bio

UNIDAD
BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

unidad8:7:TÉCNICAS
técnicasDE
dePCR
pcr
1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
§ Reacción en cadena de la polimerasa o PCR
o En inglés Polymerase Chain Reaction
o Técnica in vitro de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias iguales de un
fragmento concreto de ADN, partiendo de una cantidad mínima de ADN molde
o Permite amplificar fragmento de gran tamaño hasta 35kb
§ Hay diferentes variantes que permiten:
o PCR múltiple: Amplificar distintos fragmentos en una única reacción
o RT-PCR: Amplificar fragmentos de ARN
o PCR cuantitativa, PCR a tiempo real: Cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido
nucleico presente en una muestra
§ Ventajas como técnica de amplificación respecto a la clonación mediante ADN recombinante:
o Considerable ahorro de tiempo (la PCR tiene lugar en horas, mientras que la clonación requiere días de
trabajo)
o Están completamente automatizadas (la clonación es un proceso manual)
§ Ventajas como técnica de detección respecto a las técnicas de hibridación:
o La PCR requiere de una muestra mucho menor
o Permite la cuantificación de secuencias concretas → PCR en tiempo real
§ Desventajas:
o Elevado riesgo de contaminación por ADN exógeno:
* Aerosoles
* Microorganismos ambientales
* Células de descamación
* Material amplificado anteriormente
o Esto es debido a que es una técnica con una alta sensibilidad
§ Aplicaciones:
o El diagnóstico y pronóstico de ciertas enfermedades
o La evolución y respuesta a tratamientos
o Los estudios de expresión génica
o Mutagénesis
o Estudios filogenéticos
o Genotipado
o Medicina foren
§ La PCR es un proceso enzimático, catalizado por una ADN polimerasa basado en la replicación del ADN
§ Consiste en repetir secuencialmente ciclos de replicación de ADN in vitro,
o A partir de una única molécula de ADN molde se obtienen múltiples copias
§ Las copias nuevas obtenidas en cada ciclo sirven también de molde para sintetizar otras nuevas copias en los
ciclos siguientes
§ Se produce así, un aumento exponencial en el número de copias a cada ciclo de replicación sucesivo que se
realice.
§ El diseño de la PCR debe ser tal que:
o Sólo se produzca la amplificación del fragmento concreto de ADN que interesa estudiar (diseño de
cebadores específicos)
o La ADN polimerasa utilizada en la reacción debe resistir repetidas veces (ciclos), los aumentos de la
temperatura necesarios para la reacción (empleo de polimerasas termoestables)
CEBADORES O PRIMERS
§ Cebadores (en inglés primers) son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria de las
regiones que flanquean el fragmento que se quiere amplificar
§ La ADN polimerasa necesita la presencia de los cebadores:
o Los cebadores sirven para iniciar la reacción por parte de la ADN polimerasa
o Delimitan el fragmento concreto a amplificar
§ Se diseñan siempre por parejas
§ Cada uno es complementario de una secuencia adyacente a la región de interés pero en extremos y cadenas
opuestas:
o El cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 3’→ 5’ se denomina cebador F, forward
o directo
o El que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5’→ 3’ se denomina cebador R, reverse o
reverso.
 § Requisitos de los cebadores:
o Longitud
* Debe estar comprendida entre 18 y 30 nucleótidos.
- < 15 nucleótidos → carecen de especificidad y determinan la aparición de productos
amplificados no específicos,
- > 35 nucleótidos se unen peor al ADN molde y disminuye el rendimiento de la reacción
o Composición de bases
* Contenido en GC entre el 40 y el 60%.
o Secuencia
* Los cebadores no deben contener secuencias complementarias, para evitar la formación de
estructuras secundarias del tipo de horquillas y la formación de dímeros de cebadores
o Temperatura de fusión
* La Tm, de los cebadores debería estar entre 52-65°C
* Además, la diferencia entre las Tm, de los dos cebadores de una pareja debe ser inferior a 5°C,
para que se unan con la misma eficiencia al ADN molde
ADN POLIMERASA
§ La síntesis require ADN monocatenario
§ Cada ciclo de la PCR comienza con una fase de desnaturalización por calor
§ Se necesita una ADN polimerasa termoestable que soporte elevadas temperatura
o Las ADN polimerasas termoestables son enzimas aisladas de un grupo especial de arqueobacterias
extremófilas (termófilas), con actividad polimerasa a temperaturas elevadas
§ Realizan su actividad polimerasa a una temperatura óptima comprendida entre 70-75 ºC
§ Esto permite hibridar los cebadores al ADN molde a temperaturas relativamente elevadas, fijando unas
condiciones de alta rigurosidad, lo cual maximiza la especificidad de la reacción
§ Tienen capacidad de mantener su actividad polimerasa tras tiempos prolongados de incubación a 95 ºC (por
encima de los 40 minutos)
§ Esto garantiza que la enzima no se va a inactivar durante las fases de desnaturalización del ADN
§ Clasificación:
o Actividad exonucleasa 5’→ 3', pero sin actividad exonucleasa 3’→ 5’
* No son capaces de corregir errores
* Ejemplo: Taq ADN polimerasa (polimerasa de Thermus aquaticus)
o Actividad exonucleasa 5’→ 3' y actividad exonucleasa 3’→ 5’
* Poseen actividad correctora, ya que detectan cuando se incorpora un nucleótido erróneo, lo
eliminan y continúan la elongación de la cadena incorporando el nucleótido correcto
o Actividad transcriptasa inversa
* Se emplea ARN como molde
* Necesitan de presencia de Mn2+
* Pueden usarse para sintetizar y amplificar ADNc a partir de ARN

2. CICLO BÁSICO PCR

§ Fases:
1. Desnaturalización del ADN molde.
o Debe ser COMPLETA:
* Tiempo suficientemente largo y Tª elevada pero controlados:
- Hay que evitar la inactivación de la ADN polimerasa
- Por ejemplo, la Taq ADN polimerasa pierde actividad cuando es sometida a 95 ºC por
un tiempo prolongado de más de 40 minutos
o Normalmente, la fase de desnaturalización se realiza a 94-95 ºC durante 15-30 segundos
2. Hibridación de los cebadores con el ADN molde.
o También llamado anillamiento
o Se realiza habitualmente a una temperatura de entre 50-65 ºC.
o El tiempo estándar de la fase de hibridación oscila entre 30-60 segundos.
o El valor concreto depende de la Tm de los cebadores y suele estar comprendido en el rango Tm ± 5 ºC
o Temperaturas de hibridación más elevadas que la Tm de los cebadores implican mayor rigurosidad:
* Mayor especificidad (menor hibridación inespecífica de los cebadores y disminución de la
cantidad de productos no deseados).
* El inconveniente es un rendimiento menor.
o Temperaturas de hibridación más bajas que la Tm de los cebadores producen en un mayor
rendimiento de la hibridación:
* Los cebadores hibridan más eficientemente.
* El inconveniente es la posible aparición de productos no deseados por hibridación
inespecífica de los cebadores
 3. Extensión o elongación de los cebadores
o La extensión o elongación de los cebadores por la ADN polimerasa copiando la hebra molde
o Se realiza a la temperatura óptima de polimerización de la enzima empleada
o En el caso de la Taq polimerasa (obtenida del microorganismo Thermus aquaticus es de 72 ºC)
o El tiempo de la fase de extensión depende de:
* La velocidad de polimerización de la enzima
* Si tiene actividad o no correctora
* La longitud del fragmento que se va a amplificar.
- La Taq polimerasa, por ejemplo, tiene una velocidad de polimerización de
alrededor de 60 nucleótidos/sg
§ El resultado final de cada ciclo es la síntesis de una molécula de ADN nueva por cada fragmento de ADN molde
presente en la mezcla de reacción
§ Esta molécula de ADN nueva servirá también de molde en el siguiente ciclo

3. PRODUCTO DE AMPLIFICACIÓN
§ Tras un número n de repeticiones del ciclo básico de PCR se obtienen varios tipos de productos de amplificación,
unos deseados y otros no deseados, pero en proporciones muy diferentes
§ Los deseados se denominan AMPLICONES

4. PCR A TIEMPO FINAL: PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL

§ Es la forma más simple de PCR, en la que se amplifica un único fragmento de ADN, con un único par de cebadores
y en un único proceso de amplificación a tiempo final.
§ Mezcla de reacción:
o Consiste en un tampón adecuado que contendrá disueltos todos los reactivos necesarios para la replicación del
ADN
o El tampón aporta el pH y la concentración salina adecuados para la óptima actividad de la ADN
polimerasa con un máximo de fidelidad
o Composición:
* Suelen ser tampones a base de Tris, con cloruro potásico (KCl), a un pH de entre 8,3 y 9,0.
* Se suministra en forma concentrada (2X, 5X o 10X).
* En él se disuelven: cloruro magnésico, desoxinucleótidos trifosfato, cebadores, ADN polimerasa y
ADN molde.
o Las ADN polimerasas termoestables requieren iones Mg2+ como cofactor para desarrollar su actividad.
o Estos iones se aportan a la mezcla de reacción en forma de MgCl2
* La ausencia o una concentración excesivamente baja de Mg2+ libre en la mezcla de reacción
determina la inactividad de la ADN polimerasa
* Una concentración excesivamente alta determina una menor fidelidad en la replicación.
* La concentración final estándar de MgCl2 en la mezcla de reacción para la Taq polimerasa es de 1,5
mM. (se suele subministrar 50mM)*
o Los cuatro desoxinucleótidos que componen las moléculas de ADN:
* Deben estar en forma de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) para ser sustrato de la ADN polimerasa
* Deben estar presentes en la misma concentración, pues en caso contrario disminuye la fidelidad de la
enzima
* Se suministran concentrados en una concentración total 10 mM (2,5 mM de cada dNTP).
o La concentración final estándar en la mezcla de reacción de cada dNTP es 200 μM.
o Los cebadores son los que marcan que la amplificación sea específica
* La concentración final de cada cebador en la mezcla de reacción debe ser la misma y debe
establecerse de forma experimental para cada pareja.
* Concentraciones finales de entre 200 y 400 nM de cada cebador suelen dar buenos resultados.
* Se suelen suministrar 20 pmol/µL*
o La ADN polimerasa se elije dependiendo de:
* La fidelidad requerida en la amplificación
* La longitud del fragmento que se va a amplificar
* En ocasiones, de la secuencia que se va a amplificar.
o Se suministran concentradas (2,5 U/ μl )* en soluciones con un 50% de glicerol con una concentración óptima
de trabajo entre 1 y 2,5 unidades para un volumen de reacción final de 50 μl.
o El ADN molde contiene el fragmento de interés que se quiere amplificar.
o Se utiliza ADN purificado.
o Para que la PCR se desarrolle de manera óptima, hay que tener en cuenta tanto la calidad como la cantidad del
ADN molde
o Calidad del ADN molde: debe seguir los siguientes criterios de calidad:
* Alto grado de integridad, es decir, ADN de alto peso molecular, no degradado ni fragmentado y sin
mellas.
* Cociente A260/A280 entre 1,7 y 2,0, lo que garantiza que no está contaminado con proteínas.
 * Libre de contaminantes que puedan inhibir la reacción de PCR, bien por inactivación de la ADN
polimerasa, bien por secuestro del Mg2+ libre
o La cantidad de ADN molde dependerá de la complejidad del ADN que se estudia.
* Como referencia, cuando se trabaja con ADN plasmídico se obtienen buenos resultados con cantidades
de 0,1–1 ng y con ADN genómico bacteriano suelen ser suficientes cantidades de entre 1 y 10 ng.
* En el caso del ADN genómico humano, cantidades de entre 100 y 300 ng suelen dar buenos
resultados.
o En ocasiones, se utilizan en la mezcla de reacción aditivos potenciadores de la PCR
§ Preparación de las muestras:
o La preparación de las muestras requiere:
* Ajustar el volumen de la reacción
- Entre 25 y 50 µL de volumen final
- Calcular cantidades a dispensar de cada reactivo según concentración necesaria para la
reacción
- Rellenar con agua esteril “grado PCR” hasta el volumen final
* Elaborar la mezcla «master»
- Es una única mezcla de reacción que incluye todos los componentes, excepto el ADN molde
y que queda preparada para hacer varias PCR simultáneamente
- De esta manera, se dispensan los volúmenes de todos los reactivos en cantidades más
fácilmente manejables
- Se reduce el margen de error
- La cantidad de cada componente se calcula multiplicando la cantidad necesaria para una
reacción por el número de muestras (incluidos los controles) que se van a procesar
simultáneamente + 1
- La mezcla se reparte en la cantidad adecuada en cada tubo de reacción y a continuación se
añaden los respectivos ADN molde para proceder a la PCR
* Establecer los controles positivo y negativo.
- Control positivo. Es un tubo con mezcla máster al que se añade ADN molde control que
contiene el fragmento que se quiere amplificar.
- Control negativo o blanco. Es un tubo con mezcla máster en el que se sustituye el ADN
molde por un volumen igual de agua de grado PCR, de manera que no habrá ADN presente en
la reacción.
* Ambos deben dar el resultado esperado para validar la PCR en las muestras problema
* También se hace control positivo de la técnica
§ El termociclador:
o Aparato en el que se lleva a cabo la PCR
o Permite programar los ciclos repetitivos con varias temperaturas y tiempos de incubación para que se
desarrollen de forma automatizada.
o La programación para una pcr estándar incluye las tres etapas principales
o Se añade una incubación final para el mantenimiento de los productos de la reacción hasta su retirada de la
máquina
o Las etapas a programar son:
1. Desnaturalización inicial
* Calentar la mezcla de reacción a 94-95ºC
* Desnaturalización de las moléculas bicatenarias
2. Ciclos de replicación (desnaturalización, hibridación y extensión)
* El número de veces que se repite el ciclo depende del número inicial de copias que se quieran
obtener
* Cuanto más abundante sea el fragmento que se va a amplificar, menor número de ciclos de
replicación serán necesarios para acumular una cantidad suficiente de amplicones.
* El número de ciclos suele oscilar entre 25 y 35
* Por encima de 40 ciclos aumenta considerablemente la probabilidad de que aparezcan
productos no deseados inespecíficos y la ADN polimerasa pierde actividad por el tiempo
acumulado a temperaturas de desnaturalización.
3. Extensión final
* Es la etapa que finaliza la reacción de PCR. Consiste en una incubación única a la temperatura
óptima de polimerización de la ADN polimerasa durante 5-10 minutos, para asegurarnos de
que todos los productos de PCR están completos y en forma de doble hélice
4. Mantenimiento
* Incubación a 4 °C sin limite de tiempo para mantener las muestras hasta que se retiren del
termociclador, anulando la actividad de la enzima
§ Análisis de los productos amplificados:
o La detección de los productos amplificados se lleva a cabo mediante una electroforesis en gel de agarosa 0,5-
2,0%, junto con un marcador de tamaños.
o La presencia de una única banda del tamaño adecuado indica que la PCR ha funcionado correctamente.
 o La observación de varias bandas de distintos tamaños indica la presencia de productos de amplificación no
deseados
§ Control negativo:
o Permite evitar que se dé un falso positivo debido a la contaminación
o En cada tanda de PCR se procesa simultáneamente un control negativo o blanco, en el que el ADN molde se
sustituye por agua de grado PCR
o En el gel de la electroforesis, la calle correspondiente al blanco debe aparecer sin bandas
o Si en el blanco se detecta alguna banda, ello indicaría contaminación de algún reactivo o pipeta que se hayan
usado en la técnica, lo que invalida los resultados de la PCR
§ Control positivo:
o La ausencia de banda específica en una muestra problema puede indicar que:
o La muestra no contiene la secuencia diana y, por tanto, el resultado sería negativo
o Algún reactivo empleado no funcionó correctamente
o La muestra puede contener inhibidores de la PCR
§ Control positivo de la técnica:
o Para asegurarnos de que la técnica funcionó bien:
* Si todos los reactivos funcionan bien, en el control positivo se observará la banda específica.
* En caso contrario hay algún problema en la mezcla máster y se invalida la tanda
o El control positivo de la técnica sirve para validar la mezcla de reacción
o Para descartar la presencia de inhibidores en una muestra hay que realizar un control positivo de la muestra
o Consistente en una nueva PCR en la que se amplifica un gen control presente en la muestra
o Si este control amplifica bien, se confirma que la muestra es apta para PCR
o Si el control positivo de la muestra no amplifica, la muestra no es apta para PCR
§ Finalidad de la PCR:
o Una vez obtenido el amplicón y confirmado el resultado positivo de la PCR se procede a su purificación:
* Desde el gel
* Desde la mezcla de reacción
o Ese amplicón podrá ser utilizado en otras técnicas para las que se utilizó la PCR como técnica de
amplificación : secuenciación, clonación, expresión, etc.
§ Modalidades de PCR:
o PCR de inicio caliente
* Las ADN polimerasas utilizadas en PCR tienen una temperatura óptima de acción alrededor de los
70°C,
* Pero también muestran una actividad polimerasa residual a temperaturas inferiores.
* Esto hace que durante el proceso de preparación de la mezcla de reacción, en el transporte hasta el
termociclador y hasta alcanzar la temperatura de desnaturalización, se puedan generar productos de
amplificación inespecíficos no deseados
* Hot start PCR, en inglés
* Es un tipo de PCR basado en eliminar la actividad de la enzima a bajas temperaturas
* Así evitar la aparición de productos de amplificación no deseados, relacionada principalmente con
la naturaleza de los cebadores
* Se puede evitar la actividad enzimática con varias estrategias:
- Preparando la mezcla de reacción sin ADN polimerasa:
• Se añade la enzima individualmente a cada tubo una vez que la temperatura del
termociclador esté por encima de los 65 ºC
• Hay riesgo de contaminación
* Se puede lograr con varias estrategias:
- Aislando la ADN polimerasa del resto de los componentes de la mezcla:
• Envuelta en partículas de cera que se funden una vez calentadas en el
termociclador
- Suministrando la ADN polimerasa inactiva bloqueándola con un anticuerpo específico, o
bien, modificándola químicamente mediante unión termolábil a un grupo bloqueante.
o PCR de grandes fragmentos
* El rendimiento de la PCR estándar suele disminuir drásticamente cuando se amplifican fragmentos
mayores de 5 kb
* Se debe a la acumulación de productos truncados:
- Son más cortos que el amplicón específico y no van a poder ser usados como molde en los
siguientes ciclos
- Se producen probablemente por la incorporación de nucleótidos erróneos que ralentizan o
detienen directamente la polimerización.
- Esta técnica permite aumentar el rendimiento cuando se amplifican fragmentos de entre 5
y 35 kb.
- El diseño de estas PCR afecta a la composición de la mezcla de reacción y a la programación
del termociclador
 - Soluciones sobre la mezcla de PCR:
• Se emplean dos tipos de ADN polimerasas una con actividad correctora (en
pequeña cantidad) y otra sin ella (en elevada cantidad). Una polimeriza y la otra va
corrigiendo
• Se añaden aditivos estabilizadores de la ADN polimerasa como el glicerol o
agentes desnaturalizantes como el DMSO (dimetilsulfóxido)
• Utilizar concentraciones bajas de K en el tampón
- Soluciones el termociclador:
• Hay que aumentar considerablemente el tiempo de extensión en cada ciclo
o Dependiendo de la longitud del fragmento que se va a amplificar se pueden
programar tiempos de extensión de hasta 25 minutos.
• Por el contrario, los tiempos de desnaturalización se acortan (2-10 segundos) para
minimizar la inactivación de las polimerasas.
o PCR de alta fidelidad
* Son PCR realizadas en condiciones especiales para evitar introducir en los amplicones mutaciones
puntuales por incorporación de nucleótidos erróneos
- Utilización de ADN polimerasas con actividad correctora
- Se ajustan aún más las condiciones de fidelidad de la enzima:
• pH de la reacción
• Concentración de Mg2+

5. OTRAS TÉCNICAS DE PCR A TIEMPO FINAL:

PCR ANIDADA
§ Nested-PCR (en inglés)
§ Consiste en la realización de dos reacciones PCR acopladas:
o La segunda PCR utiliza como ADN molde los productos de amplificación de la primera.
§ Se usa para:
o Aumentar la sensibilidad en los casos en que el rendimiento de la PCR estándar es bajo (poca cantidad de
producto amplificado)
o Aumentar la especificidad en los casos en que no es posible evitar el acúmulo de productos no deseados con
una PCR estándar.
§ Los cebadores usados en ambas PCR son distintos:
o En la primera PCR se diseñan para amplificar un fragmento de mayor longitud que incluye la región de
interés (cebadores externos).
o En la segunda PCR se diseñan para amplificar la región de interés e hibridan en el interior del fragmento,
amplificado en la primera PCR (cebadores internos).
PCR MÚLTIPLE
§ Multiplex PCR (en inglés) consiste en la amplificación de varias secuencias diana simultáneamente, en el mismo tubo,
en una sola reacción de PCR.
§ Se consigue utilizando varios juegos de cebadores, cada uno específico para amplificar una región diferenteç
§ Estas parejas de cebadores tienen que cumplir varios requisitos:
o La temperatura óptima de todos los cebadores para hibridar con su diana debe ser similar
o Los amplicones generados por cada pareja de cebadores tienen que tener un tamaño diferente para poder
separarse en la electroforesis y visualizarse como bandas individuales.
o Deben diseñarse de manera que no puedan hibridar unos con otros formando dímeros u oligómeros.
§ La aplicación más sencilla de la PCR múltiple es la incorporación de un control positivo interno en una reacción de
detección.
§ El control positivo interno consiste en añadir a la mezcla de reacción una pareja de cebadores diseñados para amplificar
una secuencia control que tiene que estar presente en el ADN molde problema.
§ Control positivo interno:
o Tres resultados serían posibles:
* Positivo. Se observan dos bandas en la electroforesis: la específica de la secuencia que se está
estudiando y la del control positivo.
* Negativo. Se visualiza solo la banda del control positivo
* PCR no válida. No se observa ninguna banda, lo cual indica que la muestra contiene inhibidores de
la PCR.
§ RT-PCR (del inglés Reverse Transcription-PCR), permite amplificar y analizar moléculas de ARNm.
§ Es necesario realizar:
o Un paso previo de síntesis de ADNc mediante una retrotranscriptasa (RT) o transcriptasa inversa.
o Un segundo paso en el que una ADN polimerasa termoestable utiliza el ADNc como molde y lo amplifica
PCR CON TRANSCRIPCIÓN INVERSA
§ La retrotranscripción necesita cebadores que pueden ser:
o Una mezcla de hexanucleótidos, que hibridan al azar en múltiples posiciones de todas las moléculas de ARN
presentes en la muestra.
o Con esta estrategia se transcribe todo el ARN de la muestra a ADNc.
o Usar como cebador un oligo-dT, que hibridará con las colas poli-A de los ARNm presentes en la muestra.
o Con esta estrategia se transcriben a ADNc todas las moléculas de ARNm presentes en la muestra
o Usar un cebador específico de una secuencia determinada
o Con esta estrategia se transcribe a ADNc, exclusivamente un fragmento de ARN que contiene la secuencia que
queremos amplificar

6. PCR A TIEMPO REAL

§ La PCR estándar y sus variantes, son reacciones a punto final: el resultado de la reacción no se conoce hasta que no
termina y se analizan sus productos mediante electroforesis.
§ En la PCR a tiempo real, en cambio, se monitoriza el proceso de amplificación mediante el empleo de productos
fluorescentes, de manera que la detección de los amplicones se realiza ciclo a ciclo
§ Se realiza en un termociclador a tiempo real:
o Termociclador que incorpora una fuente de excitación (láser) y lector de fluorescencia, de manera que puede
medir la intensidad de fluorescencia en cada tubo de reacción en cualquier momento de la PCR.
§ Las ventajas de la PCR a tiempo real sobre la PCR a punto final:
o Mayor rapidez en la detección cualitativa de secuencias diana en una muestra, ya que el resultado se puede
obtener incluso antes de que termine la PCR.
o Resultados más fidedignos, puesto que la detección instrumental de fluorescencia es más objetiva y sensible
que la tinción con bromuro de etidio de un gel de electroforesis.
o Minimiza los problemas de contaminación, ya que tanto la amplificación como la detección se realizan en el
mismo tubo cerrado.
o Permite cuantificación ya que la intensidad de fluorescencia va a ser proporcional al ADN sintetizado
§ Sistemas fluorescentes de detección de amplicones
o Independientes de secuencia
* Se basan en el empleo de agentes fluorescentes intercalantes:
- El más utilizado es el SYBR green I.
- Son sustancias fluorescentes que aumentan su emisión de fluorescencia cuando se intercalan
en el ADN de doble hélice.
- El aumento del número de amplicones en cada ciclo de PCR se correlaciona con un aumento
en la emisión de fluorescencia.
* En este caso, la medida de la fluorescencia se realiza al final de cada ciclo de amplificación, cuando
todos los amplicones se encuentran en forma de doble hélice.
* Inconveniente: baja especificidad, ya que el agente intercalante se une a cualquier molécula de ADN
en doble hélice (amplicones, productos inespecíficos no deseados y los dímeros de cebadores).
o Específicos de secuencia
* Se basan en la utilización de sondas oligonucleotídicas marcadas con fluorocromos que hibridan de
manera específica en la región central del amplicón.
* Se usan dos fluorocromos acoplados a la sonda, según el principio de transferencia de energía
fluorescente por resonancia (FRET)
* Uno es el donante de fluorescencia y el otro el aceptor
* Dentro de esta categoría, tenemos:
- Sondas de hidrólisis
• Sondas taqman
• Son oligonucleótidos sintéticos que tienen un fluorocromo donante, denominado
notificador (reporter en inglés) en el extremo 5’ y un quencher o apantallador
(fluorescente o no) en el extremo 3’.
• La sonda hibrida específicamente en la región central del fragmento que se amplifica
• Para evitar que la ADN polimerasa pueda extenderlo tiene el extremo 3’ fosforilado.
• Con este tipo de sondas la fluorescencia se mide al final de la fase de extensión de
cada ciclo.
- Balizas moleculares
• Molecular beacons (en inglés)
• Portan un notificador en posición 5’ y un quencher en posición 3’
• Ambos extremos son secuencias cortas repetidas e invertidas (y, por tanto,
complementarias)
• La parte central es la auténtica sonda con una secuencia complementaria de la
región central del fragmento que se amplifica.
• Estas sondas adquieren una estructura secundaria en forma de horquilla (por la
complementariedad de sus extremos), con la región central formando un bucle.
 • En esta disposición, el notificador y el quencher están muy próximos, por lo que no
se detecta la fluorescencia del notificador.
• Cuando la sonda se une al ADN molde, los dos extremos, que no se pueden aparear
con el ADN molde, se separan, por lo que al excitar el notificador, éste emite
fluorescencia
• Con estas sondas, la fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación
- Sondas FRET
• Son parejas de sondas que hibridan en la zona central del amplicón en regiones
adyacentes.
• Una de ellas porta un notificador en posición 3’ y la otra un quencher fluorescente en
posición 5’
• Al hibridar con sus respectivas secuencias diana, ambos fluorocromos quedan muy
próximos (entre una y cinco bases) quedando apantallada la fluorescencia
• Con estas sondas, la fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación,
excitando el notificador y detectando el quencher
§ Aplicaciones:
o PCR cuantitativa a tiempo real (Q-PCR)
* Permite cuantificar la cantidad inicial de una molécula de ácido nucleico en una muestra.
* El termociclador a tiempo real (mediante la curva de amplificación) detecta el ciclo de PCR en el cual
la fluorescencia de la muestra alcanza un valor por encima del límite de detección.
* Este ciclo se denomina punto de corte, Cp, (del inglés Crossing point) o ciclo umbral, Ct, (del inglés
Threshold cycle).
* En la curva de amplificación el Cp es el ciclo en que se pasa de la zona de ruido a la de crecimiento
exponencial.
* El Cp de una muestra es inversamente proporcional a la cantidad inicial de la molécula diana en
ella:
- Cuanto mayor sea el número de secuencias diana en la muestra, menos ciclos de PCR serán
necesarios para alcanzar el Cp.
* Partiendo de esta base, la cuantificación puede expresarse de dos maneras: en términos absolutos o en
términos relativos
CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA
* Expresa el resultado final (cantidad de secuencia diana en la muestra) en unidades de concentración
(por ejemplo, μg/μl) o en número de copias por unidad de volumen.
* Requiere la elaboración de una curva de calibración con patrones que tengan una concentración o
número de copias conocido
* El análisis lo realiza el software de análisis del termociclador dándonos el resultado de cada muestra
* Se aplica en:
- Cuantificación de cargas virales
- Respuestas a tratamientos (control de eficacia de fármacos),
- Estudios de cuantificación de expresión génica, etc
CUANTIFICACIÓN RELATIVA
* La cuantificación relativa consiste en expresar la concentración de la secuencia diana en relación
con la concentración de un gen de referencia que está presente en todas las muestras con un número
constante de copias
o Detección de mutaciones mediante curvas de fusión.
* El termociclador es capaz de realizar curvas de fusión de los amplicones una vez acabada la PCR
(siempre que se utilicen agentes intercalantes)
* Estas curvas representan la emisión de fluorescencia frente a la Tª:
- A mayor Tª más desnaturalización y menor fluorescencia
* La curva se realiza una vez que ha concluido la PCR
* Se baja la temperatura para que todos los productos esté en forma de doble hélice (65º C)
* A partir de aquí, se va aumentando la Tª hasta la total desnaturalización (95ºC) monitorizándose
todo el tiempo la emisión de fluorescencia
* Si la PCR no ha generado productos indeseados, la fluorescencia es máxima al principio e irá
bajando hasta llegar al punto de fusión del amplicón (amplicón desnaturalizado) – En este momento,
disminuye bruscamente la fluorescencia y aparece en la curva un punto de inflexión.
* El termociclador elabora una curva de picos de fusión a partir de la anterior donde los puntos
de inflexión aparecen como picos
* Si al finalizar la PCR se han sintetizado también productos indeseados, puesto que tendrán puntos
distintos de fusión que el amplicón:
- Aparece en la curva de fusión varios puntos de inflexión
- Aparece en la curva de picos de fusión varios picos
* Además de para conocer si la PCR ha sido específica o si aparecen productos indeseados amplificados
las curvas de fusión permiten ver:
- Si existe una mutación puntual en el ADN diana: Se emplea sonda que hibrida con la
secuencia sospechosa y se estudia la disminución de la Tm respecto al híbrido perfecto que
forman la sonda y el ADN sin mutación
* Los posibles resultados serían:
- Curva con un único pico de fusión a la temperatura correspondiente al punto de fusión de la
sonda. Indica que el ADN molde no presenta mutaciones.
- Curva con un único pico de fusión a una temperatura menor al punto de fusión de la
sonda. Indica la presencia de una mutación en homocigosis.
- Curva con dos picos de fusión, uno a la temperatura del punto de fusión de la sonda y el
otro a una temperatura menor. Indica una mutación en heterocigosis