Western Blot

Introducción y Optimización
10 Abril 2013
Ariana Veiga
Western Blot
¿En qué • También llamado Inmunoblot
consiste el
Western • Técnica utilizada para identificar una proteína en una muestra que contiene
Blot? varias proteínas
• Las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en función de su
peso molecular
¿Cómo
funciona?
• A continuación se utiliza un anticuerpo específico para detectar la proteína de interés
• El resultado aporta información sobre el peso molecular de la proteína y su cantidad
relativa en la muestra

Calle 1: Anticuerpo anti- β Actina (ab8226) diluido 1/1000

Calle 2: ab8226 diluido 1/10000

Calles 3-4: ab8226 diluido 1/500

Calle 1: Lisado celular HeLa (humano)

Calle 2: Lisado celular HeLa (humano)

Calle 3: Lisado celular HEK293 (humano)

Calle 4: Lisado celular 3T3 (ratón)

2
¿En qué casos es útil utilizar
Western Blot?

¿Está la proteína de interés presente en mi muestra?

El tratamiento con un determinado agente “X”,

¿aumenta o reduce el nivel de expresión de mi
proteína?

¿Cómo varía el nivel de expresión de la proteína en

distintos tejidos o líneas celulares?

¿Mi muestra es sana o patológica? El WB permite

detectar enfermedades tales como la enfermedad de
Lyme, la de las vacas locas, el VIH, etc.…

3
Organización del Webinar

Paso 1: Preparación de la muestra

Paso 2: Electroforesis en gel

Paso 3: Transferencia gel - membrana

Paso 4: Inmunodetección

Controles recomendados en WB

Selección de anticuerpos

Problemas técnicos y optimización.

Ejemplos.

Enlaces a otros productos de interés

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Protocolo de Western Blot

Paso 1: Preparación de la muestra

Paso 2: Electroforesis en gel

Paso 3: Transferencia gel - membrana

Paso 4: Inmunodetección

Controles recomendados en WB

Selección de anticuerpos

Problemas técnicos y optimización.

Ejemplos.

Enlaces a otros productos de interés

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Preparación de las muestras para la
electroforesis

Lisis: Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se
degradan mecánicamente para liberar las proteínas

• Células: mantenerlas en hielo, lavar con PBS frío y añadir el tampón de lisis (~1ml por
cada millón de células). Después agitar durante 30 minutos a 4 ºC

• Tejido: diseccionar rápidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar inmediatamente

en nitrógeno líquido y homogeneizar en tampón de lisis (300 µl por cada 5 µg de tejido).
Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300 µl de tampón, y agitar después
durante 2 horas a 4 ºC

• Centrifugar a 4 ºC durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo

en hielo

6
Lisis

Mantener las muestras en hielo o a 4ºC para evitar degradación de las proteínas

Los tampones deben prepararse en el momento y mantenerse en frío. Antes de realizar la

lisis, añadir al tampón un cocktail de inhibidores de proteasas
Si la proteína de interés está fosforilada, es importante asegurarse de incluir inhibidores de
fosfatasas al tampón de lisis
Elegir un tampón de lisis adecuado en función de la localización celular de la proteína
de interés

Localización de la proteína Tampón de lisis recomendado

Célula entera NP-40 o RIPA
Citoplasmática (soluble) Tris-HCl
Citoplasmática (citoesqueleto) Tris-Triton
Membranal NP-40 o RIPA
Nuclear RIPA
Mitocondrial RIPA
7
Preparación de las muestras para la
electroforesis

Lisis: Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se
degradan mecánicamente para liberar las proteínas
• Células: mantenerlas en hielo, lavar con PBS frío y añadir el tampón de lisis
(~1ml por cada millón de células). Después agitar durante 30 minutos a 4 ºC
• Tejido: diseccionar rápidamente el tejido y mantenerlo en hielo. Congelar
inmediatamente en nitrógeno líquido y homogeneizar en tampón de lisis (300 µl
por cada 5 µg de tejido). Aclarar las cuchillas del homogeneizador con 2 x 300
µl de tampón, y agitar después durante 2 horas a 4 ºC
• Centrifugar a 4 ºC durante 20 minutos, aspirar el sobrenadante y mantenerlo
en hielo

Determinar la concentración de proteínas

Condiciones reductoras y desnaturalizantes: las muestras son normalmente

tratadas con agentes que rompen las estructuras tridimensionales de las proteínas
(dímeros, estructuras terciarias)
• Añadir el tampón de carga a la muestra y calentar 5 minutos a 95-100ºC o
durante 5-10 minutos a 70ºC

8
Condiciones reductoras y
desnaturalizantes

Un tampón de carga estándar contiene SDS (dodecilsulfato sódico) y β-

mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol)
• El SDS desnaturaliza la proteína en su estructura primaria y la recubre de
cargas negativas
• El β-mercaptoetanol y el DTT son agentes reductores que rompen los
puentes disulfuro
• Todo ello permite que las proteínas se separen en función del peso molecular
mediante SDS-PAGE
• La reducción y desnaturalización permiten además la accesibilidad del
anticuerpo a su sitio de unión

SDS y DTT/
β-mercaptoetanol

Nota: Algunos anticuerpos solo reconocen las proteínas nativas (no reducidas y/o no desnaturalizadas). En este caso SDS y/o β-mercaptoetanol o
DTT no deben añadirse a los tampones.

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Protocolo de Western Blot

Paso 1: Preparación de la muestra

Paso 2: Electroforesis en gel

Paso 3: Transferencia gel - membrana

Paso 4: Inmunodetección

Controles recomendados en WB

Selección de anticuerpos

Problemas técnicos y optimización.

Ejemplos.

Enlaces a otros productos de interés

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SDS-PAGE

Método que permite separar las proteínas bajo un campo eléctrico

Definición
de acuerdo a su movilidad electroforética

SDS : Dodecilsulfato Sódico; PAGE : Electroforesis en gel de poliacrilamida

11
SDS-PAGE

• El gel de poliacrilamida se coloca en un compartimento que contiene el

tampón de migración. Un tampón de migración suele contener 25mM Tris;
190mM glicina; 0,1% SDS; pH 8,3
• Los lisados proteicos se cargan en las calles del gel, normalmente entre
20 y 40 µg por calle
• Se aplica un campo eléctrico que provoca el movimiento de las proteínas
¿Cómo
hacia el polo positivo
funciona? • Al haberse tratado las proteínas con SDS (cargas negativas), las cargas
endógenas de las mismas son despreciables
• El resultado es que las proteínas se separan en función de su talla, o
peso molecular
• Las proteínas de menor tamaño quedan menos retenidas en la matriz del
gel y por tanto migran mas rápidamente

-
Corriente eléctrica
Frente de migración
+
12
Geles

Constituidos de poliacrilamida, N, N-metilenbisacrilamida (Bis), persulfato de

amonio (APS) y TEMED

La estructura del gel puede modificarse alterando la proporción de acrilamida

Para proteínas pequeñas, se usa un gel con un porcentaje elevado de

acrilamida, y viceversa para proteínas de gran tamaño
Los geles en gradiente se recomiendan en aquellos casos en los que el tamaño
de la proteína es desconocida

Tamaño de la proteína (kDa) Porcentaje del gel

4-40 20
12-45 15
10-70 12,5
15-100 10
25-200 8
13
Electroforesis en condiciones no
reductoras y/o no desnaturalizantes

Forma requerida de Condiciones Tampón de

la proteína electroforesis Tampón de carga migración
Reducida- Reductor y Con ß-mercaptoetanol Con SDS
Desnaturalizada desnaturalizante o DTT
Con SDS
Reducida - Nativa Reductor no Con ß-mercaptoetanol o Sin SDS
desnaturalizante DTT
Sin SDS
Oxidada – No reductor y Sin ß-mercaptoetanol ni Con SDS
Desnaturalizada desnaturalizante DTT
Con SDS
Oxidada - Nativa No reductor y Sin ß-mercaptoetanol ni Sin SDS
nativo DTT
SinSDS

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Protocolo de Western Blot

Paso 1: Preparación de la muestra

Paso 2: Electroforesis en gel

Paso 3: Transferencia gel - membrana

Paso 4: Inmunodetección

Controles recomendados en WB

Selección de anticuerpos

Problemas técnicos y optimización.

Ejemplos.

Enlaces a otros productos de interés

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Objetivo de la transferencia

Una vez realizada la electroforesis, es necesario marcar la proteína de interés

para poder visualizarla

El gel no es una superficie adecuada para poder marcar las proteínas

• Los anticuerpos no son retenidos en el gel
• Los geles son frágiles y difíciles de manipular

Por tanto, es necesario transferir las proteínas a un soporte más adecuado

16
¿Cómo funciona la transferencia?

El principio es similar al de PAGE, es decir, las proteínas cargadas

negativamente migran hacia el polo positivo bajo el efecto de un campo eléctrico

Se intercala una membrana entre el gel y el electrodo positivo

Las proteínas se adhieren a la membrana siguiendo la misma disposición que

en el gel
Las membranas pueden ser de nitrocelulosa o polifluoruro de vinilideno (PVDF).
Estas últimas requieren un pretratamiento con metanol

Montaje de la transferencia

17
¿Transferencia en medio
húmedo o semi seco?
Ventajas Inconvenientes
• El gel y la membrana se intercalan y fijan Adecuado El proceso de
firmemente entre finas esponjas y papel para proteínas transferencia es
absorbente grandes o más largo
• Este montaje “sándwich” se sumerge en un difíciles de
Medio compartimento que contiene el tampón de transferir
Húmedo transferencia donde se aplica a continuación
la corriente eléctrica
• Un tampón de transferencia se compone
normalmente de 25mM Tris, 190mM Glicina
y 20% de Metanol

• El montaje papel-gel-membrana-papel se Más rápido La membrana

humedece con tampón de transferencia puede secarse
Semi
• El montaje se coloca directamente entre el afectando a la
cátodo y el ánodo donde se aplica la corriente transferencia de
Seca las proteínas
• El tampón de transferencia estándar suele
contener 48mM Tris, 39mM Glicina, 0,04%
SDS, y 20% Metanol
18
Transferencia de proteínas >100 kDa

Transferencia en medio húmedo durante la noche a 4 ºC y bajo voltaje

Añadir 0.1% SDS al tampón de transferencia para reducir la formación de

aglomerados en el gel

Reducir la cantidad de metanol en el tampón de transferencia a 10% o incluso

menos para evitar la dispersión de proteínas en el gel

Si la membrana es de PVDF, el metanol puede retirarse completamente del

tampón (sigue siendo necesario sin embargo su pre-tratamiento con metanol)

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Protocolo de Western Blot

Paso 1: Preparación de la muestra

Paso 2: Electroforesis en gel

Paso 3: Transferencia gel - membrana

Paso 4: Inmunodetección

Controles recomendados en WB

Selección de anticuerpos

Problemas técnicos y optimización.

Ejemplos.

Enlaces a otros productos de interés

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¿Por qué se utilizan anticuerpos?

Colorantes como Coomassie pueden

usarse para teñir las proteínas
después de realizar el SDS-PAGE SDS3

Pero, ¿cuál de las bandas

corresponde a la proteína de interés?

Lisado celular de SDS3 transfectado

El uso de anticuerpos específicos (ab94303) en SDS-PAGE (izquierda)
soluciona el problema detectando y en Western Blot con el anticuerpo
únicamente la proteína de interés ab89345 anti-SDS3 (derecha).

21
Inmunodetección

Bloqueo de la
membrana Leche, BSA, etc…

Epítopo

Incubación con el Proteína Proteína

anticuerpo primario Anticuerpo

Lavado (TBST)

Incubación con
Proteína Proteína
anticuerpo secundario Anticuerpo
conjugado

Lavado (TBST)

Detección
Proteína

22
Detección
Sustrato (peróxido de hidrógeno + luminol)

Producto (sensible a la luz)

Un sustrato quimioluminiscente, como el ECL, reacciona con un anticuerpo

secundario conjugado a la enzima HRP, produciendo una señal que se captura en
una película fotográfica

Los sustratos cromogénicos (4-cloronaftol o DAB) también pueden utilizarse con las
enzimas HRP o AP, dando lugar a un producto coloreado que se deposita en la
membrana próximo a la zona del anticuerpo

Los anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforos también pueden usarse

siempre y cuando se disponga de un equipo de detección especial

ECL : Enhanced chemiluminescence DAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride

HRP : HorseRadish Peroxidase AP : Alkaline Phosphatase
23
Protocolo de Western Blot

Paso 1: Preparación de la muestra

Paso 2: Electroforesis en gel

Paso 3: Transferencia gel - membrana

Paso 4: Inmunodetección

Controles recomendados en WB

Selección de anticuerpos

Problemas técnicos y optimización.

Ejemplos.

Enlaces a otros productos de interés

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Controles de carga
Los controles de carga son anticuerpos usados para asegurar que la carga de proteínas en cada calle del gel de
SDS PAGE es constante
Un anticuerpo control de carga detecta una proteína altamente conservada y presente en cantidades similares
independientemente del tipo de muestra

Tipo de Peso molecular

Control de carga muestra (KDa) Precauciones
β Actina Célula entera / 42 No es válido para muestras del musculo esquelético. Cambios en
Citoplasma las condiciones de crecimiento celular e interacciones con los
componentes de la matriz extracelular pueden alterar la síntesis de
la proteína actina (Farmer et al, 1983)
GAPDH Célula entera / 30-40 Algunos factores fisiológicos, como hipoxia o diabetes, aumentan
Citoplasma el nivel de expresión de GAPDH en determinados tipos celulares
Tubulina Célula entera / 55 La expresión de tubulina puede variar con la resistencia a
Citoplasma sustancias antimicrobianas y antimitóticas (Sangrajrang S. et al,
1998, Prasad V et al, 2000)
VDCA1/Porinas Mitocondria 31
COXIV Mitocondria 16 Muchas proteínas migran al mismo peso molecular (16KDa) que
COXIV
Lamin B1 Núcleo 66 No es válido para muestras en las que se ha eliminado la
membrana nuclear
Proteína de unión Núcleo 38 No es válido para muestras sin ADN
a TATA (TBP)

25
Controles de carga

Nota: la afinidad del anticuerpo puede variar según la especie o naturaleza de la proteína (nativa o
recombinante), etc…

Todas las calles - anticuerpo anti - Actina – control de

carga (ab8227) diluído 1/1000
Calle 1: Células HeLa (humano) a 20 µg
Calle 2: Células 3T3 (ratón) a 20 µg
Calle 3: Hígado de pescado a 20 µg
Calle 4: Hígado de conejo a 20 µg
Calle 5: Células MDCK (perro) a 20 µg
Calle 6: Células EBTr (bovino) a 20 µg
Calle 7: Células SL-29 (pollo) a 20 µg
Calle 8: Células CHO (Hamster chino) a 20 µg
Calle 9: Embrión de Xenopus a 20 µg

26
Controles positivos y negativos

Realizar en paralelo el ensayo de muestras desconocidas con muestras

en las que se ha comprobado el nivel de expresión de la proteína de
interés
• Proteína recombinante
• Células transfectadas con la proteína de interés
• Tejidos o líneas celulares que expresen la proteína

Incluir también una muestra que no exprese la proteína a detectar

• Muestras knockout o siRNA
• Tejidos o líneas celulares que no expresen la proteína

27
Péptidos de bloqueo

La pre-incubación del anticuerpo primario con el péptido inmunógeno permite bloquear de

manera específica los sitios de unión del anticuerpo

Las bandas específicas no serán visibles en el blot ya que el anticuerpo pre-incubado no

puede unirse a la proteína en la membrana

Útil para determinar si las bandas observadas corresponden a isoformas, fragmentos de la

proteína o proteínas no específicas

Todas las calles:

Anti-Histona H3 (fosfoS10) [mAbcam 14955] - ChIP Grade (ab14955) a 1 µg/ml

Calle 1: Preparado de Histona, células HeLa

Calle 2: Preparado de Histona de células HeLa tratadas con colcemida

Calle 3: Preparación de histona de células HeLa 0,5µg con péptido de bloqueo

Histona H3 – fosfo S10, trimetil K9 (ab15644) a 1 µg/ml

Calle 4: Preparación de histona de células HeLa tratadas con colcemida 0,5µg

con péptido de bloqueo Histona H3 – fosfo S10, tri metil K9 (ab15644) a 1 µg/ml

28
Protocolo de Western Blot

Paso 1: Preparación de la muestra

Paso 2: Electroforesis en gel

Paso 3: Transferencia gel - membrana

Paso 4: Inmunodetección

Controles recomendados en WB

Selección de anticuerpos

Problemas técnicos y optimización.

Ejemplos.

Enlaces a otros productos de interés

29
Adecuado para Western Blot

Utilizar anticuerpos que hayan sido previamente testados en Western Blot

Las aplicaciones en las que un anticuerpo ha sido testado se indican en la

ficha técnica del anticuerpo

30
Inmunógeno y especificidad

Inmunógeno: proteína específica o secuencia de amino ácidos que se inyecta en un animal

para provocarle una respuesta inmunitaria y producir anticuerpos específicos contra ella

La selección del inmunógeno permite producir un anticuerpo que reconozca y se fije sobre
una región específica de la proteína (epítopo)

Asegurarse que la secuencia del inmunógeno está presente en la proteína de interés

cuando se esté estudiando una isoforma concreta de la proteína, la forma madura o un
precursor de la misma – si no, el anticuerpo no reconocerá la proteína

NERTCRCDKP

NERTCRCDKP

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Protocolo de Western Blot

Paso 1: Preparación de la muestra

Paso 2: Electroforesis en gel

Paso 3: Transferencia gel - membrana

Paso 4: Inmunodetección

Controles recomendados en WB

Selección de anticuerpos

Problemas técnicos y optimización.

Ejemplos.

Enlaces a otros productos de interés

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Ausencia de bandas,
o bandas muy débiles
Origen del problema
Incompatibilidad con el anticuerpo
secundario
No hay suficiente proteína o
anticuerpo para producir una señal
Tiempo de incubación insuficiente
para producir una señal
La membrana no se ha bloqueado
correctamente
La proteína no se ha transferido
correctamente del gel a la
membrana
Las proteínas hidrófobas son más
difíciles de transferir
La muestra no expresa la proteína
de interés
El anticuerpo no reconoce la
proteína de interés
Solución
Seleccionar un anticuerpo secundario que sea
compatible con la especie y el isotipo del anticuerpo
primario (ej. Anticuerpo secundario anti-IgM de ratón
con anticuerpo primario IgM hecho en ratón)
Aumentar la cantidad de lisado, de anticuerpo
primario o de anticuerpo secundario (incluso una
combinación de los tres)
Incubar la membrana con el anticuerpo primario
durante la noche a 4ºC
Bloquear durante menos tiempo o usando un agente
de bloqueo diferente. La adición de Tween 20 al
tampón de bloqueo reduce la fijación del anticuerpo
al agente de bloqueo
Comprobar que se ha producido la transferencia
usando un colorante como rojo de Ponceau. Es
posible que sea necesario aumentar o disminuir el
tiempo de transferencia
Para este tipo de proteínas usar membranas de
PVDF
Revisar literatura y bases de datos sobre la proteína
de interés
Verificar que la secuencia del inmunógeno está
presente en la proteína a estudiar
33
Ruido de fondo
Origen del problema Solución
Exceso de lisado celular, anticuerpo Reducir la carga de proteína en el gel y/o diluir más
primario o secundario que provocan los anticuerpos
uniones no específicas

Temperatura de incubación del Incubar durante la noche a 4ºC

anticuerpo primario muy elevada

La membrana no se ha bloqueado Aumentar el tiempo de lavado, y añadir un

correctamente detergente, como Tween 20, al tampón de lavado.
Probar otro agente de bloqueo

Uso de una membrana no Las membranas de nitrocelulosa suelen dar menos

adecuada ruido de fondo que las membranas de PVDF

Degradación de la proteína Optimizar la preparación de la muestra. Mantener

las muestras en hielo y añadir una solución recién
preparada de inhibidores de proteasas.
Almacenamiento de muestras a largo plazo puede
dañar las proteínas

Presencia de isoformas o Consultar la literatura y SwissProt

fragmentos de la proteína de interés

Presencia de polímeros Hervir las muestras durante 10 minutos antes de

realizar la electroforesis

34
Exceso de proteína y/o anticuerpo

Dilución de
la muestra y
anticuerpo
primario

35
Optimización del tampón de bloqueo

5% leche 5% BSA

5% BSA 5% leche

Anti-GAPDH [mAbcam 9484] - Loading Control

(ab9484) a una dilución 1/1000

A cada anticuerpo le corresponderá una solución de bloqueo óptima

36
Burbujas de aire, lavados insuficientes,
transferencia incompleta

Durante la transferencia,
contacto insuficiente entre
el gel y la membrana

Burbujas de aire entre el

gel y la membrana durante
la transferencia

Lavados insuficientes

37
Proteínas en estado nativo

Algunos anticuerpos presentan mayor afinidad por las estructuras nativas de las
proteínas que por las formas desnaturalizadas y/o reducidas
La imagen muestra un Western Blot de colágeno III humano purificado, en la
forma reducida y desnaturalizada a la izquierda, y en su forma nativa a la derecha
La estructura tridimensional del sitio de unión del anticuerpo al antígeno se
pierde al desnaturalizar y reducir la proteína

Forma reducida y Forma

desnaturalizada nativa
Colágeno humano purificado (ab7535) a 5 µg por
calle con el anticuerpo anti-colágeno III(ab6310)

Calle 1: Proteína en su forma reducida y

desnaturalizada

Calle 2: Proteína nativa (son reducir ni desnaturalizar)

Imagen cortesía de un Abreview enviado por

Michaela Leyh

38
Conocer la proteína de interés

Las proteínas no siempre muestran una única banda al peso

molecular esperado
Posibles motivos: fragmentación de la proteína, modificaciones post
-traduccionales, expresión de isoformas, propiedades isoeléctricas
Una diferencia del 10-15% respecto al tamaño esperado se
considera aceptable y dentro de la normalidad

Se aconseja consultar siempre SwissProt y la literatura

39
Protocolo de Western Blot

Paso 1: Preparación de la muestra

Paso 2: Electroforesis en gel

Paso 3: Transferencia gel - membrana

Paso 4: Inmunodetección

Controles recomendados en WB

Selección de anticuerpos

Problemas técnicos y optimización.

Ejemplos.

Enlaces a otros productos de interés

40
Protocolos y material de interés

SwissProt – www.uniprot.org

• Protocolos detallados de WB
www.abcam.com/protocols

• Guía sobre controles de carga:

http://www.abcam.com/loadingcontrolguide

• Vídeo detallado sobre WB:

http://www.abcam.com/westernblotguide
Guía de trucos para WB

Descarga tu guía de trucos para WB en nuestra página de protocolos

O pide tu copia por e-mail: mailrequest@abcam.com
41
Reactivos para Western Blot

• Geles prefabricados y soluciones tampón optimizadas para WB

Optiblot • Otros reactivos (tinción de gel, Bradford, etc …)
• www.abcam.com/Optiblot
Marcadores
de peso • Marcadores de peso molecular pre coloreados y listos para usar
molecular • www.abcam.com/prismproteinladders
Prism

Anticuerpos
• Anticuerpos secundarios validados para WB
secondarios • Conjugados a fosfatasa alcalina (AP) o peroxidasa (HRP)
AbExcel
• www.abcam.com/abexcel

• Sustratos ECL de alta sensibilidad para WB

Kits ECL
• www.abcam.com/ecl

42
Optiblot – reactivos para WB

Fáciles de usar – pocillos Hasta 10 veces más

coloreados para facilitar la fuertes que los geles
carga de la muestra convencionales

Pocillos de alta Larga duración – 1-2

capacidad y sin peine años de caducidad
que remover

Fáciles de abrir, sin Geles compatibles con la

espátulas o cuchillos mayoría de tanques

Todos los reactivos necesarios para tus experimentos:

• Tampones optimizados
• Optiblot Blue (ab119211) – tinción tipo Coomassie del gel en tan sólo 15 minuots
• Reactivo Bradford y ensayo BCA – compatible con detergentes en la muestra
• Otros productos – membranas PVDF de baja fluorescencia, etc …

Más información: www.abcam.com/Optiblot

43
Anticuerpos monoclonales de conejo
( ), óptimos para WB
Histona H3
(fosfoT3) RabMAb
Anticuerpo histona H3 (fosfoT3)
(ab78351), dilución 1/500,000 en HeLa.
1) Sin tratar,
2) Tratadas con FBS + Caliculina A.
RabMAb: ventajas para WB
• Alta afinidad – mayor factor de dilución (hasta
1:500.000 en algunos RabMAbs)
• Alta especificidad – señal específica, sin o
con muy poco ruido de fondo
• Reconocen epítopos diversos – ideal para la
detección de modificaciones post-
traduccionales (ej. fosforilación, metilación,
acetilación)
• Cada RabMAb has sido testado en WB en
muestras humanas, de ratón y rata para
determinar la reactividad
• Más de 4000 RabMAbs disponibles
Más información: www.abcam.com/rabmabs
44
AbExcel anticuerpos secundarios

5 razones para usar secundarios AbExcel

• Altamente testados
• AbExcel conjugados a AP se pueden usar en
diluciones de 1/5000 a 1/50000
• Con 1 vial de AbExcel conjugado a AP, se
pueden conseguir hasta 1.500 blots (usando
dilución 1/5000 en 3ml leche/BSA)
• AbExcel conjugados a HRP se pueden usar en
diluciones de 1/2000 a 1/20000
• Con 1 vial de AbExcel conjugado a HRP, se
pueden conseguir hasta 600 blots (usando
dilución 1/2000 en 3ml leche/BSA)

Más información:
AbExcel: http://www.abcam.com/AbExcel

45
Bolígrafo Luminol para membrana
(ab166858)

La forma más fácil y segura de calcular el peso molecular de la proteína de

interés. Una vez las proteínas han sido transferidas a la membrana:

Marca los estándares de PM con el boli Lumimol en la membrana

Continúa con la hibridación de la membrana según tu procedimiento

habitual (bloqueo, etc…)

Revela la membrana por quimioluminiscencia o colorimetría

Visualiza y localiza las bandas del estándar con película o procesador

CCD

46
Contáctanos

soportecientifico@abcam.com

España: Teléfono: 91 114 65 54, email: orders@abcam.com

Argentina: Tecnolab; Teléfono: +54-11-4555-0010, email: patologia@tecnolab.com.ar

Chile: Biosonda; Teléfono: +56-2-209-6770, email: ventas@biosonda.cl

Méjico: CTR Scientific; Teléfono: +52-81-8158-0600, email: nallely.lopez@ctr.com.mx

Otros paises: Abcam; Teléfono: +1-617-577-4200, email: us.orders@abcam.com

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(hasta el 31 de mayo 2013)

• Gama Optiblot
• RAbMAbs
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Código : SPWEB-XBIS1

48
¿Preguntas?

49