Unidad 6 – Técnicas de PCR

6.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica in vitro de amplificación de ADN que
permite obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto de ADN, partiendo de una cantidad
mínima de ADN molde.
En un principio la PCR se diseñó para amplificar un único fragmento corto de ADN presente en una
molécula mucho mayor, el desarrollo posterior de la técnica ha permitido amplificar fragmentos de gran
tamaño (hasta 35 kb) y se han desarrollado diferentes variantes
Las ventajas:
• Como técnica de amplificación. Respecto a las técnicas de clonación en vectores mediante
tecnología de ADN recombinante suponen un considerable ahorro de tiempo (la PCR tiene lugar
en horas, mientras que la clonación requiere días de trabajo) y además están completamente
automatizadas (la clonación es un proceso manual).
• Como técnica de detección. Respecto a las técnicas de hibridación la PCR requiere una cantidad
de muestra mucho menor y además, permite la cuantificación de secuencias concretas (PCR en
tiempo real).
Post PCR (Extra)
En los principios se empezó con la ADN polimerasa, dNTps (nucleótidos), cebadores, y se realizaba en
baños:
• Uno en el que sabíamos la temperatura, para desnaturalizar el ADN.
• Otro en el que se disminuía, para la unión de los cebadores, y acción de la ADN polimerasa.
• Y una vez terminado, se volvía a empezar
Surgían problemas:
• Al mantener la temperatura alta, durante mucho tiempo, la ADN polimerasa se desnaturalizaba.
• Así, apareció la Taq polimerasa, hoy en día comercial, que aguanta hasta 92ºC.
6.2. Bases teóricas de la PCR
La PCR es un proceso enzimático, catalizado por una ADN polimerasa, basado en la replicación de ADN.
Consiste en repetir secuencialmente ciclos de replicación de ADN in vitro, de manera que a partir de una
única molécula de ADN molde se obtienen múltiples copias.
¡Tenlo en cuenta! La ADN polimerasa no inicia la síntesis de una nueva cadena de ADN, sino que elonga
una preexistente.
Este diseño repetitivo es la clave de la amplificación puesto que las copias nuevas obtenidas en cada
ciclo sirven también de molde para sintetizar otras copias nuevas en los ciclos siguientes, produciéndose
un aumento exponencial en el número de copias a cada ciclo de replicación sucesivo que se realice.
Ahora bien, para conseguir esto hay que solucionar dos problemas.
• ¿Cómo conseguir que en cada ciclo de la técnica únicamente se copie (se replique) el fragmento
que nos interesa, entre una mezcla compleja de moléculas de ADN? Mediante el diseño de
cebadores específicos que permiten la amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN.
• ¿Cómo conseguir que no se produzca la inactivación de la ADN polimerasa por la temperatura
elevada que es necesaria en la fase de desnaturalización del ADN molde? Mediante el
descubrimiento de ADN polimerasa termoestables.
6.2.1. Los Cebadores o Primers
Los cebadores son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria de las regiones
que flanquean el fragmento que se quiere amplificar.
Se diseñan siempre por parejas y cada uno es complementario de una secuencia adyacente a la región
de interés pero en extremos y cadenas opuestas.
• El cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 3´→ 5´ se denomina cebador F
o forward.
• El que se va unir a la hebra molde que tiene dirección 5´→ 3´ se denomina cebador R o «reverse».
Un juego de cebadores define y delimita la región diana de una molécula de ADN que se va amplificar,
que será la comprendida entre ambos. Es decir, fijan la especificidad de la reacción, haciendo posible la
amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN de entre una mezcla compleja de moléculas.
Por supuesto que para conseguir este objetivo, su secuencia debe ser única en el ADN que se estudia.
Requisitos que deben cumplir los cebadores
• Longitud. Comprendida entre 18 y 30 nucleótidos. Por debajo de 15 nucleótidos carecen de
especificidad y determinan la aparición de productos amplificados no específicos; por encima de
35 nucleótidos se unen peor al ADN molde y disminuye el rendimiento de la reacción.
• Composición de bases. Los mejores resultados se obtienen con cebadores con un contenido en
G + C comprendido entre 40 - 60%.
• Secuencia. Los cebadores no deben contener secuencias complementarias intra e
intermoleculares, para evitar la formación de estructuras secundarias del tipo de horquillas y la
formación de dímeros de cebadores.
• Temperatura de fusión. La Tm de los cebadores debería estar en el rango 52 - 65°C. Además.
La diferencia entre las Tm de los dos cebadores de una pareja debe ser inferior a 5°C, para que
se unan con la misma eficiencia al ADN molde.
6.2.2. ADN polimerasas termoestables
Para que la ADN polimerasa pueda sintetizar cadenas nuevas de ADN es necesario que el ADN molde
sea monocatenario. Esto hace que cada ciclo de la PCR tenga que comenzar por una fase de
desnaturalización por calor, lo que supone un problema para las ADN polimerasas convencionales puesto
que son termolábiles, es decir, se inactivan a temperaturas elevadas.
En los primeros experimentos para diseñar la técnica, esta dificultad se superaba añadiendo enzima
nueva en cada ciclo, lo que la convertía en una técnica costosa, larga, con alto riesgo de contaminación
y fácilmente automatizable.
El hecho que posibilitó un desarrollo espectacular de la PCR en poco tiempo fue el descubrimiento de las
ADN polimerasas termoestables.
Las ADN polimerasas termoestables son enzimas aisladas de un grupo especial de arqueobacterias
extremófilas (termófilas), con actividad polimerasa a temperaturas elevadas.
Al igual que las ADN polimerasas bacterianas convencionales, estas enzimas catalizan la incorporación
de nucleótidos en dirección 5' → 3' a partir de una pequeña región con doble hélice utilizando como molde
un ADN monocatenario y en presencia de iones magnesio (Mg2+), pero tienen dos características
diferenciales que las hacen idóneas para su uso en PCR.
• Realizan su actividad polimerasa a una temperatura óptima comprendida entre 70 y 75 °C. Esto
permite hibridar los cebadores al ADN molde a temperaturas relativamente elevadas, fijando unas
condiciones de alta rigurosidad, lo cual maximiza la especificidad de la reacción.
• Tienen capacidad de mantener su actividad polimerasa tras tiempos prolongados de incubación
a 95 °C (alrededor de 40 minutos), lo que garantiza que la enzima no se va a inactivar durante las
fases de desnaturalización del ADN.
Las ADN polimerasas termoestables se pueden clasificar en función de sus capacidades enzimáticas
secundarias. Estas pueden ser:
• Actividad exonucleasa 5' → 3', pero sin actividad exonucleasa 3' → 5'. Además de la actividad
polimerasa tienen actividad exonucleasa 5-3*, pero carecen de actividad exonucleasa 3' → 5'. Esto
hace que no sean capaces de corregir errores (eliminar nucleótidos mal incorporados). Es el caso
de la Taq ADN polimerasa que tiene una tasa de error de aproximadamente 1 por cada 100.000
nucleótidos incorporados.
• Actividad exonucleasa 5' → 3' y actividad exonucleasa 3' → 5'. Son enzimas con actividad
correctora, ya que detectan cuando se incorpora un nucleótido erróneo (con una base nitrogenada
no complementaria de al correspondiente en el ADN molde), lo eliminan y continúan la elongación
de la cadena incorporando el nucleótido correcto.
Son especialmente útiles para aplicaciones de PCR que requieren alta fidelidad de replicación,
tales como amplificación de secuencias para análisis de mutaciones por secuenciación o para
estudios de expresión.
 • Actividad transcriptasa inversa. Algunas ADN polimerasas termoestables tienen capacidad
para utilizar ARN como molde, es decir, presentan actividad transcriptasa inversa en presencia de
iones manganeso (Mn2+), por lo que pueden utilizarse para sintetizar y amplificar ADNc a partir
de ARN.
6.2.3. El ciclo básico de PCR
Como ya se ha mencionado, la PCR se basa en la repetición secuencial de ciclos de replicación. Cada
ciclo consta de tres fases:
1. Desnaturalización del ADN molde.
2. Hibridación de los cebadores con el ADN molde.
3. Extensión de los cebadores.
El resultado final de cada ciclo es la síntesis de una molécula de ADN nueva por cada fragmento de ADN
molde presente en la mezcla de reacción. Esta molécula de ADN nueva servirá también de molde en el
siguiente ciclo.
FASE I. Desnaturalización
La desnaturalización debe ser lo suficientemente larga y a una temperatura suficientemente elevada para
garantizar la desnaturalización completa del ADN molde, sin prolongarse excesivamente para evitar la
inactivación de la ADN polimerasa. Por ejemplo, la Taq ADN polimerasa pierde actividad cuando es
sometida a 95 °C por un tiempo prolongado de más de 40 minutos.
Normalmente, la fase de desnaturalización se realiza a 94 - 95 °C durante 15-30 segundos.
FASE II. Hibridación
La hibridación de los cebadores con el ADN molde (annealing, en inglés) se realiza habitualmente a una
temperatura de entre 50 y 65 °C. El valor concreto depende de la Tm de los cebadores y suele estar
comprendido en el rango Tm +-5 °C.
• Temperaturas de hibridación más elevadas que la Tm de los cebadores, implican mayor
rigurosidad y, en consecuencia, mayor especificidad (menor hibridación inespecífica de los
cebadores y disminución de la cantidad de productos no deseados). El inconveniente es un
rendimiento menor.
• Temperaturas de hibridación más bajas que la Tm de los cebadores se pueden traducir en un
mayor rendimiento de la hibridación, ya que los cebadores hibridan más eficientemente. El
inconveniente es la posible aparición de productos no deseados por hibridación inespecífica de
los cebadores.
FASE III. Extensión
La extensión o elongación de los cebadores por la ADN polimerasa copiando la hebra molde se realiza a
la temperatura óptima de polimerización de la enzima empleada, que en el caso de la Taq ADN polimerasa
es de 72 °C.
El tiempo de la fase de extensión está condicionado por la velocidad de polimerización de la enzima y la
longitud del fragmento que se quiere amplificar. La Taq ADN polimerasa, por ejemplo, tiene una velocidad
de polimerización de alrededor de 60 nucleótidos/segundo.
6.2.4. Productos de amplificación de la PCR
Tras un número n de repeticiones del ciclo básico de PCR se obtienen varios tipos de productos de
amplificación, unos deseados y otros no deseados, pero en proporciones muy diferentes.
Amplicones: productos deseados, que coinciden con el fragmento que queremos amplificar.
6.3. PCR a tiempo final
En principio, la PCR se concibió como una técnica de amplificación a tiempo final, ya que el resultado de
la reacción no se conoce hasta que se termina y se analizan sus productos mediante electroforesis.
6.3.1. PCR estándar o convencional
La PCR estándar, convencional o básica es la forma más simple de PCR, en la que se amplifica un
único fragmento de ADN, con un único par de cebadores y en un único proceso de amplificación a tiempo
final.
La mezcla de reacción
La mezcla de reacción contiene todos los reactivos necesarios que deben estar presentes en el medio
de reacción para que la PCR se desencadene de forma adecuada.
Consiste en un tampón adecuado que contendrá disueltos todos los reactivos necesarios para la
replicación del ADN. El tampón aporta el pH y la concentración salina adecuados para la óptima actividad
de la ADN polimerasa con un máximo de fidelidad.
Suelen ser tampones a base de Tris con cloruro potásico (KCI), a un pH de entre 8,3 y 9,0. Normalmente,
el tampón de reacción adecuado s e suministra en forma concentrada (2x, 5x o 10x) conjuntamente con
la ADN polimerasa.
Los reactivos que se disuelven en el tampón son principalmente: cloruro magnésico, desoxinucleótidos
trifosfato, cebadores, ADN polimerasa y ADN molde.
Cloruro magnésico
Las ADN polimerasas termoestables requieren iones de magnesio (Mg2+) como cofactor para desarrollar
su actividad. Estos iones se aportan a la mezcla de reacción en forma de cloruro magnésico (MgCI2).
• La ausencia o una concentración excesivamente baja de Mg2+ libre en la mezcla de reacción
determina la inactividad la ADN polimerasa.
• Una concentración excesivamente alta determina una menor fidelidad en la replicación.
Cada ADN polimerasa tiene una concentración óptima de Mg2+ libre para su buen funcionamiento.
Desoxinucleótidos Trifosfato
La mezcla de reacción debe contener los cuatro desoxinucleótidos que componen las moléculas de ADN
en forma de desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) para que la ADN polimerasa pueda usarlos como
sustrato.
Los Cuatro dNTP deben estar presentes en la misma concentración, pues en caso contrario disminuye la
fidelidad de la enzima. Se Suministran concentrados en una concentración total 10mM (2,5 mM de cada
pNTP). La concentración final estándar en la mezcla de reacción de cada dNTP es 200 µM.
Cebadores
Como se ha mencionado anteriormente, los cebadores son claves para realizar una amplificación
específica con éxito. La concentración final de cada cebador en la mezcla de reacción debe ser la misma
y debe establecerse de forma experimental para cada pareja.
Como referencia, concentraciones finales de entre 200 y 400 nM de cada cebador suelen dar buenos
resultados.
ADN polimerasa
La ADN polimerasa es el otro reactivo clave para realizar una PCR con éxito. La elección de una u otra
ADN polimerasa dependerá de la fidelidad requerida en la amplificación, de la longitud del fragmento que
se va a amplificar y, en ocasiones, de la secuencia que se va a amplificar.
ADN molde
El ADN molde es un componente imprescindible de la mezcla de reacción, ya que contiene el fragmento
de interés que se quiere amplificar. Normalmente se utiliza ADN purificado.
Para que la PCR se desarrolle de manera óptima, hay que tener en cuenta tanto la calidad como la
cantidad del ADN molde.
• Calidad del ADN molde. En condiciones ideales, el ADN molde para PCR dedecumplir los
siguientes criterios de calidad:
• Alto grado de integridad, es decir, ADN de alto peso molecular, no degradado ni
fragmentado y sin mellas.
• Cociente A260/A280 entre 1,7 y 2,0, lo que garantiza que no está contaminado con
proteínas.
• Libre de contaminantes que puedan inhibir la reacción de PCR, bien por inactivación de la
ADN polimerasa, bien por secuestro del Mg2+ libre.
 • Cantidad de ADN molde. La cantidad idónea para obtener los mejores resultados en una PCR
dependerá de la complejidad del ADN que se estudia. Cuanto más sencillo el ADN hará falta
menos cantidad. No es aconsejable sobrepasar los 10 ng de ADN/µl de mezcla de reacción, o lo
que es lo mismo, los 500 ng de ADN molde para un volumen de reacción final de 50µl.
Otros aditivos y potenciadores
En ocasiones el rendimiento de la PCR es bajo o aparecen amplificados productos no deseados. En estos
casos se pueden añadir a la mezcla de reacción diversos aditivos que actúan como potenciadores de la
PCR, aumentando el rendimiento de la reacción o disminuyendo la aparición de productos no deseados.
Preparación de las muestras
Ajuste del volumen de reacción
Al diseñar una PCR, hay que decidir el volumen final de mezcla de reacción en el que se llevará a cabo
al reacción. Normalmente este volumen es de 25 o 50 µl. Se suministran concentrados, hay que calcular
los volúmenes de cada reactivo que se añadirá a la mezcla, dependiendo de la concentración final que
queramos obtener. La diferencia entre la suma de los volúmenes de cada componente y el volumen final
de mezcla de reacción se completa con agua estéril grado PCR.
Mezcla «máster»
Como normalmente se realizan múltiples reacciones simultáneamente, los posibles errores cometidos en
cada tubo son distintos, por lo que las distintas PCR se realizarán en condiciones diferentes.
Para evitar este problema y conseguir que la composición de la mezcla de reacción sea homogénea para
todas las pruebas que se realicen simultáneamente, es preferible preparar una única mezcla de reacción,
denominada mezcla máster (máster mix en inglés), que incluya todos los componentes, excepto el ADN
molde.
La cantidad de cada componente se calcula multiplicando la cantidad necesaria para una reacción por el
número de muestras que se van a procesar simultáneamente +1 (incluye los controles + y -).
Programación del termociclador
El termociclador es el aparato en el que se lleva a cabo la reacción de PCR. Permite programar los ciclos
repetitivos con varias temperaturas y tiempos de incubación para cebadores que se desarrollen de forma
automatizada. Esta programación incluye tres etapas principales, que terminan con una incubación final
para el mantenimiento de los productos de la reacción hasta su retirada de la máquina.

Figura: esquema de la programación de un

termociclador para realizar una PCR estándar.

1. Desnaturalización inicial. Es la etapa que inicia la reacción de PCR. Consiste en calentar la

mezcla de reacción a 94-95ºC durante varios minutos para asegurar la completa desnaturalización
de todas las moléculas bicatenarias de ADN presentes en la mezcla de reacción.
2. Ciclos de replicación.
a. Las temperaturas y los tiempos de incubación de cada una de las fases del ciclo básico de
PCR: desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión.
b. El número de veces que se va a repetir el ciclo, es decir, el número de ciclos de replicación.
El número de ciclos de replicación va a depender del número inicial de copias del fragmento que se quiere
amplificar en la muestra en estudio. Cuanto más abundante sea el fragmento que se va a amplificar,
menor número de ciclos de replicación serán necesarios para acumular una cantidad suficiente de
amplicones. Típicamente, el número de ciclos oscila entre 25 y 35, aunque para moldes escasos o
problemáticos se pueden aumentar hasta 40. Por encima de 40 ciclos aumenta considerablemente la
probabilidad de que aparezcan productos no deseados inespecíficos y el ADN polimerasa pierde actividad
por el tiempo acumulado a temperaturas de desnaturalización.
3. Extensión final. Es la etapa que finaliza la reacción de PCR. Consiste en una incubación única a
la temperatura óptima de polimerización del ADN polimerasa durante 5-10 minutos, para
asegurarnos de que todos los productos de PCR están completos y en forma de doble hélice.
4. Mantenimiento. La programación del termociclador finaliza siempre con una última incubación a
4°C sin límite de tiempo para mantener las muestras hasta que se retiren del termociclador,
anulando la actividad de la enzima.
Análisis de los productos amplificados
Mediante una electroforesis en gel. La presencia de una única banda del
tamaño adecuado indica que la PCR ha funcionado correctamente. La
observación de varias bandas de distintos tamaños indica la presencia de
productos de amplificación no deseados. Esto es debido a que durante la
PCR se han amplificado inespecíficamente fragmentos de ADN distintos
de la diana específica, por lo que habrá que repetir la reacción variando
al programación del termociclador o la composición de la mezcla de
reacción hasta conseguir un resultado específico.
• Línea:1 blanco (no se observa ninguna banda).
• Línea 3 marcador de tamaños (incrementos de 100 pb).
• Líneas 4-15: muestras problema.
Todas las muestras contienen la secuencia investigada de 630 pb (resultado positivo). No se observan
bandas inespecíficas de productos no deseados.
Resultado positivo
Cuando al PCR se realiza con fines exclusivos de detección, la observación de una banda específica es
suficiente para afirmar que la secuencia diana está presente en la muestra que se estudia y garantizar
por tanto un resultado positivo. Pero si existieran problemas de contaminación en la mezcla máster,
¿cómo descartar que no se trate de un falso positivo? (con control negativo). La calle correspondiente al
blanco debe aparecer limpia, sin bandas. Si en el blanco se detecta alguna banda, ello indicaría
contaminación de algún reactivo o pipeta que se hayan usado en la técnica, lo que invalida los resultados.
Resultado negativo
La ausencia de banda específica en una muestra problema indica, a priori, que la muestra no contiene la
secuencia diana, y por tanto, el resultado sería negativo. Pero, realmente, esta no es condición suficiente
para afirmar que el resultado es negativo, puesto que algún reactivo empleado puede no funcionar
correctamente o la muestra puede contener inhibidores de la PCR. ¿Cómo se descartan estas
posibilidades? (Con control positivo)
Si todos los reactivos funcionan bien, en el control positivo se observará la banda específica. En caso
contrario hay algún problema en la mezcla máster y se invalida la tanda. Para descartar la presencia de
inhibidores en una muestra hay que realizar un control positivo de la muestra, consistente en una nueva
PCR en la que se amplifica un gen control presente en la muestra. Si este control amplifica bien, se
confirma que la muestra es negativa para la secuencia que se estudió inicialmente. Si el control positivo
de la muestra no se amplifica, la muestra no es apta para PCR.
6.3.2. Modalidades de la PCR estándar
La PCR estándar se utiliza mayoritariamente con fines diagnósticos, amplificando secuencias menores
de 3,5 kb, para lo que las condiciones descritas hasta ahora suelen dar buenos resultados.
Sin embargo, el intento de minimizar la producción de productos no deseados o la necesidad de amplificar
fragmentos de gran tamaño o con gran fidelidad para otras aplicaciones ha derivado en el desarrollo de
variantes o modalidades de la PCR estándar adaptadas a cada necesidad, como:
• La PCR con inicio en caliente.
• La PCR de grandes fragmentos.
• La PCR de alta fidelidad.
PCR con inicio en caliente
Aunque las ADN polimerasas utilizadas en PRC tienen una temperatura óptima de acción alrededor de
los 70 °C, muestran también una actividad polimerasa residual a temperaturas inferiores.
Esto hace que durante el proceso de preparación de la mezcla de reacción, en el transporte hasta el
termociclador y durante la rampa ascendente de la temperatura hasta alcanzar por primera vez la
temperatura de desnaturalización, se puedan generar productos de amplificación inespecíficos no
deseados.
Esto se puede lograr usando varias estrategias:
• Preparando la mezcla de reacción sin ADN polimerasa. Es la forma más sencilla. Se prepara
la mezcla de reacción sin la ADN polimerasa, se dispensa en los tubos y estos se colocan en el
termociclador. Se añade la enzima tubo a tubo una vez que la temperatura del termociclador esté
por encima de los 65 °C.
• Aislando la ADN polimerasa del resto de los componentes de la mezcla. Consiste en
mantener la enzima aislada del resto de componentes de la mezcla hasta que se alcance una
temperatura elevada. El aislamiento se consigue, por ejemplo, incluyendo la ADN polimerasa en
el interior de esferas de cera.
• Suministrando la ADN polimerasa inactiva. Esto se consigue bloqueándola con un anticuerpo
específico, o bien, modificando químicamente mediante unión termolábil a un grupo bloqueante.
PCR de grandes fragmentos
El rendimiento de la PCR estándar suele disminuir drásticamente cuando se amplifican fragmentos
mayores de 5kb. La explicación se debe a la acumulación de productos truncados, más cortos que el
amplicón específico y que, por lo tanto, no pueden ser usados como molde en los siguientes ciclos.
Estos productos truncados se producen probablemente por la incorporación de nucleótidos erróneos que
ralentizan o detienen directamente la polimerización.
La mezcla de reacción
Las variaciones de composición en la mezcla de reacción respecto a las que se han visto en la PCR
convencional son:
• Mezcla de ADN polimerasas. Es la modificación más importante. Consiste en la utilización de
una mezcla de dos ADN polimerasas termoestables:
• Una ADN polimerasa mayoritaria (elevada concentración) sin actividad correctora.
• Otra minoritaria (baja concentración) con potente actividad correctora (actividad
exonucleasa 3'→ 5').
• Uso de aditivos. En la mezcla de reacción se suelen incluir aditivos como el glicerol, que estabiliza
las ADN polimerasas y el dimetilsulfóxido (DMSO), que favorece la desnaturalización.
• Concentraciones bajas de potasio en el tampón de reacción. Experimentalmente, se ha
demostrado que concentraciones más bajas de potasio favorecen la eficiencia de la amplificación
de fragmentos largos.
La programación del termociclador
Es evidente que para polimerizar con éxito fragmentos de gran tamaño en el momento de programar el
termociclador hay que aumentar considerablemente el tiempo de extensión en cada ciclo, Dependiendo
de la longitud del fragmento que se va a amplificar se pueden programar tiempos de extensión de hasta
25 minutos.
Por el contrario, los tiempos de desnaturalización se acortan (2-10 segundos) para minimizar la
inactivación de las polimerasas.
PCR de alta fidelidad
Para algunas aplicaciones a las que van a ser destinados los productos de PCR, como expresión génica
o clonación, se requiere una PCR de alta fidelidad.
En estos casos conviene realizar variaciones en las condiciones estándar de la composición de la mezcla
de reacción. Estas son:
• Utilización de ADN polimerasas termoestables con actividad correctora
 • Favorecer las condiciones óptimas de mayor fidelidad de la enzima, ajustando:
• El pH de la mezcla de reacción en función de las enzimas.
• La concentración de Mg+2. Un exceso suele disminuir la fidelidad de las polimerasas.
6.3.3. Otras técnicas de PCR a tiempo final
Su función es incrementar en gran medida las aplicaciones de la PCR.
PCR anidada
La PCR anidada (nested-PCR en inglés), consiste en la realización de dos reacciones PCR acopladas,
de manera que la segunda PCR utiliza como ADN molde los productos de amplificación de la primera.
Se usa para aumentar la sensibilidad en los casos en que el rendimiento de la PCR estándar es bajo o
para aumentar la especificidad en casos en que no es posible evitar el acúmulo de productos no deseados
con una PCR estándar.
PCR múltiple
La PCR múltiple (multiplex-PCR en inglés) consiste en la amplificación de varias secuencias diana a la
vez, en el mismo tubo, en una sola reacción de PCR.
Se consigue utilizando varios juegos de cebadores, cada uno específico para amplificar una región
diferente. Estas parejas de cebadores tienen que cumplir varios requisitos:
• La temperatura óptima de todos los cebadores para hibridar con su diana debe ser similar.
• Los amplicones generados por cada pareja de cebadores deben tener un tamaño suficientemente
diferente para poder separarse en la electroforesis.
• Deben diseñarse de manera que no puedan hibridar unos con otros formando dímeros u
oligómeros.
La aplicación más sencilla es la incorporación de un control positivo interno en una reacción de detección.
El control positivo interno consiste en añadir a la mezcla de reacción una pareja de cebadores diseñados
para amplificar una secuencia control que tiene que estar presente en el ADN molde problema. Tres
resultados serían posibles:
• Positivo. Se observan dos bandas en la electroforesis: la específica de la secuencia que se está
estudiando y la del control positivo.
• Negativo. Se visualiza solo la banda del control positivo
• PCR no válida. No se observa ninguna banda, lo cual indica que al muestra contiene inhibidores
de la PCR.
PCR con transcripción inversa (RT-PCR)
La PCR con transcripción inversa o RT-PCR (del inglés reverse transcription-PCR) permite amplificar y
analizar moléculas de ARN. Los pasos son:
1. Un paso previo de síntesis de ADNc mediante una retrotranscriptasa (RT) o transcriptasa inversa.
2. Un segundo paso en el que una ADN polimerasa termoestable utiliza el ADNc como molde y lo
amplifica.
Estos dos pasos se pueden realizar en dos tubos independientes o en un mismo tubo.
Las RT, al igual que las ADN polimerasas, necesitan cebadores que formen una pequeña región de doble
hélice en el ARN molde para poder sintetizar el ADNc. Una estrategia es usar como cebador un oligo-dT,
que hibridará con las colas poli-A de los ARNm presentes en la muestra. Con esta estrategia se
transcriben a ADNc todas las moléculas de ARNm presentes en la muestra.
6.4. PCR a tiempo real
En la PCR a tiempo real se monitoriza el proceso de amplificación mediante el empleo de productos
fluorescentes, de manera que la detección de los amplicones se realiza ciclo a ciclo.
Se realiza en un termociclador a tiempo real, que incorpora un lector de fluorescencia, de manera que
puede medir la intensidad de fluorescencia en cada tubo de reacción en cualquier momento de la PCR
Ventajas:
• Mayor rapidez en la detección cualitativa de secuencias diana en una muestra.
• Resultados más fidedignos, puesto que la detección instrumental de fluorescencia es más objetiva
y sensible que la tinción con bromuro de etidio de un gel de electroforesis.
• Minimiza los problemas de contaminación, ya que tanto la amplificación como la detección se
realizan en el mismo tubo cerrado.
• Dado que la intensidad de fluorescencia va a ser proporcional al ADN sintetizado, la PCR a tiempo
real permite la cuantificación de los amplicones producidos y del ADN diana inicial presente en la
muestra.
6.4.1. Cinética de la amplificación
Se puede estudiar mediante las curvas de amplificación
La curva de amplificación es una curva de tipo sigmoide que se obtiene al representar la emisión de
fluorescencia en cada ciclo de PCR respecto del número de ciclo en que se produce.
La curva tiene tres zonas claramente diferenciadas:
• Zona o fase de ruido, el número de amplicones sintetizados está por debajo del nivel de detección
del aparato.
La amplitud de esa zona de la curva va a depender de la cantidad de secuencias diana en la
muestra. Cuanto menor es el número de secuencias diana en la muestra, más ciclos se necesitan
para obtener un número de amplicones por encima del nivel de detección del aparato.
• Zona o fase de crecimiento exponencial, corresponde a la auténtica fase exponencial de
producción de amplicones.
• Zona o fase de meseta. También lineal pero de pendiente reducida, por agotamiento de sustratos,
pérdida progresiva de la actividad polimerasa, saturación de la enzima, etc.

Figura: Curva de amplificación característica de una PCR a

tiempo real: a) zona de ruido, correspondiente a ciclos en los
que la cantidad de amplicón específico se encuentra por
debajo del límite de detección del termociclador (umbral); b)
zona de crecimiento exponencial; c) zona de meseta.

6.4.2. Sistemas fluorescentes de detección de amplicones

Sistemas de detección independiente de secuencia
Los sistemas de detección independiente de secuencia se basan en el empleo de agentes
fluorescentes intercalantes.
La medida de la fluorescencia se realiza al final de cada ciclo de amplificación, al terminar la fase de
extensión, porque en ese momento todos los amplicones se encuentran en forma de doble hélice.
El principal inconveniente es su baja especificidad, ya que el agente intercalante se une a cualquier
molécula de ADN en doble hélice.
Sistemas de detección específicos de secuencia
Los sistemas de detección específicos de secuencia se basan en la utilización de sondas
oligonucleotídicas marcadas con fluorocromos que hibridan de manera específica en la región central del
amplicón.
• Sondas de hidrólisis
• Balizas moleculares
• Sondar RET
6.4.3. Aplicaciones de la PCR a tiempo real
PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR)
La PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR), es una aplicación de la tecnología PCR a tiempo real que
permite cuantificar la cantidad inicial de una molécula de ácido nucleico en una muestra.
Para realizar este cálculo, el termociclador a tiempo real detecta el llamado punto de corte (Cp) o ciclo
umbral (Ct).
El punto de corte (Cp) (del inglés crossing point) o ciclo umbral (Ct) (del inglés threshold cycle) es el
ciclo de PCR en el cual la fluorescencia de la muestra alcanza un valor por encima del límite de detección.
En la curva de amplificación el Cpes el ciclo en que se pasa de la zona de ruido a la de crecimiento
exponencial, mediante un giro brusco hacia arriba.
El Cp de una muestra es inversamente proporcional a la cantidad inicial de la molécula diana en la
muestra. Cuanto mayor sea el número de secuencias diana en la muestra, menos ciclos de PCR serán
necesarios para alcanzar el cross point (Cp).
Cuantificación absoluta
Las pruebas de cuantificación absoluta expresan el resultado final (cantidad de secuencia diana en la
muestra) en unidades de concentración (por ejemplo, µg/µl) o en número de copias por unidad de
volumen.
Este tipo de cuantificación requiere la elaboración de una curva de calibración con patrones que tengan
una concentración o número de copias conocido.
Estas pruebas son muy útiles para cuantificar cargas virales, respuestas a tratamientos (control de
eficacia de fármacos), estudios de cuantificación de expresión génica, etc.
Cuantificación relativa
La cuantificación relativa consiste en expresar la concentración de la secuencia diana en relación con
la concentración de un gen de referencia que está presente en todas las muestras con un número
constante de copias.
En este tipo de pruebas no es necesaria una curva de calibración con patrones.