Biología molecular y Citogenética

UF8: APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE

EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS.
PRIMERA PARTE:
Repaso previo.
 COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.
Los ácidos nucleicos son biomoléculas formadas por la unión de
nucleótidos que constituyen la unidad estructural.
 COMPOSICIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.

Cada nucleótido consta de:

•Un azúcar (ribosa o desoxirribosa).
•Una base nitrogenada.
•Un grupo fosfato.
 TAMAÑO Y PESO MOLECULAR.

La unidad de medida es la
kilobase (kb) que equivale a
1000pb (pares de bases). Se
estima que un fragmento de
ADN de 1kb tiene una
longitud de 0’34μm y un peso
de 660.000Da.
 DESNATURALIZACIÓN DEL ADN.
La desnaturalización es la apertura de la molécula de ADN, separando
sus dos hebras. Este efecto se consigue por tratamiento térmico,
aplicación de pH extremo o exposición a determinados químicos como
alcohol, cetonas, urea o amidas, entre otros.
 Temperatura media de fusión (Tm).
La temperatura media de fusión (Tm) es la temperatura a la cual la mitad
de las hebras de ADN están desnaturalizadas y la otra mitad, formando
parte de la doble hélice. Es característica de cada molécula de ADN
(longitud y %G+C).
 HIBRIDACIÓN.

La hibridación es el emparejamiento de
cadenas complementarias que tienen
origen diferente.

Es una técnica útil en la búsqueda de

secuencias específicas y para valorar el grado
de semejanza de dos moléculas.
 REPLICACIÓN DEL ADN.
Es la formación de dos cadenas de ADN idénticas entre sí e idénticas a
la cadena molde. Ocurre cuando la célula se va a dividir. Tiene lugar
separándose las dos cadenas y formándose otras dos nuevas utilizado a
cada hebra como molde (replicación semiconservativa).

FASES:
•Iniciación.
•Elongación.
•Terminación.
 REPLICACIÓN DEL ADN.
La replicación siempre ocurre en dirección 5'→3 '. Esto plantea un
problema pues las cadenas tienen que crecer simultáneamente a pesar
de que son antiparalelas, es decir, que cada cadena tiene el extremo 5'
enfrentado con el extremo 3' de la otra cadena. Por ello, una de las
cadenas debería ser sintetizada en dirección 3'→5'.
FRAGMENTOS DE
OKAZAKI: cadenas
cortas de ADN recién
sintetizadas en la hebra
discontinua. Estos se
sintetizan en dirección
5'→3' a partir de
cebadores de ARN que
después son eliminados.
Los fragmentos de
Okazaki se unen entre sí
mediante la ADN-ligasa
completando la nueva
cadena.
 ADN-polimerasas.
Las ADN-polimerasas son enzimas que sintetizan ADN a partir de un
molde cuando están disponibles los 4 nucleótidos.
 ADN-polimerasas.
Para su funcionamiento se tienen que dar las siguientes condiciones:
•La doble hélice tiene que estar abierta.
•Tiene que existir una cadena molde que copiar.
•Una cadena iniciadora tiene que estar presente para agregar nucleótidos al
extremo OH 3’ terminal.

Este tipo de enzimas están

disponibles comercialmente y son la
base de la técnica PCR. La más
común es la Taq-polimerasa que es
una polimerasa I (eliminación de los
fragmentos de Okazaki y reparación
del ADN). Se trata de una enzima
termorresistente que se obtiene del
organismo Thermus aquaticus.
 SEGUNDA PARTE:
Reacción en Cadena de la Polimerasa
(Polimerase Chain Reaction, PCR).
PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
CEBADOR/PRIMER.
CEBADORES o PRIMERS: son cadenas sencillas (18-24nt) de ADN
complementarias a una secuencia de ADN a la que se unen.

Para la PCR, se precisan dos cebadores:

•FORWARD (F): se une al extremo 5’ de la cadena.
•REVERSE (R): se une al extremo 3’ de la otra cadena.
 CEBADOR/PRIMER.

Los cebadores deben estar en exceso (1013 para una reacción de 30

ciclos) y su diseño es fundamental para que la técnica ocurra con éxito.
 CEBADOR/PRIMER: diseño.

En el diseño de cebadores, se debe tener en cuenta que deben

ser específicos y no pueden formar estructuras secundarias entre
ellos o con alguna parte de la cadena.

Cuanto menor sea la cantidad de primers disponibles en la reacción, menor será el

rendimiento del amplicón de interés (amplificación del fragmento deseado).
CEBADOR/PRIMER: diseño.
Los cebadores deben tener
un %CG y una longitud
similares. Es deseable que
en el ext.3’ haya una C o una
G (estabilidad) y no es
necesaria una
complementariedad absoluta
en el extremo 5’ con la
secuencia diana.

Para el diseño de cebadores,

se emplean programas
informáticos que facilitan esta
labor.
 CEBADOR/PRIMER: diseño.
Como ya se ha mencionado, la Tm depende del %GC y de la longitud de
la secuencia. Es necesario que la Tm de ambos primers sea similar (2-
3°C) y que no haya más de 5°C con la Tm del producto a amplificar.
 NUCLEÓTIDOS.
Los desoxinucleótidos-trifosfato (dNTPs) son desoxinucleótidos de
adenina, timina, citosina y guanina. Se añaden en
concentraciones de 20-100μM.
 POLIMERASA.
La Taq-polimerasa es la enzima más utilizada y es la responsable
de que ocurra la reacción. Se extrae de Thermus aquaticus que
es una Arquea que resiste altas temperaturas (como las que se
dan en la PCR).

Existen otras polimerasas comerciales que

deben ser termoestables, termoactivas y con
actividad correctora (alta fidelidad). Vienen de
bacterias y arqueas extremófilas.
 ADN MOLDE/TEMPLATE.
El ADN procedente del espécimen es el ADN molde o template. Se
obtiene mediante métodos purificadores que dejan una muestra libre
de ARN (hace descender el rendimiento de la PCR) y de proteínas y
otros compuestos como EDTA, grupos hemo, etc. que inhiben la
reacción.
 BUFFER/TAMPÓN.
El buffer o tampón de reacción es una solución que contiene KCl,
Tris y MgCl2 . El magnesio es un cofactor de la Taq-polimerasa.
Algunos kits comerciales llevan todos estos componentes en
forma de Mastermix.
 REACCIÓN.
La PCR conduce a la formación de nuevas moléculas de ADN a
partir del molde que crecen de forma exponencial en cada ciclo
pues cada vez hay más moléculas formadas que, a su vez, pueden
actuar de molde.
ETAPAS DE LA REACCIÓN.

1. DESNATURALIZACIÓN. 1-5min, 94°C. El calor

facilita que los puentes de hidrógeno que unen a las
bases nitrogenadas de ambas cadenas se separen.

2. HIBRIDACIÓN (annealing). 45seg, 50-70°C. Los

cebadores necesitan que la temperatura descienda
para poder unirse a la secuencia complementaria.

3. ELONGACIÓN. 2min, 72°C. La Taq-polimerasa va

actuando añadiendo los nucleótidos por el extremo
3’.
 ETAPAS DE LA REACCIÓN.
Las etapas de desnaturalización, hibridación y elongación se repiten
un número sucesivo de veces (30-40 ciclos).
A

B
https://www.youtube.com/watch?v=whJTMyyV7gU
 TERCERA PARTE:
Protección del personal.
 CALIDAD DE LA MUESTRA.
En la realización de las PCR, la calidad de la muestra es fundamental
para el éxito de la técnica. La calidad de la muestra está íntimamente
relacionada con su manejo por eso conviene repasar ciertas normas.
MANEJO DE MUESTRAS.
El material biológico es potencialmente peligroso por el riesgo de que
esté contaminado de patógenos como el VIH, VHH, bacilo de Koch, etc.
Por ello, se debe manejar siguiendo unas precauciones universales.

•Prevenir el contacto directo con la

muestra utilizando los EPIs adecuados
(guantes, bata, gafas, mascarillas,
etc.).
•No comer ni beber en el laboratorio.
•Extremar las condiciones de asepsia
y utilizar, en medida de lo posible,
material desechable que pueda tirarse
cuando haya terminado la recogida en
contenedores adecuados.
•Vacunación.
•Si la recogida de muestras se realiza
en la sala de autopsias, extremar las
medidas y aplicar las recomendadas
para ese medio.
CONTAGIOS MÁS COMUNES.
EXPOSICIONES ACCIDENTALES.
RIESGO BIOLÓGICO COMO ENFERMEDAD
PROFESIONAL.
VACUNAS RECOMENDADAS.
 CUARTA PARTE:
Protección de las muestras.
 CONTAMINACIÓN DE LAS MUESTRAS.

CONTAMINACIÓN DE LAS MUESTRAS

Material
Contaminación Contaminación
biológico
microbiológica. química.
humano.
 Material biológico humano.
Puede aparecer contaminación por manejo descuidado de la muestra;
sobre todo por personas ajenas a la investigación.
 Contaminación microbiológica.
Se debe al desarrollo de microorganismos favorecida por la humedad y
las altas temperaturas. Normalmente, se debe a defectos en el
empaquetado y la conservación de las muestras.
 Contaminación química.

Suele asociarse a la inmersión de las muestras en determinados

conservantes como el formol o cuando se han realizado estudios
previos con sustancias químicas como estudios de huellas dactilares.
Dificultan la amplificación y extracción del ADN, comprometiendo el
análisis.
Contaminación química.
PRECAUCIONES BÁSICAS.

• Cambiar los guantes con frecuencia, especialmente cuando se

manipulan indicios biológicos susceptibles de tener distinto origen.
• Evitar hablar o estornudar sobre las muestras. Usar mascarilla.
• Usar bata u otro tipo de ropa protectora.
• Utilizar instrumental desechable siempre que sea posible.
• No añadir conservantes a la muestra.
• Dejar las muestras secar a temperatura ambiente en lugar protegido,
antes de empaquetarlas para su envío al laboratorio.
• Empaquetar cada muestra por separado.
• Empaquetar las muestras en bolsas de papel o cajas de cartón
evitando utilizar plástico.
• Una vez terminada la recogida tirar todo el material desechable
utilizando (guantes, pipetas, papeles, …) en contenedores biológicos.
 QUINTA PARTE:
Recogida de muestras.
 SANGRE.
Es la muestra más utilizada y se obtiene mediante punción venosa
o punción capilar.

PUNCIÓN VENOSA:
heparina y EDTA.
PUNCIÓN CAPILAR.
 SALIVA: células epiteliales.
Se obtienen mediante frotis con hisopo estéril de la parte interior de
las mejillas o por enjuague bucal para la obtención de células
descamadas.

Los hisopos deben dejarse

secar a TA en un lugar
protegido, evitando la
proliferación bacteriana.
 SALIVA: células epiteliales.
Las muestras se deben realizar al menos 1h después de la última
ingesta aunque también se puede realizar tras numerosos
enjuagues, asegurando que no queden restos de comida.
 SALIVA: células epiteliales.
Se pueden usar cepillos cónicos o hisopos tipo cepillo que facilitan
la toma de este tipo de muestras y se secan con facilidad. Existen
kits comerciales estandarizados para realizar estos
procedimientos.
 PELOS CON RAÍZ.
Se debe recolectar una muestra de 10-20 cabellos con raíz. Son
muestras comunes en la práctica forense.
 PERSONAS TRANSFUNDIDAS.
Hay que asegurarse que la muestra no va a tener contaminación de
otras personas; por ello, se evitará el uso de sangre tras un
tiempo prudencial desde la transfusión. Se recomienda el uso de
saliva o pelo en estas situaciones.
 CADÁVERES: sangre post-mortem.
Se recogen unos 10 mL de sangre en EDTA. Se recomienda que
sea obtenida de la vena femoral o de la cavidad cardiaca.
 CADÁVERES: músculo esquelético.
Es un tejido relativamente resistente a la putrefacción. Se
recomienda recolectar dos fragmentos de unos 10g, recogidos
en frascos de rosca con boca ancha. También puede
recogerse músculo cardiaco.
 CADÁVERES: piezas dentales.
Si existen dudas sobre la conservación del cadáver, conviene
extraer 4 piezas dentales (mejor, molares) y reservarlas, para
evitar la exhumación del cadáver.
 CADÁVERES: restos carbonizados.
Hay que tener en cuenta que el ADN es una molécula estable a altas
temperaturas. Si la carbonización no es total, se pueden obtener
muestras de músculo esquelético profundo y de sangre semisólida del
interior del corazón.
 CADÁVERES: restos carbonizados.
Si la carbonización es total, conviene contactar con el laboratorio para
valorar las muestras disponibles y su estado para obtener
recomendación sobre las que son más adecuadas para la realización
del análisis.
 CADÁVERES: putrefacción o esqueletización.
I. Huesos.

Deben retirarse los restos de putrílago. Las piezas de elección son

huesos largos, sobre todo el fémur. De no ser posible la obtención de
estas piezas, consultar con el laboratorio.
 CADÁVERES: putrefacción o esqueletización.
II. Dientes.

Se deben recolectar 4 piezas, a ser posible los morales. Las mejores

piezas son las que no estén dañadas externamente ni sometidas a
endodoncias.
CADÁVERES: restos embalsamados.
Las técnicas de embalsamamiento suelen dañar al ADN,
dificultando su análisis. El laboratorio debe recomendar la
muestra más adecuada en base a la técnica de
embalsamamiento, antigüedad, etc.
GENERALIDADES.
• La preservación de las muestras desde su recogida hasta su llegada al
laboratorio es fundamental.
• Los indicios biológicos (húmedos y líquidos) son vulnerables a la
degradación del ADN en pocas horas.
• La identificación (nombre si se conoce, procedencia, tipo de muestra,
etc.) de los recipientes es esencial.
 SEXTA PARTE:
Identificación de muestras.
 IDENTIFICACIÓN DE LAS MUESTRAS.
El etiquetado de las muestras debe incluir: número de referencia de la
muestra, tipo de muestra, a quién pertenece y/o localización.
 SISTEMAS DE EMPAQUETADO.
I. Tubos con indicios líquidos.
Se introducen en tubos de transporte con cierre irreversible que
serán correctamente identificados. Se mantendrán refrigerados
hasta el envío al laboratorio, a la mayor brevedad.
 SISTEMAS DE EMPAQUETADO.
II. Indicios líquidos, órganos, tejidos blandos, etc.
Deben ir en recipientes con cierre a rosca o hermético que será
precintado, identificado correctamente y mantenido en
refrigeración hasta el envío a la mayor brevedad.
 SISTEMAS DE EMPAQUETADO.
III. Hisopos estériles en seco.
Serán empaquetados en cajas de cartón especiales que
permiten que los hisopos estén protegidos y se sequen
totalmente. Una vez identificadas, serán precintadas y
enviadas al laboratorio sin refrigerar.
 SISTEMAS DE EMPAQUETADO.
Cada muestra (pelos, manchas secas, costras, hueso, diente,
etc.) se coloca sobre un papel para evitar que se pierdan los
indicios biológicos. Se dobla y se introduce en una bolsa de
papel precintada e identificada. Se envía al laboratorio sin
refrigerar.
 SÉPTIMA PARTE:
Extracción de ácidos nucleicos.
 FUENTES DE ADN.
Las muestras de ADN suelen obtenerse de muestras genéricas como
sangre, tejidos blandos, semen, células descamadas en saliva, pelos,
uñas, huesos, dientes, orina, sudor, etc.
 FUENTES DE ARN.
El ARN es una molécula más complicada de obtener y estabilizar.
Las muestras deben obtenerse de sangre o tejidos blandos.
Además, deben ser aisladas de inmediato, las muestras deben
congelarse en nitrógeno líquido y se deben usar soluciones
estabilizadoras.

El ARN aislado debe conservarse a -80°C.

 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS.
Para diagnóstico, las muestras más comunes son: tejidos sólidos, células
embrionarias, líquido amniótico, tejido o sangre fetal, sangre o médula
ósea, muestras bucales, semen y líquidos extravasculares.
 Extracción de tejidos sólidos.
Son muestras obtenidas por biopsias o intervenciones quirúrgicas. Se
liberan los restos de sangre, grasa o tejidos acompañantes por
lavados con suero fisiológico y se envían al laboratorio en fresco o
congeladas. Se descartan las muestras que hayan tardado más de 2h
(30 minutos para ARN) en ser procesadas y que hayan estado a TA.
Características de las principales muestras de tejidos y
órganos adultos.

Para realizar marcadores de membrana (glicoproteínas,

Tejidos tumorales. receptores, etc), citoplasmáticos (receptores hormonales, etc.)
y nucleares (oncogenes).
Tejido hepático. Rico en ADN. Ideal para perfiles de enfermedades metabólicas.
Tejido muscular. Pobre en ADN. Enzimopatías.
Tejido intestinal. Enzimopatías.
Extensiones de
Pobre en ADN. Se obtiene de zonas lampiñas.
piel.
Raíz de pelo. Cantidad mínima de ADN; con fines forenses; difícil de analizar.
Pulpa de los dientes o médula de los huesos. Estos tejidos
Dientes y huesos.
endurecidos se trituran por métodos físicos.
Tejidos Se debe eliminar la parafina mediante disolventes adecuados
parafinados. como el xileno o el tolueno.
Originado hace millones de años. En el ámbar se mantiene en
ADN atrapado.
perfecto estado.
 Extracción a partir de células embrionarias.
Se emplean cuando se quiere realizar un diagnóstico pre-implantacional.
Se extraen 1 o 2 blastómeros de la mórula, lo que no afecta al
desarrollo embrionario normal.
 Extracción a partir de líquido amniótico.
El líquido amniótico contiene células epiteliales descamadas que
pueden aportar unos 65ng/mL a partir de la semana 14 de
gestación. Se obtiene mediante amniocentesis y es una prueba
de diagnóstico prenatal.

•Anomalías cromosómicas.
•Enfermedades metabólicas
congénitas.
•Defectos del desarrollo.
•Determinación del sexo.
•Etc.
 Extracción a partir vellosidades coriónicas.
Se utilizan muestras de vellosidades coriónicas, que están en la
membrana más externa del embrión, en contacto con la placenta. Se
obtienen por biopsias entre las semanas 8 y 12 de gestación y han de
ser cultivadas.
 Extracción a partir de sangre fetal.
I. Fetoscopia.
Se trata de un tipo de endoscopia válido tanto para la
exploración como para la toma de muestras. Se realiza entre
las semana 16 y 21 de gestación. Permite determinar
hemoglobinospatías, coagulopatías, cariotipo, etc.
 Extracción a partir de sangre fetal.
II. Cordocentesis.
Permite obtener sangre fetal
directamente del cordón umbilical
en el T3 de embarazo para
diagnóstico prenatal.
 Extracción a partir SP o MO adultas.
Se puede utilizar sangre venosa extraída normalmente en tubo
anticoagulado, manchas de sangre capilar sobre papel o cartón,
sangre de origen accidental (prendas, vehículos, utensilios, etc.). La
MO se obtiene por punción ósea. Son útiles para metabolopatías,
identificación forense, diagnóstico post-natal (cáncer), etc.
 Extracción a partir SP o MO adultas.
Para muestras sobre papel, se pueden usar tarjetas Guthrie (diagnóstico
neonatal) o papel FTA que es un material tratado en el que la sangre
se seca, se lisan las células y se extraen sus componentes, quedando
fijado exclusivamente el ADN. Estas tarjetas poseen la ventaja de su
fácil transporte y conservación (hasta 17años a TA).

Tarjetas
Guthrie.
Papel FTA.
 Extracción a partir de muestras bucales.
Los raspados y enjuagues bucales se obtienen por métodos no
invasivos, ya vistos en clase. Las células epiteliales aportan
una cantidad suficiente de ADN (8-9μg/toma), apta para fines
forenses o estudios de paternidad.
 Extracción a partir de semen.
Los espermatozoides presentes en un eyaculado son millones y
pueden aportar una cantidad suficiente de ADN. Estas
muestras se pueden obtener por masturbación, por
aspiración vaginal en casos de agresión sexual o por lavado
salino de manchas secas en ropa, piel, etc. Las muestras
deben ser procesadas con la mayor brevedad posible (antes
de 1h) y mantenidas s 37°C.
 Extracción a partir de otras muestras.

Obtenido mediante punción lumbar. En condiciones patológicas,

LCR puede ser relativamente rico en células (leucos, etc).

Líquido
sinovial

Trasudados
Exudados
 DISOCIACIÓN DE TEJIDOS

Fragmentación Disgregación Digestión

mecánica química enzimática.
 DISOCIACIÓN DEL TEJIDO.
En los tejidos, las células están “atrapadas” formando una organización
con interacciones y adhesiones entre ellas y con la matriz extracelular.
Es necesario “liberarlas” mediante fragmentación (mecánica, química
o enzimática).
 Fragmentación mecánica.

Mediante corte, troceado o triturado en disolución isotónica, se

consiguen obtener células individuales o fragmentos tisulares
pequeños que faciliten la liberación celular.
 Disgregación química.
Se consigue mediante sonicación en presencia de detergentes como el
SDS (iónico), el Tween-20® o el Tritón X-100®.

Sonicadores
 Digestión enzimática.
Es el tratamiento con proteasas como la colagenasa, la proteinasa K, la
pepsina o la tripsina. Dependiendo del tipo de tejido, los tratamientos
pueden ser más o menos prolongados.
 SEPARACIÓN DE
CÉLULAS
Sedimentación/ Separación de
CF Magnetismo
centrifugación tipos celulares
 Sedimentación/centrifugación.

Los diferentes componentes de la

suspensiones líquidas,
sedimentan diferente atendiendo
sobre todo a su densidad.

“Jugando” con la velocidad de centrifugación, podemos

conseguir que sedimenten determinados componentes.
 Sedimentación/centrifugación.
I. Centrifugación diferencial.
Adecuada para la separación de células que muestran grandes
diferencias de tamaño.
La sangre anticoagulada se centrifuga a 200xg; se Se puede centrifugar el PRP a
distinguen: 3000xg para obtener plasma pobre
•Eritrocitos en la zona inferior. en plaquetas (PPP).
•Leucocitos en la interfase.
•Sobrenadante que es plasma rico en plaquetas
(PRP).
 Sedimentación/centrifugación.
II. Centrifugación en gradiente de densidad.
Se centrifuga la muestra en un medio comercial con una
densidad intermedia entre los tipos celulares que se
quieren separar.

Separación tipo Ficoll®,

Percoll®, etc.
 Sedimentación/centrifugación.
II. Centrifugación en gradiente de densidad.
 Sedimentación/centrifugación.
II. Centrifugación en gradiente de densidad.
Es una técnica que permite la separación de múltiples poblaciones
celulares como las presentes en la sangre, espermatozoides viables,
células viables y no viables de tejidos disgregados, etc. Incluso
orgánulos y estructuras supramoleculares como las subunidades
ribosómicas o macromoléculas como el ADN.
 Sedimentación/centrifugación.
II. Centrifugación en gradiente de densidad.
 Sedimentación/centrifugación.
III. Centrifugación isopícnica.

Se emplea un gradiente de densidad pero el tiempo de centrifugación no

es suficiente como para que se alcance el equilibrio de sedimentación.
De esta forma, las células nunca sedimentarán en el fondo y quedarán
en una posición intermedia en el gradiente.

Esta técnica permite la

separación de moléculas cuya
densidad es ligeramente
diferente a la del ADN.
 Sedimentación/centrifugación.
III. Centrifugación isopícnica.
 Sedimentación/centrifugación.
IV. Elutriación centrífuga.
Es la separación de células en base a su velocidad de
separación, realizando ciclos sucesivos de sedimentación y
decantación en un sistema de flujo contrario a la
sedimentación (contra la gravedad).
 Sedimentación/centrifugación.
IV. Elutriación centrífuga.
Esta técnica permite separar números grandes de células,
obtener una mayor proporción de células viables, obtener
una gran diversidad de subpoblaciones enriquecidas a
partir de poblaciones celulares hepáticas, células en
proliferación, células sanguíneas u otras.
 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting).

Es un tipo especializado de
citometría de flujo que
permite la separación de las
células en base a la
expresión de marcadores (de
membrana, citoplasmáticos
o nucleares).
FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting).
 Separación directa de tipos celulares.
Se pueden separar tipos celulares según la tendencia a
adherirse a la superficie de un soporte de vidrio o
plástico (adhesión celular). También se pueden usar
anticuerpos específicos para determinadas poblaciones
adheridas a sustratos como tubos, placas, varillas,
microesferas, etc.
 Afinidad por partículas magnéticas.
Se incuban las suspensiones celulares con microesferas magnéticas
conjugadas con anticuerpos frente a marcadores adecuados. Las
células portadoras de dichos marcadores se quedarán unidas a las
microesferas. Tras ello, la suspensión se somete a un campo
magnético, quedando retenidas las células unidas a las microesferas.
La selección puede ser + o -.
 LISIS CELULAR.
La lisis celular permite el fraccionamiento subcelular, la
extracción directa o el fraccionamiento de los ácidos
nucleicos y la fragmentación del ADN.
 LISIS CELULAR.

En algunos casos, la lisis se hace a la

vez que se prepara la muestra en
el paso de homogenización.
 LISIS CELULAR.

Se trata de liberar el contenido celular para poder separar las

biomoléculas.

•MEDIO HIPOTÓNICO: rotura de la membrana celular.

•DETERGENTES: solubilización de lípidos.
•INHIBIDORES DE NUCLEASAS: mantienen la integridad de los ácidos
nucleicos.
 LISIS CELULAR.
Se pueden usar reactivos de lisis diferencial que solo afectan a
determinados tipos celulares como el líquido de Türk (ácido
acético y violeta de genciana) que permite la lisis de los
eritrocitos.
PREPARACIÓN DE FRACCIONES SUBCELULARES.
La centrifugación diferencial permite la obtención
de diferentes orgánulos celulares.
 TRATAMIENTOS ADICIONALES.
I. Mantener la integridad de las muestras.
Se trata de evitar la acción de las nucleasas endógenas utilizando
muestras frescas, añadir inhibidores de las nucleasas como el EDTA
(quelante del Mg) y añadir dietilpirocarbonato (DEPC) que inactiva a
las ribonucleasas.
 TRATAMIENTOS ADICIONALES.
II. Solubilización.
El uso de detergentes como el SDS en la homogenización permite que las
proteínas se disocien y desnaturalicen.
PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
 PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
FASES:
• PRECIPITACIÓN DEL ADN: el ADN es insoluble en alcohol por lo que se puede
precipitar en isopropanol y recuperar por centrifugación. El alcohol del
sobrenadante se llevará a todas las sales añadidas previamente.
• LAVADO DEL PELLET: se realiza con etanol y volviendo a centrifugar.
• RECUPERACIÓN: el sedimento se puede resuspender en agua o tampón Tris
(de hidratación) después de ser secado completamente.
PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
I. Confirmación de la presencia de ADN.
Se puede evidenciar mediante electroforesis en gel de agarosa, tinción
con bromuro de etidio, observación con luz UV o midiendo
absorbancia a 200-350nm.
PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
II. Comprobación de la pureza del ADN purificado.

Se mide la absorbancia de los ácidos

nucleicos (a 260nm) y de las
proteínas (a 280nm). La relación
entre ambas permite valorar la
pureza del ADN obtenido.

Situación ideal:
1’8<A260/A280<2’0
•1’8: ADN puro.
•A260/A280<1’8:
contaminaciones
(proteínas, carbohidratos,
fenol, etc.).
 Medida de la concentración del ADN.
En el caso del ADN genómico o de doble cadena, una
densidad óptica (DO) de 1 equivale a 50μL/mL. Pero
hay que tener en cuenta el factor de dilución (1/d) para
obtener la concentración en ng/μL.
Medida de la concentración del ADN: ejemplo de cálculo.
Muestra de ADN genómico (doble cadena) extraída de un volumen de
50μL.
Se toma una alícuota de 1μL y se diluye 1:50 en agua.
Se mide su A260 y se obtiene un valor de 0’55.
¿Cuál es la concentración y la cantidad de ADN en la muestra?

[ADN]= 50μg/mL x A260 x dilución = 50μg/mL x 0’55 x 50 =

1’375μg/mL.
ADN= [ADN] x volumen = = 1’375μg/mL x 0’05mL = 68’75μg.

Actualmente, estas operaciones las realiza el

propio espectrofotómetro gracias a programas que
permiten estas estimaciones usando volúmenes
pequeños como 1μL.
 ESTIMACIÓN DE LA CALIDAD DEL ADN.
Realizando una electroforesis en gel de agarosa se puede
comprobar si el ADN obtenido está en estado íntegro. Es
importante conocer esta circunstancia pues el ADN
fragmentado dificulta la amplificación por PCR.

Si el ADN está íntegro, aparece una banda estrecha cercana al pocillo en el

que se cargó la mezcla de ADN.
Si el ADN está fragmentado, aparece una banda de más de 1cm de ancho o
un sendero luminoso en el carril de la muestra.
ESTIMACIÓN DE LA CALIDAD DEL ADN.

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Para realizar esta

comprobación, se prepara un
gel de agarosa con un patrón
determinado de carriles.

CARRIL 1: marcador del peso

molecular.
CARRILES 2 y 3: vacíos.
CARRILES 4 y 7: muestras
con poca fragmentación.
CARRIL 6: muestra íntegra.
 CONSERVACIÓN DEL ADN.
El precipitado seco de ácidos nucleicos (denominado “ovillo de ADN”)
puede disolverse en una disolución amortiguadora y conservarse a
4°C, disolverse en agua y mantenerse congelado para su uso posterior
o mantenerse a -20°C para que no se degrade si no se va a utilizar de
manera inminente.
 CONSERVACIÓN DEL ARN.
El ARN es una molécula más difícil de manejar y debe conservarse de -
70°C a -80°C por su fragilidad. Se conserva en una disolución acuosa
que incluye inhibidores de ribonucleasas. No obstante, con el tiempo,
se degrada. Para plazos mayores, se recomienda conservarlo en
etanol.
 AUTOMATIZACIÓN DE LOS PROCESOS.
En la actualidad, existen robots que permiten la purificación de ácidos
nucleicos de manera automatizada, incluso en muestras parafinadas.
Son ideales para laboratorios con mucha carga de trabajo pues
permiten procesar muchas muestras a la vez.
 OCTAVA PARTE.
Fundamentos técnicos de la extracción
de ácidos nucleicos.
 PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
Técnicas de purificación de ANs

Separación de Separación de
ADN ARN

Extracción salina Tiocinato de

guanidino-fenol-
cloroformo
Fenol-cloroformo-
alcohol isoamílico
Trizol
 ELIMINACIÓN DE PROTEÍNAS.
En la purificación del ADN es fundamental la eliminación de proteínas
asociadas que interfieren con los procesos de amplificación del ADN
en la PCR. Para evitar daños en la integridad de la estructura del ADN,
se emplean reactivos que no provoquen roturas y lo mantengan lo más
intacto posible.
 TÉCNICAS MANUALES.
En las células, el ADN está asociado a proteínas. Ambos tipos de
moléculas debe ser liberados para que las enzimas empleadas en los
procesos de extracción puedan acceder a ellos.
 TÉCNICAS MANUALES: pasos.

1 Lisis celular.
 TÉCNICAS MANUALES: pasos.

2 Digestión proteica: proteinasa.

 TÉCNICAS MANUALES: pasos.

3 Eliminación de los péptidos del lisado mediante

extracción orgánica.
 Técnica de extracción salina (salting-out).
Se basa en que las proteínas son menos solubles a altas concentraciones
de sal de modo que precipitan mientras que el ADN se mantiene en la
disolución. Se emplean sales como los acetatos que optimizan este
efecto.
 Técnica de extracción salina (salting-out).
1 Lavado de las células con suero fisiológico o
PBS.
 Técnica de extracción salina (salting-out).
2 Lisis de los eritrocitos.
Se emplea un tampón de lisis de eritrocitos con el que se
incuba la muestra.
 Técnica de extracción salina (salting-out).
3 Lisis de los leucocitos.
Se emplea un tampón de lisis de leucocitos para facilitar la
liberación de los ácidos nucleicos.
 Técnica de extracción salina (salting-out).
4 Digestión de proteínas.
Normalmente, se emplea la proteinasa K en un tampón
adecuado.
 Técnica de extracción salina (salting-out).
5 Extracción salina.
Se emplea NaCl saturado e isopropanol.
 Técnica de extracción salina (salting-out).
6 Conservación de la muestra.
En etanol y tris-EDTA.
 Técnica del fenol-cloroformo-alcohol isoamílico.
Los ácidos nucleicos, al contrario que otras sustancias bioquímicas, no
son solubles en fenol. El cloroformo y el fenol “atrapan” los lípidos y
proteínas dejando libre al ADN disuelto en agua.
 Técnica del fenol-cloroformo-alcohol isoamílico.
La disolución proteinasa K/SDS elimina las proteínas. El fenol/cloroformo
procura la separación de las fases acuosa y orgánica y el
isoamilalcohol impide la formación de espuma.
Técnica del fenol-cloroformo-alcohol isoamílico. Protocolo.
 EXTRACCIÓN DE ARN.
En las técnicas de extracción del ARN es importante eliminar el ARNr y el
ARNt pues no son útiles en el análisis de expresión y cuantificación
génica y mantener la integridad de la estructura por lo que se deben
usar reactivos respetuosos con ella. También es importante obtener
una cantidad suficiente de ARN de buena calidad.
 EXTRACCIÓN DE ARN.
Las técnicas generales constan de las siguientes etapas:
1. Lisis eficaz de las células y desnaturalización de los complejos de
nucleoproteínas que se encuentran en los extractos celulares.
2. Inactivación de la actividad de las ribonucleasas dentro de la célula.
3. Eliminación de las proteínas (cuando quiere aislarse ARN se deben eliminar las
ribonucleasas).
4. Eliminación del ADN contaminante de las células.
5. Elución del ARNm.
 EXTRACCIÓN DE ARN.
Durante la extracción del ARNm, se deben tomar una serie de
precauciones:
• Las superficies de trabajo deben tratarse con inhibidores de ribonucleasas
(EtOH 70%+RNAse Zap).
• Evitar la contaminación corporal por parte del técnico mediante empleo de
guantes estériles y cambiarlos con frecuencia, emplear material fungible y
reactivos certificados libres de nucleasas y no realizar la limpieza en autoclave.
 Técnica del tiocianato de guanidino/fenol/cloroformo.
El tiocianato de guanidino es un inhibidor de las ribonucleasas. La técnica
es cada vez menos frecuente. Se trabaja con placa leucoplaquetar o
buffy-coat. Esta es llevada a un tubo con disolución D que contiene los
diferentes componentes de la muestra.
 Técnica del trizol.
Es una variación de la anterior pero se emplea trizol en lugar de citrato de
sodio y fenol.