PRÁCTICA Nº5: PCR Y ELECTROFORESIS Biología Molecular

PRÁCTICA Nº5: PCR (Polymerase Chain Reaction) y

Electroforesis en gel de Poliacrilamida

I. INTRODUCCIÓN

El PCR es una técnica que sirve para amplificar un fragmento de ADN; su

utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con
una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad,
identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el
ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que
se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente
abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

La electroforesis se usa en una gran mayoría en la materia del ADN

recombinante ya que nos permite saber la carga que poseen los
polipéptidos, y separar los diferentes polipeptidos resultantes de las
variaciones del experimento del ADN recombinante. La variante de uso
más común para el análisis de mezclas de proteínas o de ácidos nucleicos
utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida.
Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los
dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas se cargan al unirse con
sustancias como el SDS (detergente) que incorpora cargas negativas de
una manera dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la
mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y
deberán ir pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras
cruzadas), por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente.
Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca
del lugar de partida.
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II. Marco Teórico:

1. Reacción en Cadena de la Polimerasa:

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés
(polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983
por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento
de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia
de ese fragmento original, o molde.

Cuando hacemos una reacción de PCR simulamos lo que sucede en una célula cuando
se sintetiza el ADN y en el tubo se mezclan todos los ingredientes necesarios para
hacerlo: la polimerasa, el ADN del organismo que queremos estudiar –donde se
encuentra el fragmento que queremos sintetizar, los oligonucleótidos (llamados
también primers , iniciadores, cebadores, “oligos”, etc.) necesarios para que se inicie
la transcripción, dinucleótidos (dNTPs), y las condiciones para que la enzima trabaje
adecuadamente (cierto pH, determinadas cantidades de magnesio en forma de MgCl 2,
KCl, y pueden necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo de cada polimerasa).
Esta técnica tan ingeniosa tiene muchísimas aplicaciones distintas y se ha convertido
en una herramienta muy importante en la biología molecular; sus aplicaciones van
desde la genética de poblaciones, evolución molecular y genómica hasta la medicina
forense.

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para

replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas
alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de
replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder
duplicarlas nuevamente. La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por
Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980.

Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar

los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo.
Puesto que las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN)
suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN
polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas
temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos,
generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus
(Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se
emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer
corrección de errores (Pfu, Vent).

Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado

termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la
temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Muchos termocicladores
modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los
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tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen
una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo
que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores
tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación
sobre los tubos de reacción. Los termocicladores más antiguos carecían de este
sistema y solucionaban el problema de la condensación con una capa de aceite en la
parte superior de la mezcla de reacción o con un poco de cera dentro de los tubos.

Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en

laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de
aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonación de ADN para la secuenciación, la
filogenia basada en ADN, el análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos
hereditarios, la identificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y test de
paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedades infecciosas.

1.1. Reactivos usados en PCR:

 Los 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar

nuevo ADN.

 Dos cebadores o iniciadores (en inglés, primers), oligonucleótidos que son,

cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son
secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de
dieciocho a veintidós, que permiten que la polimerasa inicie la reacción.
Deben estar enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN
a amplificar, es decir, corresponden a los nucleótidos que definen los
extremos de la secuencia que se desea replicar.

 Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comúnmente

como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. También
se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagénesis de ADN mediante
PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error
durante la síntesis de ADN. Actúan como cofactores de la polimerasa.

 Iones monovalentes, como el potasio.

 Una solución tampón o buffer que mantiene el pH adecuado para el

funcionamiento de la ADN polimerasa.

 ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima

alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq).

 ADN molde, que contiene la región de ADN que se va a amplificar.

 Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada

una de las etapas que conforman un ciclo.
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1.2. Ciclo de amplificación.

En el termociclador se calienta o enfría los tubos con los reactivos a tres temperaturas
distintas, que se repiten una y otra vez (lo que se llama los ciclos de reacción), la
primera es a 95oC (y a este paso se le llama desnaturalización) durante la cual las
dobles cadenas del ADN se abren o desnaturalizan, quedando en forma de cadenas
sencillas; después el termociclador ajusta la temperatura en un intervalo entre 40 o y
60oC (llamada de alineamiento), a esta temperatura se forman y se rompen
constantemente los puentes de hidrogeno entre los oligonucleótidos y el ADN, y
aquellas uniones más estables (las que son complementarias) duraran mayor tiempo,
quedando los oligonucleótidos “alineados” formando una pequeña región de doble
cadena.

La polimerasa se une a este pequeño pedazo de ADN de doble cadena y comienza a

copiar en sentido 5’ a 3’; al agregar unas bases mas, los puentes de hidrogeno que se
forman entre las bases estabilizan mas la unión y el oligonucleótido permanece en este
sitio para el siguiente paso. Después la temperatura sube a 72 oC (paso que se conoce
como extensión), ya que 72oC es la temperatura en la cual la polimerasa alcanza su
máxima actividad, y continua la síntesis de los fragmentos de ADN a partir de los
oligonucleótidos que ya se habían alineado.

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de

temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes
temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de
temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico
(llamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final del
proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas
usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros.
Éstos incluyen la enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones
divalentes y de los dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores, así
como la longitud del ADN que se desea amplificar.

Actualmente, casi todos los termocicladores dan la opción de realizar la reacción de

PCR con la llamada " tapa caliente". Es decir, que el sistema del termociclador aplicará
calor a la parte de arriba del vial que contiene la mezcla de PCR. Al comienzo, los
laboratorios que empezaron a usar los primeros aparatos que se comercializaron y que
no incluían este sistema tenían que poner unas gotas de aceite dentro del vial. El
objetivo de este procedimiento, al igual que el de la tapa caliente, es evitar la
condensación de la muestra, ya que en el eppendorf se encuentran dos fases:líquido y
gas. Al condensarse la muestra, perdemos volumen de la mezcla. Sin embargo,
calentando la tapa o poniendo las gotas de aceite evitamos este proceso físico,
conservando casi intacto el volumen de la muestra.

 Inicio

Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si

se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9
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minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por
calor.

 Desnaturalización

En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está
constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento
(94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide
realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga
la cadena, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados
en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de
realizar la desnaturalización.

 Alineamiento o unión del cebador

A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a

su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la
temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el
alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión
ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la
secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el
cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región
de la molécula que va a ser amplificada.

 Extensión o elongación de la cadena

Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena

complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis
de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la
hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el
grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN
creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN
polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad
está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende tanto del ADN
polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar.
Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN
polimerizará mil bases en un minuto.

 Extensión o elongación de la cadena

Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena

complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis
de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la
hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el
grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN
creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN
polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad
está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende tanto del ADN
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polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar.

Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN
polimerizará mil bases en un minuto.

 Elongación final

Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos
tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple
restante sea totalmente ampliado.

 Conservación

Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para
conservar la reacción a corto plazo.

La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 15-100 μL, en

pequeños tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.

Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean

técnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a
su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada,
a su tamaño: típicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para
fragmentos grandes; en acrilamida, para los más pequeños; y, de forma más rápida y
aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.3 El/los
tamaño/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso
molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido, y que se
corre en el gel junto con los productos de PCR.

1.3. Optimización de la técnica de PCR:

En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:

La PCR es una técnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mínima cantidad de
ADN para obtener un gran número de copias. Además, puede ser muy propensa a
errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a
la amplificación de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a
conclusiones inciertas). Se han de tomar una serie de precauciones para evitar la
contaminación con ADN extraño. Ejemplos en los que es especialmente importante
evitar la amplificación son la detección de enfermedades (para no diagnosticar
erróneamente a los pacientes) o el diagnóstico de identidad y parentesco. Posibles
precauciones son:

 Tener especial cuidado durante los pasos previos a la amplificación: recogida,

envío, custodia y procesado de muestras.
 Limpieza exhaustiva y esterilización (lejía, etanol, luz UV, psoralenos...) de la
superficie de trabajo entre la realización de una PCR y la siguiente.
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 En laboratorios de diagnóstico genético, se suelen tener áreas separadas de

trabajo: un laboratorio para la preparación de la mezcla madre para la PCR,
otro para la adición del ADN a amplificar, otro donde se encuentra la
maquinaria para realizar la PCR y otro donde se abre y analiza la muestra ya
amplificada.
 Cabinas de seguridad biológica para reducir vapores cargados de amplicones de
enfermedades.
 Protección adecuada de los operarios que manipulen las muestras y los
instrumentos del laboratorio: guantes, bata, cubrezapatos, gafas de seguridad,
pelo recogido... En el diagnóstico molecular es conveniente que se cambien
estos elementos al pasar de una zona de trabajo a otra.
 Controles positivos y negativos.
 Tipado de todo el personal del laboratorio. En el caso de encontrar una
amplificación no esperada se podrá comprobar si proviene de uno de los
operarios.

Las técnicas de diseño de cebadores son importantes en la mejora de la obtención de

productos de PCR y en evitar la formación de productos falsos. Algunas
consideraciones al diseñar estos cebadores son:

 Se recomienda usar primers de más de 15 nucleótidos (18-30 nn) Normalmente,

se suelen diseñar de 20 nucleótidos. Los cebadores muy cortos hacen que
nuestra PCR no sea muy específica, y los que se excedan en longitud harán que
perdamos rendimiento en la reacción.
 Los primers no deben diferir en más de 3 bases.
 La proporción entre bases púricas y pirimidínicas de los dos oligos sea 1:1 (40-
60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 ó 2 bases púricas.
 Se requiere una distribución homogénea de los cuatro nucleótidos en la
secuencia, evitando los poliT/A/G/C.
 La Tm (melting temperature) de los oligos no puede diferir en más de 5 °C.
 Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean
complementarias entre sí, o se formarán dímeros entre ellos.

Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que más se
ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades inexistentes en
otras o las realizan de forma más eficiente, o funcionan en intervalos de temperatura
en los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad. Las más habituales son la
taq y la pfu.

Los componentes del tampón de reacción deberán ajustarse a las exigencias de

nuestras enzimas.

El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos
de la PCR: para ello, diversas casas comerciales nos ofrecerán termocicladores
elaborados con materiales que hagan más eficaces el desarrollo y el transcurso de las
etapas, además de diversas facilidades de manejo. Dentro del laboratorio, su manejo,
mantenimiento y ubicación será clave.
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Aparte de aspectos como la contaminación y algún fallo en la hibridación de primers,

puede haber otras complejidades que afecten a la PCR, como son:

 Degradación del ADN: esto puede ocurrir cuando se manipula la muestra en

condiciones subóptimas o cuando se hace una autopsia, por ejemplo, y resulta
en ausencia de amplificación o resultados parciales. Un caso particular es el
"allele dropout", o bien pérdida de un alelo, que se puede llegar a confundir
con ser homocigótico para dicho alelo.
 Inhibición de la PCR: puede haber agentes que interfieran en el correcto
transcurso de la PCR. Requerirá un procesamiento adicional de la muestra para
eliminar estos compuestos del medio antes de preparar la mezcla de PCR.
Tanto la sangre como el semen contienen este tipo de inhibidores, por lo que
es necesario una purificación previa.
 Modificación del ADN: las sustancias como el formol (empleado en
conservación de tejidos) o la luz ultravioleta modifican el ADN, alterando así los
resultados de la amplificación.
 Artefactos: pueden darse situaciones como las bandas "stutter" o "shadow",
que consisten en que la polimerasa amplifica una repetición de más de un
microsatélite o repetición en tándem.
 Alelo fuera de patrón: un alelo amplificado puede no coincidir con el patrón de
picos de la referencia. Esto es señal de que algo ha ido mal durante la PCR.
 Mezclas: es posible que dos muestran se mezclen de alguna forma y el
resultado sea una combinación del patrón de picos que cabe esperar tras la
amplificación de cada una de ellas por separado. Esto y el caso anterior dificulta
la interpretación de los resultados.

1.4. Tipos de PCR:

 PCR anidada

Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado

como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican
dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer
amplicón se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificación dentro
del amplicón inicial. Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y
especificidad. La especificidad aumenta porque como es amplificación de un amplicón
obtenido previamente, los cebadores sólo van a hibridar en un sitio dentro de la
molécula y el resultado será una única banda. Así, evitamos posibles hibridaciones
inespecíficas de los cebadores. La desventaja de ésta técnica es que no nos permite
cuantificar la muestra.

 PCR de extensión solapada (Mutagénesis)

Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN. Se

requieren 2 cebadores (primmers) mutagénicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5'
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y un fragmento 3' que se solapan portando ambos la mutación. Se usan los productos
en otra reacción para producir el ADN mutado de longitud completa

 PCR in situ

La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células,

donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es
realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se
realiza una primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante
hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden
detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. Esta tecnología es de gran alcance en
la capacidad de amplificar específicamente una población de secuencias de menor
representación.

 PCR múltiple

PCR en la cual se amplifica simultáneamente más de una secuencia. Para ello, se

combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los
reactivos de la reacción en cantidades suficientes, para amplificar simultáneamente
varios segmentos de ADN. Ventajas: información sobre varios locus en una sola
reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos,
rápida construcción de bases de datos. Desventajas: para llevarla a cabo
adecuadamente y sin errores, se requiere de una cuidadosa optimización del proceso.

 PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y
emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la síntesis de un ADN
complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR
sería:

 1er paso: retrotranscripción a partir del ARN.

 2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
 3er paso: PCR estándar.

 PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)

Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de

ADN o ARN presente en la muestra original, o para identificar con una muy alta
probabilidad, muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión
(también denominado valor Tm, del inglés melting temperature).

Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las

técnicas basadas en sondas específicas.

En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con

cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo
fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real.
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Permite cuantificar sólo una secuencia por reacción pero tiene la ventaja de utilizar
cebadores normales para su realización. Es mucho más económica que la que usa
sondas específicas.

Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos
fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el
inverso (reverse); cuando la sonda está intacta, presenta una transferencia energética
de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda
está dañada y los dos fluorocromos están distantes, producto de la actividad 5'-3'
exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrón de
fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.

La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR

realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que
monitoriza la progresión de la amplificación en el momento en que ocurre. A
diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulación del ADN al
final de un número predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el
proceso de amplificación usando fluorescencia, de forma que su aumento es
proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar
fácilmente usando un sistema que realice la amplificación (termociclador) y que a su
vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el
mercado. La mayoría pueden trabajar con las diversas opciones de marcado
fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las condiciones de
amplificación y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos
determinados.

1.5. Aplicaciones:

Investigación

La PCR convencional, se emplea como base para multitud de técnicas en el laboratorio

debido a su robustez y rapidez. De este modo, la PCR de punto final permite controlar
y detectar los fragmentos de ADN de interés.

Una aplicación de la PCR de extrema importancia es la clonación de secuencias de ADN

en vectores, como pueden ser los plásmidos. Para ello, se emplean cebadores que
contienen en su extremo 5' una corta secuencia que permite la interacción posterior
con otra complementaria situada en el vector de clonación a emplear. Por ejemplo, se
puede incluir una diana de restricción en dichos cebadores, de modo que, y si ésta no
existía previamente en el fragmento y es única en el vector, pueda efectuarse una
ligación mediante la ligasa de T4 tras la digestión con la enzima de restricción
apropiada de ambos elementos. Otro método asimilable a esta vía es el empleo de la
recombinación dirigida; esto es, se adapta al 5' de los cebadores una secuencia que
faculta a una recombinasa la recombinación dirigida con un vector dado.
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Medicina

En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta de diagnosis

(Coleman y Tsongalis, 2006):

 Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado

cuadro infeccioso: para ello, se amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo
producto de PCR posea unas características de tamaño o temperatura de fusión
que permitan identificarlo de forma inequívoca. En el caso de infecciones
virales que implican la integración del genoma del patógeno en el ADN del
hospedador, como es el de la infección por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la
determinación de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la
enfermedad.
 La PCR también se puede usar en revisiones médicas rutinarias, como en los
servicios de donantes de sangre, para test de rutina. A través de esta técnica se
pueden detectar infecciones peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B)
mientras aún están en el periodo de incubación. Dada la sensibilidad de los test
de PCR se pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96
pruebas individuales). Si una de estas muestras colectivas da positivo, se toman
a partir de ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentra el
causante.
 El diagnóstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un
proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la
PCR. Cada uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante sus
correspondientes cebadores y posteriormente secuenciar para detectar la
existencia de mutaciones.

Paleontología, antropología biológica, y ciencias forenses

Los campos de la paleontología, antropología biológica y la medicina y antropología

forense se han visto enormemente beneficiados por esta técnica, puesto que todas
ellas construyen con frecuencia el conocimiento de sus correspondientes disciplinas
gracias a restos o huellas de seres vivos. Uno de los materiales biológicos que más
información puede proporcionar es el ADN.

La relativa estabilidad de éste permite que, aunque fragmentado, se conserve durante

largos períodos si las condiciones son propicias. En ocasiones las muestras intactas con
las que se puede contar son extraordinariamente pequeñas o están deterioradas. La
PCR soluciona ambos problemas y proporciona cantidades útiles para posteriores
pasos de análisis. En primer lugar aumenta la cantidad de material recuperado a partir
de muestras escasas, puesto que como ya se dijo anteriormente, en teoría basta una
sola molécula para que el proceso pueda tener lugar. También debido a la naturaleza
de la técnica y su propósito de amplificación de fragmentos pequeños, esta
fragmentación no impide que este ADN pueda ser empleado como molde para una
reacción de PCR.

 En paleontología y Antropología la PCR permite recuperar las escasas

cantidades de ADN que aún no se han degradado. Algunos lugares en que el
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ADN podría preservarse son la brea las cenizas volcánicas, el ámbar, hielos
históricos polares o glaciares y ambientes áridos, sedimentos, así como en los
cristales de apatita de restos de esqueleto, siendo posible de ese modo
caracterizar cadáveres, fósiles u otros restos mediante genotipado por análisis
de microsatélites o incluso genomas de taxones extintos, amplificados de este
modo, como pueden ser los realizados mediante el ADN genómico del hombre
de Neanderthal. El propósito sería utilizar este ADN amplificado para
posteriormente realizar estudios filogenéticos o etnográficos o de poblaciones
mediante la comparación de secuencias de ADN, o el estudio de las causas de la
separación evolutiva de dos especies.
 En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiación de una persona o
para obtener pruebas a partir de muestras mínimas dejadas por el autor de un
crimen como saliva, semen u otros restos de tejidos (Butler, 2005).

Agronomía y diversidad

Tal y como la PCR multiplex permite producir huellas genéticas de individuos concretos,
dentro del marco de la genética forense, existen métodos basados en la PCR que
permiten discernir entre grupos infraespecíficos de cultivos de interés agronómico; por
ejemplo, de cultivares. Para ello, se emplean oligonucleótidos de un tamaño lo
suficientemente pequeño como para que ceben de forma relativamente inespecífica,
aunque siempre de tal forma que produzcan un patrón de bandas discreto e
interpretable. De este modo, la pauta obtenida tras la electroforesis de los fragmentos
tiende a agrupar a los individuos de mayor semejanza, que poseen un comportamiento
similar, de los que divergen.

2. Electroforesis:

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de

estas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie
hidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa),
o bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución
(electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en
distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa.

La gran mayoría de macromoléculas están cargadas eléctricamente y, al igual que los

electrolitos, se pueden clasificar en fuertes y débiles dependiendo de la constante de
ionización de grupos ácidos y básicos. Por ejemplo los ácidos nucleicos son poliácidos
fuertes.

Por lo general, para caracterizar la molécula se determina la velocidad a la que esta se

mueve en un campo eléctrico y se utiliza para determinar, en el caso de proteínas, la
masa molecular o para detectar cambios de aminoácidos y separar cuantitativamente
distintas especies moleculares; en el caso de ácidos nucleicos se determina su tamaño,
medido en pares de bases.
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2.1. Fundamentos Físicos:

 Velocidad de una molécula

Para separar distintas especies moleculares, se crea un campo eléctrico para la

molécula colocada en un líquido portador. Al generar este campo existirá una
intensidad pasando constantemente del polo positivo al polo negativo, por lo tanto,
actuará una fuerza sobre la molécula y esta experimentará una aceleración hasta
obtener una velocidad en la que la resistencia, por viscosidad del medio, neutraliza la
fuerza impulsora, es decir, la molécula se desplaza con una velocidad constante.

Donde q es carga y E es la intensidad del campo eléctrico.

Se asume que la partícula es esférica y a partir de la Ley de Stokes se obtiene que

Donde R es el radio de la esfera, ν su velocidad y η la viscosidad del fluido.

Por lo tanto la velocidad será:

Esta velocidad se alcanza a los pocos segundos, por consiguiente se puede concluir que
es constante durante todo el experimento.

 Movilidad molecular

La movilidad molecular ( ) es una magnitud característica de la partícula o molécula

que refleja la velocidad relativa a la fuerza del campo.

A partir de la ecuación de velocidad se obtiene que:

Que también puede ser expresada por:

 PRÁCTICA Nº5: PCR Y ELECTROFORESIS Biología Molecular

Donde el número de electrones y es la carga del electrón.

La movilidad depende de la carga de la partícula que, a su vez, depende del pH del

medio en el que se encuentre. Por esta razón es necesario indicar el electrolito o el pH
utilizado para determinar la movilidad.

2.2. Factores que afectan a la electroforesis

En general la electroforesis depende directamente del campo eléctrico y este depende

de distintos parámetros. Basándose en la ley de Ohm se tiene que

Diferencia de potencial (V): define el campo eléctrico; la velocidad de avance es

directamente proporcional a ella.

Resistencia (R): la movilidad de las moléculas es inversamente proporcional a ella.

Intensidad (I): cuantifica el flujo de carga eléctrica, se relaciona directamente con la

distancia recorrida por las moléculas.

Por último, otro factor que afecta significativamente a la electroforesis es la

temperatura, esta es importante puesto que por el efecto Joule el paso de una
corriente eléctrica va a producir calor y este es directamente proporcional a la
diferencia de potencial y a la resistencia. Por lo tanto, es necesario controlar de
manera estricta la temperatura para que esta no afecte a la muestra
desnaturalizándola.

2.3. Medios de soporte para Electroforesis:

La muestra debe situarse en o sobre un medio soporte, principalmente para evitar

perturbaciones mecánicas y corrientes de convección durante la separación. En
algunos soportes (papel o similares) la muestra queda sobre la superficie y avanza a lo
largo de ella, con escasa fricción, por lo que el mecanismo principal de separación es la
magnitud de la cargade cada componente de la muestra. Otros medios de soporte
(“geles”, medios semisólidos o gelatinosos) están formados por polímeros que forman
una malla, matriz o red tridimensional a través de la cual deben avanzar las moléculas
de la muestra, que queda embebida en el medio de soporte electroforético. Como
consecuencia, la fricción es notable y los factores de forma y tamaño adquieren una
alta relevancia en la separación.

 Papel: sencillo, pero con elevada adsorción debido a los grupos hidroxilo de la
celulosa.
 PRÁCTICA Nº5: PCR Y ELECTROFORESIS Biología Molecular

 Acetato de celulosa: los grupos –OH están acetilados, lo que reduce la

adsorción; baja tinción de fondo; es posible transparentarla o disolverla para
detectar y recuperar los componentes separados.
 Almidón: pasta de almidón cuyos granos se han disgregado en un tampón
caliente (se hinchan). Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la
poliacrilamida.
 Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al
agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un
gel, de alta porosidad.
 Poliacrilamida: el gel es el resultado de la polimerización química de una
mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentración de ambas y
su proporción se consiguen distintas porosidades, siempre menores que la de
los geles de agarosa.

2.4. Electroforesis en gel de Poliacrilamida:

La electroforesis en geles de poliacrilamida es utilizada para ver secuencias de ADN de

bajo peso molecular, entre 80pb y 300pb. Ha sido ampliamente utilizada para el
trabajo con microsatélites o SSR en la construcción de mapas de ligamiento, estudios
poblacionales y en la selección asistida por marcadores moleculares (MAS).
Adicionalmente es una herramienta útil para el aislamiento de pequeñas secuencias
cuyo trabajo se dificulta en geles de menor resolución, geles de agarosa.

La técnica consiste en la elaboración de una fina capa de gel de acrilamida adherida a

una lámina de vidrio por la cual migra el ADN. Al igual que en un gel de agarosa, la
migración responde a la carga negativa neta de la molécula de ADN y la concentración
del gel. Las secuencias de ADN más pequeñas migran a mayor velocidad mientras que
las grandes se quedan atrás.

La técnica se lleva a cabo en cinco pasos: el montaje de la cámara de electroforesis, la

preparación de la solución de poliacrilamida y el llenado de la cámara, la pre-corrida
del gel, la corrida de las muestras y la tinción del gel. Los geles de poliacrilamida
pueden ser desnaturalizantes o no. Los que los son, se utilizan para la corrida de
microsatélites. Estos presentan altas concentraciones de urea (5M) y son corridos a
elevadas temperaturas (50-55ºC), permitiendo que las hebras de ADN permanezcan
separadas durante la electroforesis. Priori a la servida de este tipo de gel, los
productos de PCR son desnaturalizados, a fin de incrementar la resolución de la
separación, mediante calentamiento a 95ºC y tratamiento con formamida.

La visualización de las bandas puede hacerse directamente por tinción con bromuro de
etidio (geles de agarosa) o nitrato de plata, a través de autoradiografía utilizando
“iniciadores” marcados con radioisótopos en la reacción de PCR o mediante
fluorescencia cuando se utilizan geles de secuenciación. La detección mediante
fluorescencia es el método analítico con mayor sensibilidad, mientras que la detección
radioactiva y mediante tinción con AgNO3 tienen sensibilidad equivalente (Comincini
et al. 1995, Christensen et al. 1999, Creste et al. 2001). La detección en geles de
poliacrilamida teñidos con nitrato de plata ofrece, según nuestra experiencia, la mejor
relación costo-beneficio. Aunque laboriosa esta metodología ofrece una alta
 PRÁCTICA Nº5: PCR Y ELECTROFORESIS Biología Molecular

resolución, requiere de equipos “poco” sofisticados. La detección mediante

fluorescencia, en contraste, es costosa pues requiere de equipos sofisticados, cuya
adquisición sólo se justifica en aquellos laboratorios que manejan grandes volúmenes
de muestras. La detección radiactiva requiere P32, el cual es costoso. Adicionalmente,
este radioisótopo representa riesgos para la salud por lo que su manejo en el
laboratorio requiere de equipamiento de seguridad que aumentan los costos de la
detección.

Existen diversos protocolos para la tinción del ADN en geles de poliacrilamida con
AgNO3 (Beidler et al. 1982, Bassam et al. 1991, Sanguinetti et. al. 1994). En este
protocolo se sigue el método propuesto por Beidler et al. 1982. Estudios comparativos
han demostrado que este método tiene una alta sensibilidad de detección y exhibe
poco problemas de “background” en relación a otras metodologías (Creste et al. 2001).
La tinción con AgNO3 consta de varias etapas o pasos cuyos tiempos de incubación son
críticos para la obtención de buenos resultados. La preparación de soluciones para la
tinción requiere agua de excelente calidad (bidestilada y desionizada). Estas soluciones
pueden ser reutilizadas un número limitado de veces. Los pasos de lavado de los geles
también requieren de agua bidestilada.

De especial cuidado con la metodología de tinción con AgNO3 es todo lo relativo a la

limpieza y manejo de las cámaras de electroforesis utilizadas. El manejo de estas
cámaras requiere de un espacio de trabajo bien estructurado a fin de minimizar
accidentes que podrían ocurrir durante la preparación y corrida de los geles, el lavado
de los vidrios, o los distintos pasos del proceso de tinción. Aquí describimos el
ensamblaje y preparación de dos modelos comerciales de cámaras de electroforesis.
Sin embargo, los principios son aplicables a otros modelos. El tratamiento de desechos
luego de los procesos de electroforesis y tinción son de vital importancia a fin de evitar
la contaminación de los espacios de trabajo y del personal. La solución de AgNO 3 debe
ser precipitada con sales y filtrada antes de ser descartada en el lavaplatos. Los restos
de poliacrilamida, luego del desprendimiento de geles, al igual que todos aquellos
desechables en contacto con ella (servilletas, guantes, puntas, etc.), deben ser
depositados en bolsas plásticas aptas para incineración debidamente etiquetadas.