 Material genético de todos los organismos

conocidos
 DNA: Ácido desoxirribonucleico
 RNA: Ácido ribonucleico
 Composición química de un nucleótido
Bases nitrogenadas
Pentosa azúcar de 5C (ribosa o desoxirribosa )
Grupo Fosfato
La secuencias de bases proporciona la
información genética
 ES una unidad de la herencia
 Lleva la información para un:
Polipeptido
La estructura de una molécula de RNA
 Los enlaces puente hidrogeno son mas
débiles que los enlaces covalentes
 Los enlaces puente hidrogeno se forman
entre las bases
 Watson –Crick : el apareamiento de las bases
es el responsable de los rulos en la cadena
AT
GC
Las dos hebras de la doble hélice son
complementarias y antiparalelas
El dogma central

ADN
Replicacion

ARN
Trascripción

Proteína
Traducción
 Inventada por Dr. Kary Mullis in 1983

 Es la amplificación in vitro de un fragmento

específico de DNA

 Usa dos oligonucleotidos (primers)

complementarios a la cadena de DNA.

 Taq DNA polymerase –Thermus aquaticus

 Muestra (templado o molde: DNA o cDNA)
 Primers
 DNA polymerasa resistente a alta temperatura
 Mg++
 Deoxynucleótidos trifosfatos – dNTPs (dATP,
dGTP,dCTP, dTTP)
 Buffer, KCl
 Termociclador – instrumento programado para
cambiar la temperatura de las muestras rápidamente
desde una temperatura a otra.
 ADN Simple o doble cadena
 Los moldes circulares son amplificados con menos eficiencia
que los lineales.
 Cantidad del DNA molde (1 µg de ADN humano, 10 ng ADN de
levadura, 1 ng de ADN bacteriano o 1 pg de ADN plasmídico)
 No necesariamente puro, pero libre de altas concentraciones
de EDTA o cationes que pueden actuar como quelantes.

 Es importante que el molde no compita con los primers en el

annealing, que puede ocurrir por excesiva cantidad de molde
inicial, afectando la fidelidad del producto.
 Dos oligonucleótidos que Únicos: Asegura alta especificidad:
son, cada uno,
complementarios a una de
5’ 3’
las dos hebras del ADN.
5’ 3’
5’
3’
3’ 5’

3’
CARACTERÍSTICAS 5’
IMPORTANTES
Únicos
Tamaño La secuencia del extremo 3’ es critica para el
Dimeros de primers funcionamiento
 Efectos en:

 Carácter de único

 Mas tamaño (15pb)

 Temperaturas de anillaje (ºTm)

 La temperatura a la cual la mitad de las hebras de ADN son

doble cadena (dc) y la mitad cadena sencilla (cs)
Mg++ es un cofactor de DNA polimerasas
Determinar la [Mg++] óptima es uno de los pasos más importantes en
la puesta a punto de una PCR.
Muy poco – la polimerasa no funciona
correctamente, afectando el rendimiento
de la reacción
Mucho – favorece el annealing de los
primers a lugares que no son 100 %
complementarios, afectando la especificidad y
el rendimiento de la reacción
 Deben estar presentes en cantidad suficiente para que se logre
la extensión a lo largo de todos los ciclos (~200 mM cada
dNTP). Se afecta el rendimiento de la reacción.

 No deben estar en exceso para que los iones Mg++ no estén

formando complejos con los dNTPs y no disponibles como
cofactores para la enzima. Se afecta el rendimiento de la
reacción y la fidelidad del producto final.
 El buffer es en general Tris base ajustado a un pH
específico con HCl.

 pH 8.3 es el óptimo para Taq.

 El pH óptimo mantiene la enzima plegada en una

conformación a la cual es enzimáticamente activa.

 KCl: contribuye al plegamiento correcto de la enzima.

• Síntesis por DNA polimerasa
5’ 3’
• -T A C G
• -A T G C A T G C A T G C * *
Cortos primers de DNA específicos hibridizan con la cadena que
tiene que ser copiada
• Síntesis por DNA polimerasa
5’ 3’
• -T A C G T
• -A T G C A T G C A T G C * *
• Síntesis por DNA polimerasa
5’ 3’
• -T A C G T A C G T A
• -A T G C A T G C A T G C * *
 Despues del primer periodo de síntesis de DNA,
tenemos copiada una cadena de DNA

Primer 1 Extensión de la cadena

Cadena original de DNA

¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN?

Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (~100°C)
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta
temperatura (~100°C)
Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva
cadena con la DNA polimerasa
2

Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente,

dado que hay un exceso de Primer 1

Ahora tenemos dos copias de la molécula original

 Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Fusión Hibridización Extensión de 2do Ciclo

95°C 50-60ºC La cadena 95ºC
75ºC 50 - 60ºC
75ºC
Primer Ciclo
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias

Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el Nº de copias

 Electroforesis en gel desnaturalizante en gradiente (DGGE)
es un método que separa genes del mismo tamaño que
difieren en la secuencia de bases.
 Se utiliza un gradiente de una mezcla de urea y formamida
que desnaturaliza el ADN.
 Un fragmento de ADN bicatenario se desplaza por el gel y
cuando llega a una determinada concentración
desnaturalizante las cadenas de ADN se separan y el
desplazamiento se interrumpe.
 Las diferencias en las propiedades de separación de las
cadenas depende en gran parte de las diferencias en la
secuencia de bases.
Separación de moléculas en un campo eléctrico
Electrodo (+)
Cámara de electroforesis
Camas para preparación del gel
de agarosa

Fuente de poder

Electrodo (-)
Gel actúa como filtro molecular, controlando la migración en
función del peso molecular
 Calentar
Mezclar agarosa con una solución
tampón como el TBE (tris-ac.
Borico-EDTA)
Agente intercalante
Bromuro de Etidio
Molécula fluorescente que
se intercala entre la s
bases de la molécula de
DNA

Absorción a 330 nm
(UV)emisión en luz visible
 BUENA CALIDAD DE ADN DIFERENTES CALIDADES DE ADN
1 2 3 4 5 6 CP CN 1 2 3 4 CP CN

CP: Control Positivo CP: Control Positivo

CN: Control Negativo CN: Control Negativo
1-6: Pacientes
Pozo 2  No ADN

Pozos 3 y 4  Bajas concentraciones

Pureza ADN

16sRNAr
700 pb
 1.Permite identificar tamaño de fragmentos

25pb 50pb 100pb

 100
40

60

80

. 7 c-3 (p1)
. 37 s-1 (p1)
. 43 s-3 (p1)
. 10 t1-1 (p1)
. 22 t2-2 (p1)
. 40 s-2 (p1)
. 16 t1-3 (p1)
. 19 t2-1 (p1)
. 25 t2-3 (p1)
. 1 c-1 (p1)
. 2 c-1 p2
. 28 i-1 (p1)
. 31 i-2 (p1)
. 34 i-3 (p1)
. 4 c-2 (p1)
. 13 t1-2 (p1)
 METODOLOGIA
 Estudios de polimorfismos:
variación en la secuencia de 1. Extracción de ADN
ADN 2. PCR – se obtiene la
secuencia target

3. Digestión con enzimas de

restricción  mecanismo de
defensa de bacterias

4. Electroforesis en gel
 La técnica RT-PCR combina la amplificación del DNA con la
detección de los productos en un solo tubo.

 “Tiempo Real”: Detección de productos de PCR en la medida que

se van generando
 Monitoreando la amplificación de una secuencia especifica en
tiempo real utilizando tecnologías fluorescentes

UTILIDADES
- Genotipificación
- Cuantificación de carga viral
- Cuantificación del numero de copias
de un gen
- Expresión génica (RNA) 
Retrotranscripción
 PCR
tradicional
Preparación de la
Amplificación Detección
Muestra

PCR en
Tiempo Real

Preparación de la
Muestra Amplificación y Detección
 Marca fluorescente en cada uno de los diferentes
nucleótidos: A, T, G y C.

 Emisión de luz a una longitud de onda especifica 

Laser de iones de argón
 Cromatograma o electrofenograma
- Se representa la base según color diferente
- Intensidad de la señal luminosa (altura del pico)
 Detección e identificación de virus de
muestras ambientales
 Detección e identificación de bacterias
aisladas de agua o suelo, en poco tiempo
comparado con las técnicas tradicionales
 Tipificación de bacterias aisladas del
ambiente
 Detección de bacterias no cultivables
 Estudios epidemiológicos de microrganismos
aislados de muestras ambientales
 La prevención, el diagnostico , y el
tratamiento de enfermedades
 Determinación de compuestos contaminantes
del ambiente
 Evaluación epidemiológica de enfermedades
 Otros…
Muchas Gracias!!!