación. Por último se centrifuga para obtener las proteínas en el sobrenadante, la
fracción no precipitada.[7]
• Las células pueden lisarse por uno de esos métodos mecánicos. También pueden usarse detergentes, sales o
tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las proteínas. A veces se añaden inhibidores de proteasas y
fosfatasas que evitan la digestión por las enzimas celulares de las proteínas y de las fosfoproteínas,
respectivamente.[8]
Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 °C) para evitar la desnaturalización proteica. Para separar
proteínas de compartimentos y orgánulos celulares es preciso combinar técnicas mecánicas - como filtraciones y
centrifugaciones - y bioquímicas.

Electroforesis en gel
Las proteínas de la muestra serán separadas mediante una electroforesis en gel en función de uno o varios (en las
electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto isoeléctrico, peso molecular y carga eléctrica. La naturaleza
de la separación depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.
La electroforesis en gel más frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de poliacrilamida y de tampón
con dodecilsulfato (SDS). En esta técnica las proteínas sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la
pérdida de las estructuras secundaria y terciaria (por ejemplo, reduciendo los puentes disulfuro (S-S) a grupos tiol
(SH + SH)) y mantiene los polipéptidos en este estado desnaturalizado. De este modo, la estructura tridimensional de
las proteínas no influye en la electroforesis, y pueden separarse únicamente en función del tamaño.
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Transferencia
Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos, se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a
una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusión, por vacío o por acción
de un campo eléctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de unir proteínas de forma
inespecífica (es decir, se adhieren a todas las proteínas con idéntica afinidad):
• las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las interacciones membrana -
proteína, se sabe con cierta seguridad que se trata de interacciones no covalentes de naturaleza hidrófóba.
• en las membranas de PVDF, la unión está basada en interacciones hidrofóbicas y de dipolos entre la membrana y
las proteínas. Como particularidad, deben ser humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones
acuosos, debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.
Las membranas de nitrocelulosa son más baratas que las de PVDF, aunque son también más frágiles, tienden a
tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden ser sometidas a varias pruebas consecutivas.[9]
También pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel activado. Sin embargo, no son tan
usados como los anteriores.

Difusión simple
En la transferencia por difusión simple se ponen en contacto las superficies del gel electroforético y de la membrana
y, sobre ésta, se dispone un taco de papeles de filtro. Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una
placa de vidrio y un objeto pesado. Este montaje se coloca sobre un tampón, que ascenderá por capilaridad hacia el
papel de filtro arrastrando consigo las proteínas. Al llegar a la membrana, quedarán retenidas en ella.
Este protocolo no está muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de proteína transferida a la membrana es
muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia. Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una
modificación que permite obtener múltiples transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar
varias pruebas sobre geles virtualmente idénticos. Esta modificación es viable cuando no es necesaria una
transferencia cuantitativa de proteína.[10][11]
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Transferencia al vacío
En esta técnica, se añade el poder de succión de una bomba conectada a un sistema de secado de planchas de gel, el
cual lleva las proteínas desde el gel hasta la superficie de la membrana de nitrocelulosa.[12] Este método es válido
tanto para proteínas de alto como de bajo peso molecular.[11]

Electrotransferencia
Este método se basa en una corriente eléctrica y un tampón de transferencia para llevar las proteínas desde el gel
hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o cátodo al
positivo o ánodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, más
papeles de filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, se dispone en el
sistema de transferencia y se aplica una corriente eléctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo
disponible,... Las proteínas del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana.[1]

Tras la transferencia, se suele proceder a la tinción del gel con Coomassie Brilliant Blue (un colorante de proteínas)
para comprobar que en efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la membrana.
La electrotransferencia es hoy en día la técnica de transferencia más usada gracias a la velocidad del proceso y al
elevado porcentaje de proteína que se transfiere (especialmente en comparación con las otras técnicas).

Bloqueo
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse proteínas de forma inespecífica, es preciso bloquear los
lugares de unión que han quedado libres tras la transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza
proteica) empleado en la detección puede unirse a ellos, dificultando la distinción del complejo antígeno-antígeno
que se forma con la proteína que se busca.
En el bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas, típicamente de albúmina de suero bovino o
ASB (más conocida por sus siglas en inglés, BSA), leche en polvo o caseína, con una diminuta fracción de
detergente, como Tween 20 o Tritón X-100. Las proteínas en solución se unirán a todos aquellos lugares de unión de
la membrana que no estén ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo sólo podrá
unirse a su antígeno específico, reduciendo así el ruido de fondo y los falsos positivos.
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Detección
En la detección se comprueba la presencia en la membrana de una determinada proteína. Para ello se emplea un
anticuerpo específico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reacción colorimétrica
(produce color). De esta forma, se hace patente la unión con el antígeno, la proteína, así como su localización.
El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la detección en un único paso, lo
cual es útil en ciertos campos.

Método en dos pasos

Los dos pasos de los que consta este método de detección son la unión del anticuerpo primario y la del anticuerpo
secundario.

Anticuerpo primario
El primer paso es permitir la unión de un anticuerpo primario contra la proteína buscada. Éste se consigue
inoculando dicha proteína o uno de sus epítopos (regiones capaces de desencadenar la respuesta inmune) a un animal
(como un conejo o una cabra) o a un cultivo celular. Además, como la proteína se ha desnaturalizado durante la
electroforesis en gel, es preciso que el anticuerpo reconozca específicamente la proteína desnaturalizada. La
presencia del elemento extraño debería desencadenar una respuesta inmune cuyo resultado incluya la producción del
anticuerpo, primario en este caso, ya que reconoce la proteína.
Así pues, tras el bloqueo se incuba en agitación moderada la membrana con una disolución de anticuerpo primario
(0,5 - 5 μg/ml). La disolución consiste en un tampón salino, con cloruro de sodio por lo general, con un pH cercano a
la neutralidad, una pequeña fracción de detergente y, en ocasiones, proteínas disueltas, como ASB o leche en polvo.
La membrana junto con la disolución pueden ser introducidas en una pequeña bolsa de plástico. Esta incubación
puede durar desde 30 minutos a una noche entera. La temperatura a la que puede tener lugar es igualmente variada;
en general, las elevadas temperaturas favorecen las uniones más específicas.
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Anticuerpo secundario
Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se expone al anticuerpo secundario.
Éste reconoce de forma específica una región concreta del anticuerpo primario. Suelen estar marcados para ser
detectables (unión a biotina, a una enzima reporter como laa fosfatasa alcalina o la peroxidasa del rábano (HRP),
etc.). Varios de estos anticuerpos se unirán a cada anticuerpo primario, amplificando la señal.
Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas de origen animal. Por ejemplo, un
anticuerpo secundario "anti-ratón" es aquel capaz de reconoces casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de
ratones. Igualmente hay anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo"... Su uso presenta ciertas ventajas: económicas, por
permitir a un laboratorio compartir una única fuente de anticuerpos secundarios; y dan resultados mucho más
consistentes.
También pueden emplearse proteínas no anticuerpos, como las proteínas A y G.

Radiactividad

Es una alternativa al uso de anticuerpos

secundarios que consiste en proteínas de
unión a anticuerpos marcadas
radiactivamente. Esta proteína puede ser,
por ejemplo, la proteína A de
Staphylococcus aureus[13] o la proteína
G[14] marcadas con 125I (un isótopo
radiactivo de yodo). Las proteínas
mencionadas tienen la capacidad de unirse a
anticuerpos de forma inespecífica, por lo
que se unirán al primario.
Unión del anticuerpo primario a la proteína de interés. A este se une la proteína A
Este método apenas se usa actualmente, por o la proteína G para ser detectada.
ser significativamente más caro, peligroso y
lento que los otros. Sin embargo, presenta ventajas: es muy sensible, da bandas que permiten una precisa
cuantificación; y la imagen autoradiográfica puede ser reproducida fácilmente y con gran precisión para su
publicación.[11]

Anticuerpo unido a una enzima

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Un mecanismo de detección simple y rápido

consiste en unir al anticuerpo secundario
enzimas que catalicen la transformación de
un sustrato soluble en un producto insoluble.
De esta forma, en el posterior análisis
quedará una mancha allí donde esté la
proteína de interés. Enzimas como la
peroxidasa de rábano (HRP) o una fosfatasa
alcalina son válidas para este mecanismo.[11]
Por ejemplo, la peroxidasa puede catalizar la
oxidación del 4-cloronaftol en presencia de
un 1% de peróxido de hidrógeno. El
resultado es que el primero forma una Anticuerpo secundario unido a la peroxidasa de rábano, de modo que puede
mancha de precipitado oscura.[15] Otras catalizar la reacción quimioluminiscente.

técnicas, como ELISA o ELISPOT, también

emplean este método de detección.

Otro método más sofisticado consiste en la unión de una enzima que catalice una reacción quimioluminiscente. Las
anteriormente citadas enzimas también son válidas en este caso, aunque cada una usa un agente quimioluminiscente
diferente. En el caso de la peroxidasa, cataliza la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrógeno. La
fosfatasa alcalina cataliza la defosforilación del adamantil-1-2-dioxetano fosfato, reacción que genera luz. Si se
coloca una película fotográfica sobre la membrana, la exposición a la luz que se desprende en la reacción permite
detectar la actividad enzimática.

Marcaje fluorescente
Otro método basado en el mismo principio emplea anticuerpos unidos a fluorocromos del infrarrojo cercano, como el
2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) - furanona (MDPF) o el rojo Nilo. Estos compuestos emiten una cantidad de luz
constante (estado estático) cuando se excitan de manera constante, permitiendo una detección muy precisa y una
cuantificación del antígeno más exacta que la de la quimioluminiscencia, que se realiza durante un estado dinámico.
El rojo Nilo no es puede usarse para teñir bandas en membranas de PVDF; sin embargo es posible realizar la tinción
en el gel SDS - PAGE y luego transferirlo a la membrana de PVDF. Esto último presenta una ventaja, y es que no es
necesario realizar una tinción del gel para comprobar la transferencia proteica.[16]

Sistema avidina/estreptavidina
Otra opción es emplear un anticuerpo primario unido covelentemente a moléculas de biotina. Después la detección
se llevará a cabo con una proteína de unión a la misma, como la estreptavidina o la avidina.

Detección con oro

Otra técnica, conocida como Golden blot, consiste en la detección de los anticuerpos primarios con proteína A unida
a partículas de oro. El resultado es una membrana con manchas rojas, causadas por el oro, allí donde está la
proteína.[17] La sensibilidad del método puede incrementarse con una tinción fotoquímica de plata: el oro cataliza la
reducción de los iones plata a plata metálica en presencia de otro agente reductor, como la hidroquinona; la plata
forma de este modo unas manchas visibles bajo microscopio óptico. Se consigue así una sensibilidad comparable a la
de las técnicas radiactivas.[11][18]
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Método en un paso
Históricamente la detección se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad que supone producir anticuerpos
primarios y secundarios en procesos separados. Esto ofrece a investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a
flexibilidad se refiere, y añade un efecto amplificador al proceso. Sin embargo, debido a la llegada de los análisis de
proteínas de alto rendimiento y los menores límites de detección ha crecido el interés por desarrollar sistemas de
detección en un solo paso que aumentarían la rapidez del proceso al tiempo que reducen los consumibles. Esto
requiere un anticuerpo que reconozca al mismo tiempo la proteína de interés y una "etiqueta" detectable. Se incuba
de manera similar al anticuerpo primario del proceso en dos pasos, y, tras una serie de lavados, ya se puede detectar
directamente.

Análisis
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la detección de aquellas que sí se han unido a la
proteína de interés.

Detección colorimétrica
La detección colorimétrica depende de la incubación del Western blot con un sustrato que reacciona gracias a la
enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo) unida al anticuerpo secundario. Pasa así de ser un compuesto soluble
a una forma insoluble de otro color que precipita cerca de la enzima tiñendo así la membrana. Se procede después a
un lavado en el que se elimina el tinte soluble. La cuantificación proteica se evalúa por densitometría (cuan intensa
es la mancha) o por espectrometría.

Detección quimioluminiscente
La detección quimioluminiscente requieren la incubación de la membrana con un sustrato, que emitirá luminiscencia
al ser expuesto al reporter que trae unido el anticuerpo secundario. La luz emitida es captada por una película
fotográfica o, más recientemente, por cámaras CCD, que toman una imagen digital del Western blot. Se analiza la
imagen por densitometría para evaluar la cantidad relativa de mancha y cuantifica el resultado en términos de
densidad óptica. Actualmente hay programas que permiten realizar análisis más profundos si se aplican ciertos
estándares, como la obtención del peso molecular.
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Detección radiactiva
Los marcadores radiactivos no requieren sustratos enzimáticos; en su lugar se coloca una película fotográfica contra
el Western blot y la actividad radiactiva del marcador provoca la aparición en ella de regiones oscuras. Éstas se
corresponderán con las bandas de las proteínas de interés. Su alto precio y su riesgo para la salud y la seguridad han
provocado su desuso en los últimos tiempos.

Detección fluorescente
En la detección con marcadores fluorescentes se procede a la excitación lumínica de éstos que les provoca una
excitación. Ésta es detectable por un fotosensor, como una cámara CCD equipado con los filtros de emisión
apropiados. Se consigue así una imagen digital del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso
molecular o la cuantificación proteica. La fluorescencia es considerada uno de los métodos de análisis más sensibles.

Exploraciones secundarias
Una característica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de nitrocelulosa, es su capacidad de quitar los
anticuerpos y volver a explorar la membrana con otros anticuerpos. Aunque hay protocolos que permiten hacer lo
mismo en membranas de nitrocelulosa, la robustez de las de PVDF facilita la eliminación de los anticuerpos,
permitiendo más reusos antes de que el ruido de fondo es tan grande que impide continuar con los experimentos.
Otra diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa, el PVDF debe ser empapado en etanol, isopropanol o metanol
al 95% antes de ser usado. Además, las membranas de PVDF tienden a ser más delgadas y más resistentes a los
daños durante su uso.

Aplicaciones

Investigación
Actualmente, el Western blot es una de las técnicas más usadas en el estudio de la biología molecular.[19]

Diagnóstico
• Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el Western Blot se usa como prueba
confirmatoria cuando el ELISA da un resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una población
donde la prevalencia del virus es muy baja. Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en una
muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana las proteínas de células que, se sabe, están infectadas
por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta membrana. Este paso es equivalente a la
incubación con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero, serán estos los que realizen el
papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a incubar
con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-señal. La aparición de bandas indica la presencia
de proteínas contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo.
• Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente llamada "enfermedad de
las vacas locas".
• Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.
• En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la presencia del FIV en gatos.
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Protocolos
• Western Blotting Protocol from Protocolmonkey [20]
• Modified Western blotting protocols from Biotechniques [21]
• Western Immunoblot protocols from Cell Signaling Technology [22]
• Dr. Mark Barton Frank Lab protocol [23]
• Kamps's Western Blotting Protocol [24]
• http://www.natureprotocols.com/2006/09/15/western_blot_analysis_of_subce.php
• http://www.prosci-inc.com/Western-Blot-Protocol.html
• CSH Protocols collection: Immunoblotting [25]

Enlaces externos
• Métodos de transferencia de proteínas a filtros - Universidad de Barcelona [26]

Referencias
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Western blot 11

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Fuentes y contribuyentes del artículo 12

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GermanX, Isha, J3D3, Jerryq, Jorge c2010, Maleiva, Playita, Saracenomartin, UPO649 1112 mreycor1, 20 ediciones anónimas

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