UNIDAD 6: LAS TÉCNICAS DE PCR

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica in vitro de amplificación de ADN
que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto de ADN, partiendo de
una cantidad mínima de ADN molde. Se han desarrollado diferentes variantes que permiten:
• Amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción (PCR múltiple).
• Amplificar fragmentos de ARN (RT-PCR).
• Cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico presente en
una muestra (PCR cuantitativa, PCR a tiempo real).
• Las ventajas de las técnicas de PCR y sus variantes sobre otras técnicas utilizadas en
biología molecular son claras:
• Como técnica de amplificación. Respecto a las técnicas de clonación en vectores
mediante tecnología de ADN recombinante suponen un considerable ahorro de tiempo
(la PCR tiene lugar en horas, mientras que la clonación requiere días de trabajo) y
además están completamente automatizadas (la clonación es un proceso manual).
• Como técnica de detección.
Respecto a las técnicas de hibridación, la PCR requiere una cantidad de muestra mucho menor
y, además, permite la cuantificación de secuencias concretas (PCR en tiempo real). Las aplica-
ciones son: el diagnóstico y pronóstico de ciertas enfermedades, la evolución y respuesta a
tratamientos, los estudios de expresión génica, la mutagénesis, los estudios filogenéticos, el
genotipado, la medicina forense…
BASES TEÓRICAS DE LA PCR
La PCR es un proceso enzimático, catalizado por una ADN polimerasa, basado en la replicación
del ADN. Consiste en repetir secuencialmente ciclos de replicación de ADN in vitro, de manera
que a partir de una única molécula de ADN molde se obtienen múltiples copias. Este diseño
repetitivo es la clave de la amplificación puesto que las copias nuevas obtenidas en cada ciclo
sirven también de molde para sintetizar otras copias nuevas en los ciclos siguientes, producién-
dose un aumento exponencial en el número de copias a cada ciclo de replicación sucesivo que
se realice. Ahora bien, para conseguir esto hay que solucionar dos problemas:
• ¿Cómo conseguir que en cada ciclo de la técnica únicamente se copie (se replique) el
fragmento que nos interesa, entre una mezcla compleja de moléculas de ADN?
• ¿Cómo conseguir que no se produzca la inactivación de la ADN polimerasa por la
temperatura elevada que es necesaria en la fase de desnaturalización del ADN molde?
La solución al primer problema fue el diseño de cebadores específicos que permiten la
amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN, y la solución al segundo problema
fue el descubrimiento de las ADN polimerasas termoestables.
2.1 LOS CEBADORES O PRIMERS
Los cebadores (en inglés primers) son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es
complementaria de las regiones que flanquean el fragmento que se quiere amplificar. Se diseñan
siempre por parejas y cada uno es complementario de una secuencia adyacente a la región de
interés, pero en extremos y cadenas opuestas:
• El cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 3’→5’ se denomina
cebador F o forward.
 • El que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5’→3’ se denomina cebador R o
«reverse».
El sustrato idóneo para la actividad enzimática de la ADN polimerasa es una molécula
monocatenaria de ADN (molde) con una pequeña región en doble hélice, a la que se une y
empieza a incorporar nucleótidos con bases complementarias a las de la hebra molde. En el caso
de la PCR, esa pequeña región en doble hélice la proporcionan los cebadores, una vez que se
unen a sus secuencias complementarias en las hebras molde previamente desnaturalizadas. Un
juego de cebadores, por lo tanto, define y delimita la región diana de una molécula de ADN que
se va amplificar, que será la comprendida entre ambos. Es decir, fijan la especificidad de la
reacción, haciendo posible la amplificación exclusiva de un fragmento concreto de ADN de
entre una mezcla compleja de moléculas. Por supuesto que para conseguir este objetivo, su
secuencia debe ser única del ADN que se estudia. En situaciones ideales, los cebadores deben
cumplir una serie de requisitos en cuanto a:
• Longitud. Debe estar comprendida entre 18 y 30 nucleótidos. Por debajo de 15
nucleótidos carecen de especificidad y determinan la aparición de productos
amplificados no específicos; por encima de 35 nucleótidos se unen peor al ADN molde
y disminuye el rendimiento de la reacción.
• Composición de bases. Los mejores resultados se obtienen con cebadores que tienen un
contenido en G+C comprendido entre el 40 y el 60 %.
• Secuencia. Los cebadores no deben contener secuencias complementarias intra e
intermoleculares, para evitar la formación de estructuras secundarias del tipo de
horquillas y la formación de dímeros de cebadores.
• Temperatura de fusión. La Tm de los cebadores debería estar en el rango 52- 65 °C.
Además, la diferencia entre las Tm de los dos cebadores de una pareja debe ser inferior a
5 °C, para que se unan con la misma eficiencia al ADN molde.
ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES
Para que la ADN polimerasa pueda sintetizar cadenas nuevas de ADN es necesario que el ADN
molde sea monocatenario. Esto hace que cada ciclo de la PCR tenga que comenzar por una fase
de desnaturalización por calor, lo que supone un problema para las ADN polimerasas
convencionales puesto que son termolábiles, es decir, se inactivan a temperaturas elevadas.
Las ADN polimerasas termoestables son enzimas aisladas de un grupo especial de arqueo-
bacterias extremófilas (termófilas), con actividad polimerasa a temperaturas elevadas. Al igual
que las ADN polimerasas bacterianas convencionales, estas enzimas catalizan la incorporación
de nucleótidos en dirección 5’→3’ a partir de una pequeña región con doble hélice utilizando
como molde un ADN monocatenario y en presencia de iones magnesio (Mg2+), pero tienen dos
características diferenciales que las hacen idóneas para su uso en PCR:
• Realizan su actividad polimerasa a una temperatura óptima comprendida entre 70 y 75
°C. Esto permite hibridar los cebadores al ADN molde a temperaturas relativamente
elevadas, fijando unas condiciones de alta rigurosidad, lo cual maximiza la
especificidad de la reacción.
• Tienen capacidad de mantener su actividad polimerasa tras tiempos prolongados de
incubación a 95 °C (por encima de los 40 minutos), lo que garantiza que la enzima no
se va a inactivar durante las fases de desnaturalización del ADN.
Las ADN polimerasas termoestables se pueden clasificar en función de sus capacidades
enzimáticas secundarias. Estas pueden ser:
 • Actividad exonucleasa 5’→3’, pero sin actividad exonucleasa 3’→5’. Además de la
actividad polimerasa tienen actividad exonucleasa 5’→3’, pero carecen de actividad
exonucleasa 3’→5’. Esto hace que no sean capaces de corregir errores (eliminar
nucleótidos mal incorporados). Es el caso de la Taq ADN polimerasa que tiene una tasa
de error de aproximadamente 1 por cada 100.000 nucleótidos incorporados.
• Actividad exonucleasa 5’→3’ y actividad exonucleasa 3’→5’. Son enzimas con
actividad correctora, ya que detectan cuando se incorpora un nucleótido erróneo (con
una base nitrogenada no complementaria de la correspondiente en el ADN molde), lo
eliminan y continúan la elongación de la cadena incorporando el nucleótido correcto.
• La tasa de error de estas enzimas es mucho menor, del orden de 1 por cada millón de
nucleótidos incorporados, lo que las hace especialmente útiles para aplicaciones de PCR
que requieren alta fidelidad de replicación, tales como amplificación de secuencias para
análisis de mutaciones por secuenciación o para estudios de expresión.
• Actividad transcriptasa inversa. Algunas ADN polimerasas termoestables tienen
capacidad para utilizar ARN como molde, es decir, presentan actividad transcriptasa
inversa en presencia de iones manganeso (Mn2+), por lo que pueden utilizarse para
sintetizar y amplificar ADNc a partir de ARN.
EL CICLO BÁSICO DE UNA PCR
Como ya se ha mencionado, la PCR se basa en la repetición secuencial de ciclos de replicación.
Cada ciclo consta de tres fases: desnaturalización del ADN molde, hibridación de los cebadores
con el ADN molde y extensión de los cebadores. El resultado final de cada ciclo es la síntesis de
una molécula de ADN nueva por cada fragmento de ADN molde presente en la mezcla de
reacción. Esta molécula de ADN nueva servirá también de molde en el siguiente ciclo.
Fase I. Desnaturalización
La desnaturalización debe ser lo suficientemente larga y a una temperatura suficientemente
elevada para garantizar la desnaturalización completa del ADN molde, sin prolongarse
excesivamente para evitar la inactivación de la ADN polimerasa. Por ejemplo, la Taq ADN
polimerasa pierde actividad cuando es sometida a 95 °C por un tiempo prolongado de más de 40
minutos. Normalmente, la fase de desnaturalización se realiza a 94-95 °C durante 15-30”.
Fase II. Hibridación
La hibridación de los cebadores con el ADN molde (annealing, en la terminología inglesa) se
realiza habitualmente a una temperatura de entre 50 y 65 °C. El valor concreto depende de la T m
de los cebadores y suele estar comprendido en el rango Tm ± 5 °C. Distinguimos:
• Temperaturas de hibridación más elevadas que la Tm de los cebadores, implican mayor
rigurosidad y, en consecuencia, mayor especificidad (menor hibridación inespecífica de
los cebadores y disminución de la cantidad de productos no deseados). El inconveniente
es un rendimiento menor.
• Temperaturas de hibridación más bajas que la Tm de los cebadores se pueden traducir en
un mayor rendimiento de la hibridación, ya que los cebadores hibridan más
eficientemente. El inconveniente es la posible aparición de productos no deseados por
hibridación inespecífica de los cebadores.
Fase III. Extensión
La extensión o elongación de los cebadores por la ADN polimerasa copiando la hebra molde se
realiza a la temperatura óptima de polimerización de la enzima empleada, que en el caso de la
Taq ADN polimerasa es de 72 °C. El tiempo de la fase de extensión está condicionado por la
velocidad de polimerización de la enzima y la longitud del fragmento que se quiere amplificar.
La Taq ADN polimerasa, por ejemplo, tiene una velocidad de polimerización de alrededor de 60
nucleótidos/segundo. Para esta enzima, se recomiendan tiempos de extensión de entre 30 y 45
segundos para amplificar fragmentos menores de 1 kb, un minuto para fragmentos de entre 1 y
1,5 kb y dos minutos para fragmentos de entre 1,5 y 3 kb. Para enzimas con actividad correctora
hay que considerar tiempos de extensión más prolongados, aproximadamente de 2 minutos para
fragmentos de 1 kb.
PRODUCTOS DE AMPLIFICACIÓN DE LA PCR
Tras un número n de repeticiones del ciclo básico de PCR se obtienen varios tipos de productos
de amplificación, unos deseados y otros no deseados, pero en proporciones muy diferentes.
Primer ciclo de PCR
Consta de las fases:
• Fase de desnaturalización inicial. Se separan las dos cadenas de la molécula de ADN
nativa, que vamos a denominar N+ y N–.
• Fase de hibridación. Cada cebador se une a su secuencia diana.
• Fase de extensión. Se sintetizan dos nuevas cadenas de ADN, que incluyen el fragmento
que queremos amplificar pero que tienen una longitud muy superior, puesto que la ADN
polimerasa continúa replicando la hebra molde hasta que se inicia la fase de desnatura-
lización del segundo ciclo. Vamos a denominar a estas dos cadenas nuevas E+ y E–.
Al finalizar el primer ciclo, estas dos nuevas cadenas están formando doble hélice con las
regiones complementarias del ADN molde: N+/E– y N–/E+. Estas moléculas son productos
intermedios largos no deseados de la PCR. Resultado final del ciclo 1: 2 productos no deseados
(2 × 1) y 0 productos deseados.
Segundo ciclo de PCR
Consta de las fases:
• Fase de desnaturalización. Se disocian todas las estructuras en doble hélice,
obteniéndose cuatro cadenas de ADN que pueden actuar como molde: N+, N–, E+ y
E–.
• Fases de hibridación y extensión. Se habrán sintetizado cuatro nuevas cadenas de ADN,
que formarán doble hélice con las hebras que han actuado de molde: N+/E–, N–/ E+,
E+/A– y E–/A+.
Las cadenas que se sintetizan utilizando las hebras E como molde (A+ y A–) corresponden
exactamente al fragmento que queremos amplificar. Las moléculas E+/A– y E–/A+ son también
productos intermedios no deseados. Resultado final del ciclo 2: 4 productos no deseados (2 × 2)
y 0 productos deseados.
Tercer ciclo de PCR
Consta de las fases:
• Fase de desnaturalización. Se obtienen 8 hebras molde: N+, N–, 2 E+, 2 E–, A+ y A–.
• Fases de hibridación y extensión. Las 8 hebras molde darán lugar a 8 heterodúplex al
finalizar el ciclo: N+/ E–, N–/ E+, 2 E+/A–, 2 E–/A+, 2 A+/A–. Las moléculas A+/A–
son los productos deseados, que coinciden con el fragmento que queremos amplificar y
reciben el nombre de amplicones.
Resultado final del ciclo 3:6 productos no deseados (2 × 3) y 2 amplicones.
 Cuarto ciclo de PCR y siguientes
Consta de las fases:
• Fase de desnaturalización. Se usarán como molde 16 hebras: N+, N–, 3 E+, 3 E–, 4 A+
y 4 A–.
• Fases de hibridación y extensión. Las 16 hebras dan lugar a 16 heterodúplex: N+/ E–,
N–/ E+, 3 E+/A–, 3 E–/A+, 8 A+/A–.
• Resultado final del ciclo 4: 8 productos no deseados (2 × 4) y 8 amplicones.
En los siguientes ciclos los resultados finales serán los siguientes:
• Resultado final del ciclo 5: 10 productos no deseados (2 × 5) y 22 amplicones.
• Resultado final del ciclo 6: 12 productos no deseados (2 × 6) y 52 amplicones.
• Resultado final del ciclo 7: 14 productos no deseados (2 × 7) y 114 amplicones. Y así
sucesivamente, de manera que, en cada ciclo, el número de productos no deseados
aumenta aritméticamente, mientras que el número de amplicones
aumenta exponencialmente.
Al finalizar la PCR, tras n ciclos de amplificación:
• El número de productos no deseados será 2n (70 para 35 ciclos de amplificación). • El
número de amplicones se aproximará a 2n(>1010para 35 ciclos de amplificación).
Aunque el rendimiento de la PCR nunca es del 100 %, es evidente que con esta técnica se van a
obtener millones de copias de cada molécula molde presente en la muestra original.
PCR A TIEMPO FINAL
En principio, la PCR se concibió como una técnica de amplificación a tiempo final, ya que el
resultado de la reacción no se conoce hasta que se termina y se analizan sus productos mediante
electroforesis. En esta categoría de PCR a tiempo final se incluyen la PCR estándar y sus
distintas modalidades, así como otros tipos de PCR desarrolladas con posterioridad, como la
PCR anidada, la PCR múltiple y la RT-PCR.
PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL
La PCR estándar, convencional o básica es la forma más simple de PCR, en la que se amplifica
un único fragmento de ADN, con un único par de cebadores y en un único proceso de
amplificación a tiempo final. Hay cuatro aspectos:
La mezcla de reacción
La mezcla de reacción contiene todos los reactivos necesarios que deben estar presentes en el
medio de reacción para que la PCR se desencadene de forma adecuada. Consiste en un tampón
adecuado que contendrá disueltos todos los reactivos necesarios para la replicación del ADN. El
tampón aporta el pH y la concentración salina adecuados para la óptima actividad de la ADN
polimerasa con un máximo de fidelidad. Suelen ser tampones a base de Tris con cloruro
potásico (KCl), a un pH de entre 8,3 y 9,0. Normalmente, el tampón de reacción adecuado se
suministra en forma concentrada (2x, 5x o 10x) con la ADN polimerasa. Los reactivos que se
disuelven en el tampón son principalmente: cloruro magnésico, desoxinucleótidos trifosfato,
cebadores, ADN polimerasa y ADN molde. En ocasiones, en función del resultado obtenido,
pueden ser necesarios otros aditivos o potenciadores para optimizar la PCR.
• Cloruro magnésico. Las ADN polimerasas termoestables requieren iones de magnesio
(Mg2+) como cofactor para desarrollar su actividad. Estos iones se aportan a la mezcla
de reacción en forma de cloruro magnésico (MgCl2). La ausencia o una concentración
 excesivamente baja de Mg2+libre en la mezcla de reacción determina la inactividad de la
ADN polimerasa. Una concentración excesivamente alta determina una menor fidelidad
en la replicación. Cada ADN polimerasa tiene una concentración óptima de Mg2+libre
para su buen funcionamiento. Como referencia, la concentración final estándar de
MgCl2 en la mezcla de reacción para la Taq ADN polimerasa es de 1,5 mM.
• Desoxinucleótidos trifosfato. La mezcla de reacción debe contener los cuatro
desoxinucleótidos que componen las moléculas de ADN en forma de desoxinucleótidos
trifosfato (dNTP) para que la ADN polimerasa pueda usarlos como sustrato para
incorporarlos a las cadenas en crecimiento. Los cuatro dNTP deben estar presentes en la
misma concentración, pues en caso contrario disminuye la fidelidad de la enzima. Se
suministran concentrados en una concentración total 10 mM (2,5 mM de cada dNTP).
La concentración final estándar en la mezcla de reacción de cada dNTP es 200 μM.
• Cebadores. Como se ha mencionado anteriormente, los cebadores son claves para
realizar una amplificación específica con éxito. La concentración final de cada cebador
en la mezcla de reacción debe ser la misma y debe establecerse de forma experimental
para cada pareja. Como referencia, concentraciones finales de entre 200 y 400 nM de
cada cebador suelen dar buenos resultados.
• ADN polimerasa. La ADN polimerasa es el otro reactivo clave para realizar una PCR
con éxito. La elección de una u otra ADN polimerasa dependerá de la fidelidad
requerida en la amplificación, de la longitud del fragmento que se va a amplificar y, en
ocasiones, de la secuencia que se va a amplificar. Habitualmente, las ADN polimerasas
se suministran concentradas en soluciones con un 50 % de glicerol y los fabricantes
indican su concentración óptima de trabajo, que suele oscilar entre 1 y 2,5 unidades
para un volumen de reacción final de 50 μl.
• ADN molde. El ADN molde es un componente imprescindible de la mezcla de
reacción, ya que contiene el fragmento de interés que se quiere amplificar.
Normalmente se utiliza ADN purificado por cualquiera de los métodos descritos en la
Unidad didáctica 3. Para que la PCR se desarrolle de manera óptima, hay que tener en
cuenta tanto la calidad como la cantidad del ADN molde. Calidad del ADN molde. En
condiciones ideales, el ADN molde para PCR debe cumplir los siguientes criterios de
calidad:
o Alto grado de integridad, es decir, ADN de alto peso molecular, no degradado
ni fragmentado y sin mellas.
o Cociente A260/A280 entre 1,7 y 2,0, lo que garantiza que no está contaminado con
proteínas.
o Libre de contaminantes que puedan inhibir la reacción de PCR, bien por
inactivación de la ADN polimerasa, bien por secuestro del Mg2+libre.
La cantidad idónea para obtener los mejores resultados en una PCR dependerá de la
comple-jidad del ADN que se estudia. Como referencia, cuando se trabaja con ADN
plasmídico se obtienen buenos resultados con cantidades de 0,1–1 ng y con ADN
genómico bacteriano suelen ser suficientes cantidades de entre 1 y 10 ng. En el caso del
ADN genómico humano, cantidades de entre 100 y 300 ng suelen dar buenos
resultados. No es aconsejable sobrepasar los 10 ng de ADN/µl de mezcla de reacción, o
lo que es lo mismo, los 500 ng de ADN molde para un volumen de reacción final de 50
µl.
• Otros aditivos y potenciadores
Una vez optimizados todos los componentes básicos de la mezcla de reacción, lo esperado es
obtener un buen resultado. Sin embargo, en ocasiones el rendimiento de la PCR es bajo o
aparecen amplificados productos no deseados. Normalmente, estos problemas son debidos a la
presencia de contaminantes o a la naturaleza del ADN molde o de los cebadores y, más
concretamente, a su secuencia. En estos casos se pueden añadir a la mezcla de reacción diversos
aditivos que actúan como potenciadores de la PCR, aumentando el rendimiento de la reacción o
disminuyendo la aparición de productos no deseados.
Estos aditivos y potenciadores tienen diferentes mecanismos de acción y no ejercen los mismos
efectos beneficiosos en todas las PCR, por lo que su uso se debe limitar a los casos
problemáticos, estudiando su efecto de forma experimental. La preparación de las muestras
requiere ajustar el volumen de la reacción, elaborar la mezcla «máster» y establecer los
controles positivo y negativo.
• Ajuste del volumen de reacción. Al diseñar una PCR, hay que decidir el volumen final
de mezcla de reacción en el que se llevará a cabo la reacción. Normalmente este
volumen es de 25 o 50 µl. Una vez fijado este parámetro y teniendo en cuenta que todos
los componentes de la mezcla de reacción, incluido el tampón, se suministran
concentrados, hay que calcular los volúmenes de cada reactivo que se añadirá a la
mezcla, dependiendo de la concentración final que queramos obtener. La diferencia
entre la suma de los volúmenes de cada componente y el volumen final de mezcla de
reacción se completa con agua estéril grado PCR.
• Mezcla «máster». Como las reacciones de PCR se realizan en volúmenes muy
pequeños y los componentes se suministran concentrados, las cantidades que se van a
pipetear de cada uno de ellos son muy pequeñas (entre 0,5 y 5 μl), por lo que la
posibilidad de introducir errores de pipeteo es elevada. Además, como normalmente se
realizan múltiples reacciones simultáneamente, los posibles errores cometidos en cada
tubo son distintos, por lo que las distintas PCR se realizarán en condiciones
diferentes. Para evitar este problema y conseguir que la composición de la mezcla de
reacción sea homogénea para todas las pruebas que se realicen simultáneamente, es
preferible preparar una única mezcla de reacción, denominada mezcla máster (master
mix en inglés), que incluya todos los componentes, excepto el ADN molde. La cantidad
de cada componente se calcula multiplicando la cantidad necesaria para una reacción
por el número de muestras que se van a procesar simultáneamente + 1 (es mejor que
sobre y no que falte mezcla para el último tubo), teniendo en cuenta que en el número
de muestras hay que incluir los controles positivo y negativo de la técnico.
• Control positivo y control negativo. Además de las muestras problema en las que
tendrá lugar la reacción PCR, en cada tanda se prepara un control positivo y un control
negativo de la técnica:
o Control positivo. Es un tubo con mezcla máster al que se añade ADN molde
control que contiene el fragmento que se quiere amplificar.
o Control negativo o blanco. Es un tubo con mezcla máster en el que se sustituye
el ADN molde por un volumen igual de agua estéril de grado PCR, de manera
que no habrá ADN presente en la reacción.
Una vez que las muestras y los controles ya están preparados, se llevan al termociclador para
iniciar la PCR.
Programación del termociclador. El termociclador es el aparato en el que se lleva a cabo la
reacción de PCR. Permite programar los ciclos repetitivos con varias temperaturas y tiempos de
incubación para que se desarrollen de forma automatizada. Esta programación incluye tres
etapas principales, que terminan con una incubación final para el mantenimiento de los
productos de la reacción hasta su retirada de la máquina.
1. Desnaturalización inicial. Es la etapa que inicia la reacción de PCR. Consiste en calentar la
mezcla de reacción a 94-95 °C durante varios minutos para asegurar la completa
desnaturalización de todas las moléculas bicatenarias de ADN presentes en la mezcla de
reacción.
2. Ciclos de replicación. Para esta etapa se programan:
• Las temperaturas y los tiempos de incubación de cada una de las fases del ciclo básico
de PCR: desnaturalización, hibridación de cebadores y extensión.
• El número de veces que se va a repetir el ciclo, es decir, el número de ciclos de
replicación.
• El número de ciclos de replicación va a depender del número inicial de copias del
fragmento que se quiere amplificar en la muestra en estudio. Cuanto más abundante sea
el fragmento que se va a amplificar, menor número de ciclos de replicación serán
necesarios para acumular una cantidad suficiente de amplicones. Típicamente, el
número de ciclos oscila entre 25 y 35, aunque para moldes escasos o problemáticos se
pueden aumentar hasta 40. Por encima de 40 ciclos aumenta considerablemente la
probabilidad de que aparezcan productos no deseados inespecíficos y la ADN
polimerasa pierde actividad por el tiempo acumulado a temperaturas de
desnaturalización.
3. Extensión final. Es la etapa que finaliza la reacción de PCR. Consiste en una incubación
única a la temperatura óptima de polimerización de la ADN polimerasa durante 5-10 minutos,
para asegurarnos de que todos los productos de PCR están completos y en forma de doble
hélice.
4. Mantenimiento. La programación del termociclador finaliza siempre con una última
incubación a 4 °C sin límite de tiempo para mantener las muestras hasta que se retiren del
termociclador, anulando la actividad de la enzima.
Análisis de los productos amplificados. Una vez finalizada la reacción de PCR se recuperan
las distintas muestras amplificadas del termociclador y se analiza el resultado (detección de los
productos amplificados) mediante una electroforesis en gel (normalmente agarosa 0,5-2,0 % con
un agente intercalante fluorescente), junto con un marcador de tamaños. El gel se ilumina con
luz UV en un transiluminador para visualizar las bandas de amplificación. La presencia de una
única banda del tamaño adecuado indica que la PCR ha funcionado correctamente. La
observación de varias bandas de distintos tamaños indica la presencia de productos de
amplificación no deseados. Esto es debido a que durante la PCR se han amplificado
inespecíficamente fragmentos de ADN distintos de la diana específica, por lo que habrá que
repetir la reacción variando la programación del termociclador o la composición de la mezcla de
reacción hasta conseguir un resultado específico.
1. Resultado positivo. Cuando la PCR se realiza con fines exclusivos de detección, la
observación de una banda específica es suficiente para afirmar que la secuencia diana está
presente en la muestra que se estudia y garantizar por tanto un resultado positivo. Pero si
existieran problemas de contaminación en la mezcla máster, ¿cómo descartar que no se trate de
un falso positivo? Por eso, en cada tanda de PCR se procesa simultáneamente un control
negativo o blanco, en el que el ADN molde se sustituye por agua de grado PCR. En el gel de la
electroforesis, la calle correspondiente al blanco debe aparecer limpia, sin bandas. Si en el
blanco se detecta alguna banda, ello indicaría contaminación de algún reactivo o pipeta que se
hayan usado en la técnica, lo que invalida los resultados de la tanda.
2. Resultado negativo. La ausencia de banda específica en una muestra problema indica, a
priori, que la muestra no contiene la secuencia diana y, por tanto, el resultado sería negativo.
Pero, realmente, esta no es condición suficiente para afirmar que el resultado es negativo, puesto
que algún reactivo empleado puede no funcionar correctamente o la muestra puede contener
inhibidores de la PCR. ¿Cómo se descartan estas posibilidades? El control positivo de la
técnica, que se procesa simultáneamente con las muestras, sirve para validar la mezcla de
reacción. Si todos los reactivos funcionan bien, en el control positivo se observará la banda
específica. En caso contrario hay algún problema en la mezcla máster y se invalida la tanda.
Para descartar la presencia de inhibidores en una muestra hay que realizar un control positivo de
la muestra, consistente en una nueva PCR en la que se amplifica un gen control presente en la
muestra. Si este control amplifica bien, se confirma que la muestra es negativa para la secuencia
que se estudió inicialmente. Si el control positivo de la muestra no amplifica, la muestra no es
apta para PCR
MODALIDADES DE LA PCR ESTÁNDAR
El intento de minimizar la producción de productos no deseados o la necesidad de amplificar
fragmentos de gran tamaño o con gran fidelidad para otras aplicaciones ha derivado en el
desarrollo de variantes o modalidades de la PCR estándar adaptadas a cada necesidad, como:
PCR con inicio en caliente
Aunque las ADN polimerasas utilizadas en PCR tienen una temperatura óptima de acción
alrededor de los 70 °C, muestran también una actividad polimerasa residual a temperaturas
inferiores. Esto hace que durante el proceso de preparación de la mezcla de reacción, en el
transporte hasta el termociclador y durante la rampa ascendente de la temperatura hasta alcanzar
por primera vez la temperatura de desnaturalización, se puedan generar productos de
amplificación inespecíficos no deseados. La PCR con inicio caliente (hot start-PCR, en inglés)
es un tipo de PCR basado en eliminar la actividad de la enzima a bajas temperaturas para evitar
la aparición de productos de amplificación no deseados, relacionada principalmente con la
naturaleza de los cebadores. Esto se puede lograr usando varias estrategias:
• Preparando la mezcla de reacción sin ADN polimerasa. Es la forma más sencilla. Se
prepara la mezcla de reacción sin la ADN polimerasa, se dispensa en los tubos y estos
se colocan en el termociclador. Puesto en marcha, se añade la enzima tubo a tubo una
vez que la temperatura del termociclador esté por encima de los 65 °C. Esta
metodología resulta engorrosa y aumenta el riesgo de contaminación.
• Aislando la ADN polimerasa del resto de los componentes de la mezcla. Consiste en
mantener la enzima aislada del resto de componentes de la mezcla hasta que se alcance
una temperatura elevada. El aislamiento se consigue, por ejemplo, incluyendo la ADN
polimerasa en el interior de esferas de cera, de manera que cuando se alcanzan
temperaturas elevadas en la desnaturalización inicial, al fundirse la cera, la enzima se
libera a la mezcla de reacción.
• Suministrando la ADN polimerasa inactiva. Esto se consigue bloqueándola con un
anticuerpo específico, o bien, modificándola químicamente mediante unión termolábil a
un grupo bloqueante. En cualquier caso, al alcanzar la temperatura de desnaturalización
inicial la enzima recobra su actividad, bien por desnaturalización del anticuerpo
bloqueante, bien por ruptura de la unión termolábil al grupo químico al que estaba
unida.
PCR de grandes fragmentos
El rendimiento de la PCR estándar suele disminuir drásticamente cuando se amplifican
fragmentos mayores de 5 kb. La explicación es la acumulación de productos truncados, más
cortos que el amplicón específico y que, por lo tanto, no pueden ser usados como molde en los
siguientes ciclos. Estos productos truncados se producen probablemente por la incorporación de
nucleótidos erróneos que ralentizan o detienen directamente la polimerización. La PCR de
grandes fragmentos es una variante de la PCR estándar que permite aumentar el rendimiento
cuando se amplifican fragmentos de entre 5 y 35 kb. El diseño de estas PCR afecta a la
composición de la mezcla de reacción y a la programación del termociclador.
La mezcla de reacción. Las variaciones de composición en la mezcla de reacción respecto a las
que se han visto en la PCR convencional son:
• Mezcla de ADN polimerasas. Es la modificación más importante. Consiste en la
utilización de una mezcla de dos ADN polimerasas termoestables:
 Una ADN polimerasa mayoritaria (elevada concentración) sin actividad
correctora.
 Otra minoritaria (baja concentración) con potente actividad correctora
(actividad exonucleasa 3’→5’). o De esta forma, cuando la ADN polimerasa
mayoritaria incorpora un nucleótido erróneo y detiene la polimerización (lo que
originaría un producto truncado), esta enzima con actividad correctora puede
eliminar el nucleótido erróneo y continuar la polimerización.
• Uso de aditivos. En la mezcla de reacción se suelen incluir aditivos como el glicerol,
que estabiliza las ADN polimerasas y el dimetilsulfóxido (DMSO), que favorece la
desnaturalización.
• Concentraciones bajas de potasio en el tampón de reacción. Experimentalmente, se ha
demostrado que concentraciones más bajas de potasio favorecen la eficiencia de la
amplificación de fragmentos largos.
La programación del termociclador. Es evidente que para polimerizar con éxito fragmentos
de gran tamaño en el momento de programar el termociclador hay que aumentar
considerablemente el tiempo de extensión en cada ciclo. Dependiendo de la longitud del
fragmento que se va a amplificar se pueden programar tiempos de extensión de hasta 25
minutos. Por el contrario, los tiempos de desnaturalización se acortan (2-10 segundos) para
minimizar la inactivación de las polimerasas.
PCR de alta fidelidad
Para algunas aplicaciones a las que van a ser destinados los productos de PCR, como expresión
génica o clonación, se requiere una PCR de alta fidelidad. Las PCR de alta fidelidad son PCR
realizadas en condiciones especiales para evitar introducir en los amplicones mutaciones
puntuales por incorporación de nucleótidos erróneos. En estos casos conviene realizar
variaciones en las condiciones estándar de la composición de la mezcla de reacción. Estas son:
• Utilización de ADN polimerasas termoestables con actividad correctora.
• Favorecer las condiciones óptimas de mayor fidelidad de la enzima, ajustando:
• El pH de la mezcla de reacción. Algunas enzimas presentan mayor fidelidad a pH
más bajo del habitual y otras a pH más alto.
• La concentración de Mg2+. Un exceso suele disminuir la fidelidad de las
polimerasas.
OTRAS TÉCNICAS DE PCR A TIEMPO FINAL
PCR anidada
La PCR anidada (nested-PCR en inglés), consiste en la realización de dos reacciones PCR
acopladas, de manera que la segunda PCR utiliza como ADN molde los productos de
amplificación de la primera. Se usa para aumentar la sensibilidad en los casos en que el
rendimiento de la PCR estándar es bajo (poca cantidad de producto amplificado) o para
aumentar la especificidad en los casos en que no es posible evitar el acúmulo de productos no
deseados con una PCR estándar. Los cebadores usados en ambas PCR son distintos:
 • En la primera PCR se diseñan para amplificar un fragmento de mayor longitud que
incluye la región de interés. Se denominan cebadores externos.
• En la segunda PCR se diseñan para amplificar la región de interés e hibridan en el
interior del fragmento, amplificado en la primera PCR. Se denominan cebadores
internos.
PCR múltiple
La PCR múltiple (multiplex-PCR en inglés) consiste en la amplificación de varias secuencias
diana a la vez, en el mismo tubo, en una sola reacción de PCR. Se consigue utilizando varios
juegos de cebadores, cada uno específico para amplificar una región diferente. Estas parejas de
cebadores tienen que cumplir varios requisitos:
• La temperatura óptima de todos los cebadores para hibridar con su diana debe ser
similar, puesto que al usarse un único programa de termociclador, todos los
cebadores deben unirse al ADN molde con la misma eficiencia a la temperatura
programada para la fase de hibridación.
• Los amplicones generados por cada pareja de cebadores deben tener un tamaño
suficientemente diferente para poder separarse en la electroforesis y visualizarse
como bandas individuales. Deben diseñarse de manera que no puedan hibridar unos
con otros formando dímeros u oligómeros.
La aplicación más sencilla de la PCR múltiple es la incorporación de un control positivo interno
en una reacción de detección. El control positivo interno consiste en añadir a la mezcla de
reacción una pareja de cebadores diseñados para amplificar una secuencia control que tiene que
estar presente en el ADN molde problema. De esta manera, los resultados negativos se
confirman directamente en una única PCR, sin necesidad de realizar una PCR adicional de
control positivo de la muestra. Tres resultados serían posibles:
• Positivo. Se observan dos bandas en la electroforesis: la específica de la secuencia
que se está estudiando y la del control positivo.
• Negativo. Se visualiza solo la banda del control positivo
• PCR no válida. No se observa ninguna banda, lo cual indica que la muestra contiene
inhibidores de la PCR.
PCR con transcripción inversa (RT-PCR)
La PCR con transcripción inversa o RT-PCR (del inglés reverse transcription-PCR) permite
amplificar y analizar moléculas de ARN. Dado que las ADN polimerasas termoestables utilizan
ADN como molde, para amplificar ARN mediante PCR es necesario realizar:
1. Un paso previo de síntesis de ADNc mediante una retrotranscriptasa (RT) o transcriptasa
inversa.
2. Un segundo paso en el que una ADN polimerasa termoestable utiliza el ADNc como molde y
lo amplifica. Estos dos pasos se pueden realizar en dos tubos independientes o en un mismo
tubo. Las RT, al igual que las ADN polimerasas, necesitan cebadores que formen una pequeña
región de doble hélice en el ARN molde para poder sintetizar el ADNc. En el caso de la RT-
PCR, a partir de un ARN purificado se pueden seguir tres estrategias diferentes:
• Una estrategia similar al random priming para marcar sondas, utilizando como
cebadores una mezcla de hexanucleótidos, que hibridan al azar en múltiples
posiciones de todas las moléculas de ARN presentes en la muestra. Con esta
estrategia se transcribe todo el ARN de la muestra a ADNc.
 • Usar como cebador un oligo-dT, que hibridará con las colas poli-A de los ARNm
presentes en la muestra. Con esta estrategia se transcriben a ADNc todas las
moléculas de ARNm presentes en la muestra.
• Usar un cebador específico de una secuencia determinada, más concretamente, uno
de los cebadores que se va a utilizar en la PCR posterior. Con esta estrategia se
transcribe a ADNc, exclusivamente un fragmento de ARN que contiene la secuencia
que queremos amplificar.
PCR A TIEMPO REAL
En la PCR a tiempo real se monitoriza el proceso de amplificación mediante el empleo de
productos fluorescentes, de manera que la detección de los amplicones se realiza ciclo a
ciclo. La PCR a tiempo real se realiza en un termociclador a tiempo real, que, además de las
funciones típicas de un termociclador convencional, incorpora un lector de fluorescencia, de
manera que puede medir la intensidad de fluorescencia en cada tubo de reacción en cualquier
momento de la PCR. Las ventajas de la PCR a tiempo real sobre la PCR a tiempo final son:
• Mayor rapidez en la detección cualitativa de secuencias diana en una muestra, ya
que el resultado se puede obtener incluso antes de que termine la PCR.
• Resultados más fidedignos, puesto que la detección instrumental de fluorescencia es
más objetiva y sensible que la tinción con bromuro de etidio de un gel
de electroforesis.
• Minimiza los problemas de contaminación, ya que tanto la amplificación como la
detección se realizan en el mismo tubo cerrado.
• Dado que la intensidad de fluorescencia va a ser proporcional al ADN sintetizado, la
PCR a tiempo real permite la cuantificación, tanto de los amplicones producidos,
como del ADN diana inicial presente en la muestra. Para entender bien el
funcionamiento de la PCR a tiempo real, en este apartado nos vamos a detener en el
estudio de la cinética de la amplificación y los sistemas fluorescentes de detección
de amplicones, para poder estudiar sus aplicaciones más importantes.
CINÉTICA DE LA AMPLIFICACIÓN
Una vez que se consigue asociar fluorescencia con producción de amplicones, se puede estudiar
la cinética de la amplificación de la PCR, mediante las llamadas curvas de amplificación. La
curva de amplificación es una curva de tipo sigmoide que se obtiene al representar la emisión de
fluorescencia en cada ciclo de PCR respecto del número de ciclo en que se produce. La curva
tiene tres zonas claramente diferenciadas, que corresponden a tres fases de la cinética de
amplificación:
• Zona o fase de ruido, en el que la única fluorescencia que se detecta es debida a la
señal fluorescente de fondo en cada tubo. Corresponde a los primeros ciclos de
PCR, en los que el número de amplicones sintetizados está por debajo del nivel de
detección del aparato, y por lo tanto lo está la fluorescencia asociada a ellos.
• La amplitud de esta zona de la curva va a depender de la cantidad de secuencias
diana en la muestra. Cuanto menor es el número de secuencias diana en la muestra,
más ciclos se necesitan para obtener un número de amplicones por encima del nivel
de detección del aparato.
• Zona o fase de crecimiento exponencial. La curva en esta zona es lineal y de gran
pendiente. Abarca un número reducido de ciclos (de 4 a 6) y corresponde a la
auténtica fase exponencial de producción de amplicones.
• Zona o fase de meseta. En esta zona la curva es también lineal pero de pendiente
reducida, debido a la drástica disminución del rendimiento en los últimos ciclos de
 PCR, probablemente por agotamiento de sustratos, pérdida progresiva de la
actividad polimerasa, saturación de la enzima, etc.
Estas curvas son producidas por el termociclador a tiempo real para cada reacción y para ello se
necesita añadir a la mezcla de reacción un sistema fluorescente de detección de los amplicones.
SISTEMAS FLUORESCENTES DE DETECCIÓN DE AMPLICONES
Los sistemas fluorescentes de detección de amplicones pueden ser de dos tipos:
Sistemas de detección independientes de secuencia
Los sistemas de detección independientes de secuencia se basan en el empleo de agentes
fluorescentes intercalantes. Los agentes fluorescentes intercalantes son sustancias fluorescentes
que aumentan su emisión de fluorescencia cuando se intercalan en el ADN de doble hélice. En
consecuencia, el aumento del número de amplicones en cada ciclo de PCR se correlaciona con
un aumento en la emisión de fluorescencia. En este caso, la medida de la fluorescencia se
realiza al final de cada ciclo de amplificación, al terminar la fase de extensión, porque en ese
momento todos los amplicones se encuentran en forma de doble hélice.
El principal inconveniente de este sistema de detección es su baja especificidad, ya que el
agente intercalante se une a cualquier molécula de ADN en doble hélice, incluyendo los
productos inespecíficos no deseados y los dímeros de cebadores. 4.2.2 Sistemas de detección
específicos de secuencia. Los sistemas de detección específicos de secuencia se basan en la
utilización de sondas oligonucleotídicas marcadas con fluorocromos que hibridan de manera
específica en la región central del amplicón. De esta manera, la fluorescencia se asocia solo con
los productos deseados, aumentando la especificidad de la detección. Ahora bien, una sonda
marcada con un fluorocromo emite fluorescencia siempre que se excite con la longitud de onda
adecuada, independientemente de que esté libre en solución o unida a su secuencia diana.
Entonces ¿cómo conseguir que la sonda solo emita fluorescencia si se une al amplicón? Para
solucionar este problema se usan dos fluorocromos acoplados a la sonda, según el principio de
transferencia de energía fluorescente por resonancia (FRET).
Sondas de hidrólisis. Las sondas de hidrólisis o sondas TaqMan son oligonucleótidos sintéticos
que tienen un fluorocromo donante, denominado notificador (reporter en inglés) en el extremo
5’ y un quencher (fluorescente o no) en el extremo 3’. La sonda hibrida específicamente en la
región central del fragmento que se amplifica y para evitar que la ADN polimerasa pueda
extenderlo tiene el extremo 3’ fosforilado. Con este tipo de sondas la fluorescencia se mide al
final de la fase de extensión de cada ciclo.
Balizas moleculares. Las balizas moleculares (molecular beacons en inglés) son un tipo
especial de sondas oligonucleotídicas específicas para PCR a tiempo real. Como las sondas de
hidrólisis, portan un notificador en posición 5’ y un quencher en posición 3’, pero se diferencian
porque ambos extremos son secuencias cortas repetidas e invertidas (y, por tanto,
complementarias), mientras que la parte central es la auténtica sonda con una secuencia
complementaria de la región central del fragmento que se amplifica. En condiciones normales,
estas sondas adquieren una estructura secundaria en forma de horquilla (por la
complementariedad de sus extremos), con la región central formando un bucle. En esta
disposición, el notificador y el quencher están muy próximos, por lo que no se detecta la
fluorescencia del notificador. Cuando la sonda se une al ADN molde, los dos extremos, que no
se pueden aparear con el ADN molde, se separan de manera que el notificador puede emitir su
fluorescencia cuando es excitado. Con estas sondas, la fluorescencia se mide al final de la fase
de hibridación.
Sondas FRET
Las sondas FRET son parejas de sondas que hibridan dentro del amplicón, en regiones
adyacentes. Una de ellas porta un notificador en posición 3’ y la otra un quencher fluorescente
en posición 5’. Al hibridar con sus respectivas secuencias diana, ambos fluorocromos quedan
muy próximos (entre una y cinco bases), de manera que al excitar el notificador se produce
transferencia de energía al quencher, que se excita y emite su fluorescencia. Con estas sondas, la
fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación, excitando el notificador y detectando el
quencher.
APLICACIONES DE LA PCR A TIEMPO REAL
Las aplicaciones más importantes de la PCR a tiempo real son la PCR cuantitativa a tiempo real
y la detección de mutaciones mediante curvas de fusión.
PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR)
La PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR), es una aplicación de la tecnología PCR a tiempo real
que permite cuantificar la cantidad inicial de una molécula de ácido nucleico en una muestra.
Para realizar este cálculo, el termociclador a tiempo real detecta el llamado punto de corte (Cp)
o ciclo umbral (Ct). El punto de corte (Cp) (del inglés crossing point) o ciclo umbral (Ct) (del
inglés threshold cycle) es el ciclo de PCR en el cual la fluorescencia de la muestra alcanza un
valor por encima del límite de detección. En la curva de amplificación el Cp es el ciclo en que
se pasa de la zona de ruido a la de crecimiento exponencial, mediante un giro brusco hacia
arriba. El Cp de una muestra es inversamente proporcional a la cantidad inicial de la molécula
diana en la muestra. Cuanto mayor sea el número de secuencias diana en la muestra, menos
ciclos de PCR serán necesarios para alcanzar el Cp. Partiendo de esta base, la cuantificación
puede expresarse de dos maneras: en términos absolutos o en términos relativos.
Cuantificación absoluta. Las pruebas de cuantificación absoluta expresan el resultado final
(cantidad de secuencia diana en la muestra) en unidades de concentración (por ejemplo, μg/μl) o
en número de copias por unidad de volumen. Este tipo de cuantificación requiere la elaboración
de una curva de calibración con patrones que tengan una concentración o número de copias
conocido. Estos patrones se procesan simultáneamente, en la misma ronda de PCR que las
muestras problema. El software de análisis del termociclador establece una curva de calibración
a partir de los Cp de los patrones e interpola el Cp de cada muestra para calcular el resultado.
Estas pruebas son muy útiles para cuantificar cargas virales, respuestas a tratamientos (control
de eficacia de fármacos), estudios de cuantificación de expresión génica, etc.
Cuantificación relativa. Los resultados de las pruebas de cuantificación absoluta pueden estar
condicionados por la mejor o peor purificación de las distintas muestras, la eficiencia de la
síntesis de ADNc (cuando se estudia ARNm), errores de pipeteo, etc. Estas posibles causas de
error o de imprecisión se pueden evitar realizando una cuantificación relativa. La cuantificación
relativa consiste en expresar la concentración de la secuencia diana en relación con la
concentración de un gen de referencia que está presente en todas la muestras con un número
constante de copias. En este tipo de pruebas no es necesaria una curva de calibración con
patrones.
Otra aplicación importante de la PCR a tiempo real es la detección de mutaciones mediante las
curvas de fusión. La curva de fusión es la gráfica que se obtiene representando la fluorescencia
frente a la temperatura. Los termocicladores a tiempo real están preparados para realizar curvas
de fusión de los productos amplificados. En principio, esta función se diseñó como un control
de especificidad para detectar la amplificación de productos no deseados cuando se utiliza un
agente intercalante como sistema de detección.
La curva se realiza una vez que ha concluido la PCR. Para obtenerla, se baja la temperatura
hasta un punto que garantice que todo el ADN se encuentra en forma de doble hélice (60- 65
°C). A partir de aquí la temperatura se va elevando lentamente hasta alcanzar la temperatura de
desnaturalización (95 °C) al tiempo que se monitoriza continuamente la variación de la
intensidad de fluorescencia.
Supongamos que la PCR ha sido específica y no se han sintetizado productos no deseados. Al
principio, la fluorescencia es máxima y va disminuyendo lentamente hasta llegar al punto de
fusión del amplicón, en el que se produce una disminución brusca de la fluorescencia y aparece
un punto de inflexión en la curva. Para visualizar mejor el punto de fusión, el software del
termociclador calcula otra curva basada en la derivada de la anterior, denominada curva de picos
de fusión, porque en esta curva el punto de fusión del amplicón se visualiza como un pico. Si al
finalizar la PCR se han sintetizado también productos no deseados, dado que estos tienen puntos
de fusión distintos que el amplicón, en la curva de fusión aparecerán varios puntos de inflexión
y en la curva de picos de fusión aparecerán varios picos.
Actualmente se están utilizando las curvas de fusión obtenidas con sondas fluorescentes únicas
o parejas de sondas FRET para detectar mutaciones puntuales. La detección se basa en la
disminución importante que experimenta la Tm del híbrido que forma una sonda pequeña cuando
en la secuencia diana hay una base desapareada (mutación puntual). Cuando se usa una sonda
única (por ejemplo, una baliza molecular), esta debe cubrir la región de la mutación. Al inicio de
la curva, la fluorescencia es máxima porque la sonda está unida al amplicón, y a medida que
aumenta la temperatura la fluorescencia disminuye porque la sonda se va despegando. Tres tipos
de curva de picos de fusión son posibles:
• Curva con un único pico de fusión a la temperatura correspondiente al punto de fusión
de la sonda. Indica que el ADN molde no presenta mutaciones.
• Curva con un único pico de fusión a una temperatura menor al punto de fusión de la
sonda. Indica la presencia de una mutación en homocigosis.
• Curva con dos picos de fusión, uno a la temperatura del punto de fusión de la sonda y el
otro a una temperatura menor. Indica una mutación en heterocigosis.
El empleo de sondas FRET tiene el mismo fundamento, pero tienen que cumplir dos requisitos:
La sonda con el notificador tiene que hibridar en la región de la mutación. La sonda con el
notificador debe tener una Tm ligeramente inferior a la sonda con el quencher (para que se
despegue antes).