Tema 9: las técnicas de PCR.

PCR: técnica in vitro de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto de
ADN, partiendo de una cantidad mínima de ADN molde. Se han desarrollado variantes que permiten:

- Amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción (PCR múltiple).

- Amplificar fragmentos de ARN (RT-PCR).
- Cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico (PCR a tiempo real).

Ventajas de la PCR:

- Como técnica de amplificación: es más rápida que la clonación y está más automatizada.
- Como técnica de detección: requiere menos cantidad de muestra y permite la cuantificación de secuencias concretas.
- Gran sensibilidad (causa del principal problema, contaminación por material amplificado o no)

Ejemplos de aplicaciones: diagnóstico y pronóstico enfermedades; evolución y respuestas tratamientos; estudios expresión génica;
mutagénesis; paternidad; genotipado; medicina forense; estudios filogenéticos…

1. BASES TEORICAS DE LA PCR.

1.1. LOS CEBADORES O PRIMERS.

Cebadores: son oligonucleótidos monocatenarios su secuencia es complementaria a las regiones del fragmento a amplificar.
Se diseñan por parejas, cada uno a una secuencia distinta del fragmento de interés pero en extremos y cadenas opuestos. (el
fragmento amplificado incluye los cebadores).

o Cebador F (Forward): se une a la hebra molde 3´-5´.

o Cebador R (Reverse): se une en 5´-3´.

El sustrato idóneo para la actividad enzimática de la ADN polimerasa es una molécula monocatenaria de ADN (molde) con
una región de doble hélice a la que se une y comienza a incorporar nucleótidos. Esta región la proporcionan los cebadores.
Tienen una Tm característica de cada oligonucleótido. Los cebadores fijan la especificidad de la reacción (cuanto más
pequeños, más inespecíficos).

Diseño de los cebadores:

- Longitud: 18-30 pb. Menos de 15, carecen de especificidad y son responsables de la aparición de productos
amplificados no específicos. Superior a 30, tienden a unirse peor al ADN molde y disminuyen el rendimiento de la
reacción. Pueden usarse de hasta 40-45pb.
- Composición de bases: G+C= 40-60%. Distribución A/T y G/C debe ser equilibrada. La región más importantes es el
extremo 3´si se une al ADN molde, la ADN polimerasa puede iniciar la replicación. Por ello se recomienda que el
extremo 3´no contenga secuencias de tres o más G/C seguidas.
- Secuencia: no deben contener secuencias complementarias intra e intermoleculares.
o Secuencias complementarias intramoleculares: pueden dar lugar a horquillas y a la autodimerización del
cebador, disminuyendo su concentración efectiva en la mezcla de la reacción.
o Secuencias complementarias intermoleculares: entre ambos cebadores puede ocasionar su dimerización
disminuyendo su concentración efectiva.
- Temperatura de fusión: está entre 52-65ºC, la diferencia de Tm entre los 2 cebadores no debe ser superior a 5ºC.
1.2. ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES.

ADN polimerasas termoestables: enzimas aisladas de un grupo especial de arqueobacterias extremófilas, con actividad
polimerasa a temperaturas elevadas.

Catalizan la incorporación de nucleótidos en dirección 5´-3´a partir de ARQUEOBACTERIAS EXTREMÓFILAS

una región de doble hélice utilizando de molde ADN monocatenario en Organismos procariotas que tienen su
presencia de iones de magnesio. metabolismo adaptado para vivir en
condiciones extremas:
- Realizan su actividad polimerasa a una temperatura entre 70-75ºC. Termófilos: aguantan temperaturas
permite hibridar los cebadores al ADN molde a temperaturas superiores de 45ºC pueden sobrevivir por
elevadas, en condiciones de alta rigurosidad, aumentando la encima de los 80ºC.
especificidad de la reacción.
- Capacidad de mantener su actividad polimerasa: incubando a 95ºC,
40 minutos, garantiza que la enzima no se va a inactivar en las
fases de desnaturalización del ADN.

TIPOS DE ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES.

- Actividad exonucleasa 5´-3´pero su actividad exonucleasa 3´-5´: tienen actividad exonucleasa 5´-3´. No son capaces
de corregir errores (Taq ADN polimerasa, tasa de error 1 por cada 100.000 nucleótidos).
- Actividad exonucleasa 5´-3´y 3´-5´: tienen actividad polimerasa y actividad correctora ya que detectan un nucleótido
erróneo, lo eliminan y continúan con la elongación. Tasa de error de 1 por cada millón, las hace útiles para PCRs de alta
fidelidad.
- Actividad transcriptasa inversa: utiliza ARN como molde, se realiza en presencia de iones de manganeso para
sintetizar y amplificar ADNc a partir de ARN.
1.3. EL CICLO BASICO DE UNA PCR.

La PCR se basa en la repetición secuencial de ciclo de replicación cada ciclo

consta de las siguientes fases: desnaturalización, hibridación de los cebadores Cada fase del ciclo se realiza a una
con el ADN molde y la extensión de los cebadores. temperatura y tiempo determinados
para obtener el mejor rendimiento y
El resultado final es la síntesis de una moléculas de ADN nueva por cada evitar la aparición de productos no
fragmento de ADN molde. Esta molécula servirá de molde en el siguientes deseados.
ciclo.

A) FASE 1. DESNATURALIZACION.

No debe prolongarse demasiado para evitar la inactivación de la ADN polimerasa, normalmente se realiza a 94-85ºC, 15-30
segundos (la Taq ADN polimerasa, pierde actividad cuando se la somete a 95ºC, más de 40 minutos).

B) FASE II. HIBRIDACION.

Se realiza a 50-65ºC durante 30-60 segundos. El valor concreto depende de la Tm de los cebadores +-5ºC.

- Temperaturas de hibridación más elevadas: que la Tm de los cebadores, mayor rigurosidad y especificidad. Pero el
rendimiento es menor.
- Temperaturas de hibridación más bajas: que la Tm de los cebadores, produce un mayor rendimiento de la hibridación.
Inconveniente, aparición de productos no deseados por hibridación inespecífica de los cebadores.

La temperatura optima debe fijarse experimentalmente para cada pareja de cebadores.

C) FASE III. EXTENSION.

Se produce por la ADN polimerasa copiando la hebra molde (temperatura optima) la Taq polimerasa 72ºC. Se necesita
magnesio como cofactor. El tiempo está condicionado por la velocidad de polimerización de la enzima y la longitud del
fragmento que se va a amplificar.

La Taq Polimerasa, 30-45 segundos para fragmentos menores de 1Kb y 2 minutos para fragmentos entre 1,5-3kb. Para
enzimas con actividad correctora, los tiempo de extensión son más prolongados, 2 minutos para fragmentos de 1Kb.

1.4. PRODUCTOS DE AMPLIFICACION DE LA PCR.

Tras un número n de repeticiones del ciclo de PCR se obtienen varios tipos de productos de amplificación. Estándar 40 ciclos.

A) PRIMER CICLO DE PCR.

- Fase de desnaturalización inicial: se separan 2 cadenas de la molécula de ADN nativa. N+ y N-.
- Fase de hibridación: el cebador se une a si secuencia diana.
- Fase de extensión: se sintetizan 2 cadenas de ADN, con el fragmento que se quiere amplificar, pero con una longitud
superior ya que la ADN polimerasa continúa replicando la hebra molde hasta la fase de desnaturalización del segundo
ciclo.
- Resultado final: 2 productos no deseados (2x1)y 0 productos deseados.
B) SEGUNDO CICLO DE PCR.
- Fase de desnaturalización: se disocian todas las estructuras de doble hélice, obteniendo 4 cadenas de ADN que pueden
actuar como molde.
- Fase de hibridación y extensión: sintetizando 4 nuevas cadenas de ADN, formarán doble hélice con las hebras que han
actuado de molde.
- Resultado final 2º ciclo: 4 productos no deseados (2x2) y 0 productos deseados.
C) TERCER CICLO DE PCR.
- Fase de desnaturalización: se obtienen 8 hebras molde.
- Fase de hibridación y extensión: dará lugar a 8 heterodúplex al finalizar el ciclo.
- Resultado final 3º ciclo: 6 productos no deseados y 2 amplicones.
Amplicones: productos deseados que coinciden con el fragmento que se quiere amplificar.
D) CUARTO CICLO DE PCR Y SIGUIENTES.
- Fase de desnaturalización: 16 hebras de ADN molde.
 - Fase de hibridación y extensión: las 16 hebras dan lugar a 16 heterodúplex.
- Resultado final 4 ciclo: 8 (2x4) productos no deseados y 8 amplicones.

En los siguientes ciclos los resultados finales serán:

- Resultado final 5º ciclo: 10 productos no deseados y 22 amplicones.

- Resultado final 6 ciclo: 12 productos no deseados y 52 amplicones.
- Resultado final 7º ciclo: 14 productos no deseados y 114 amplicones.

En cada ciclo, el numero de productos no deseados aumenta aritméticamente, el numero de amplicones exponencialmente. Al
finalizar la PCR tras n ciclos:

- El número de productos no deseados será 2n.

- El número de amplicones se aproximará a 2n.

El rendimiento de la técnica no es del 100%, pero permite obtener millones de copias de cada molécula molde presente en la
muestra original.

2. PCR ESTANDAR O CONVENCIONAL.

PCR estándar: es la forma más simple de PCR, se amplifica un único fragmento de ADN, con un único par de cebadores y un
único proceso de amplificación a tiempo final.

2.1. MEZCLA DE REACCION.

Contiene todos los reactivos necesarios que deben estar presentes en el medio de reacción para que la PCR se desencadene de
forma adecuada.

A) CLORURO MAGNESICO.

ADN polimerasa termoestable requiere de iones de magnesio como cofactor para desarrollar su actividad. Se aportan en
forma de cloruro magnésico.

- La ausencia o una concentración excesivamente baja de magnesio determina la inactividad de la ADN polimerasa.
- Una concentración excesivamente alta determina una menos fidelidad de replicación.

La concentración final estándar de MgCl2 para la Taq polimerasa es de 1,5mM. Algunos fabricantes suministran
directamente el tampón de reacción adecuado con la concentración de MgCl2 adecuada para sus enzimas. Otros suministran
el tampón de reacción sin MgCl2 junto un tubo de MgCl2 concentrado.

B) DESOXINUCLEOTIDOS TRIFOSFATO.

Debe contener los 4 desoxinucleótidos en forma de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) para que la ADN polimerasa los
pueda usar como sustrato e incorporarlos a las cadenas de crecimiento. Los cuatro dNTPs deben estar en la misma
concentración, en caso contrario disminuye la fidelidad de la enzima. La concentración final estándar de cada dNTP es de
200uM.

C) CEBADORES.

Son claves para realizar una amplificación específica. La concentración final debe ser la misma y debe establecerse de forma
experimental para cada pareja. Las concentraciones finales deben estar entre 200-400nM de cada cebador para dar buenos
resultados.

D) ADN POLIMERASA.

La elección dependerá de la fidelidad en la amplificación de la longitud del fragmento que se va a amplificador y de la

secuencia. Su concentración óptima de trabajo es 1-2,5u para un volumen final de reacción de 50uL.

E) ADN MOLDE.

Como contiene el fragmento de interés. Se utiliza ADN purificado. Hay que tener en cuenta la calidad y cantidad del ADN
molde.

- Calidad del ADN molde: debe cumplir los siguientes requisitos:

o Alto grado de integridad (alto peso molecular, no degradado ni fragmentado y sin mellas).
o Cociente A260/A280 entre 1,7-2,0, no está contaminado por proteínas.
o Libre de contaminantes que puedan inhibir la reacción de PCR.
- Cantidad de ADN molde: cantidad idónea. Como referencia, cuando se trabaja con ADN plasmídico 0,1-1ng y con
ADN genómico 1-10ng. En el caso del ADN genómico humano, cantidades de 100-300ng. No es aconsejable pasar de
los 100ng de ADN/uL.
F) OTROS ADTIVOS Y POTENCIADORES.

Tienen diferentes mecanismos de acción y no ejercen los mismos efectos beneficiosos en todas las PCR, su uso se debe
limitar a los casos problemáticos, estudiando su efecto de forma experimental. (ver documento 6.5 pág. 144).

2.2. PREPARACION DE LAS MUESTRAS.

Ajustar el volumen de la reacción, elaborar la mescla y establecer controles positivos y negativos.

A) AJUSTE DEL VOLUMEND DE REACCION.

Decidir el volumen final de mezcla de reacción. Normalmente 25-50uL. Una vez fijado el parámetro, hay que calcular los
volúmenes de cada reactivo. La diferencia entre la suma de los volúmenes de cada componente y el volumen final de mezcla
de reacción se completa con agua estéril grado PCR.

B) MEZCLA (MASTER).

Las cantidades que se van a pipetear son muy pequeñas, por ello la posibilidad de introducir errores de pipeteo es elevada. Es
preferible preparar una única mezcla de reacción denominada master mix que incluya todos los componentes salvo el ADN
molde.

La cantidad de cada componente se calcula multiplicando la cantidad necesaria por el número de muestras que se va a
procesar + 1. Hay que incluir los controles positivo y negativo de la técnica. Una vez completada la muestra, se reparte la
cantidad adecuada a cada tubo de reacción y se añaden los respectivos ADN molde.

C) CONTROL POSITIVO Y NEGATIVO.

- Control positivo: tubo con la mezcla máster mix al que se añade ADN molde control que contiene el fragmento que se
quiere amplificar.
- Control negativo o blanco: tubo con la mezcla en el que se sustituye el ADN molde por un volumen igual de agua grado
PCR, no habrá ADN presente en la reacción.

Una vez preparados se llevan al termociclador para iniciar la PCR.

2.3. PROGRAMACION DEL TERMOCICLADOR.

Termociclador: aparato en el que se lleva a cabo la reacción de PCR. Permite programar ciclos repetitivos con varias
temperaturas y tiempos de incubación para que se desarrollen de forma automatizada. Programación:

- Desnaturalización inicial: inicia la reacción de PCR. Se calienta la mezcla de reacción a 94-95ºC varios minutos para
asegurar la completa desnaturalización de las moléculas bicatenarias.
- Ciclos de repetición: se programan:
o Las temperaturas y tiempo de incubación de cada fase.
o El número de veces que se va a repetir el ciclo.

El numero de ciclos depende del número inicial de copias del fragmento que se va a amplificar en la muestra de estudio.
Cuanto más abundante sea, menor número de ciclos de replicación. El número de ciclos oscila entre 20-35 aunque puede
aumentar hasta 40. Por encima de 40 puede aumentar la probabilidad de que aparezcan productos no deseados
inespecíficos y la ADN polimerasa pierde actividad por el tiempo acumulado.

- Extensión final: finaliza la PCR, consiste en una incubación única a temperatura óptima durante 5-10 minutos.
- Mantenimiento: la programación finaliza con una última incubación a 4ºC para mantener la muestra hasta que se retiren
del termociclador, anulando la actividad enzimática.
2.4. ANALISIS PRODUCTOS AMPLIFICADOS.

Finalizada la PCR se recuperan las muestras amplificadas del termociclador y se analizan por electroforesis en gel de agarosa
al 0,5-2% junto a un marcador de tamaños. La presencia de una única banda, indica que la PCR ha funcionado correctamente.
La presencia de varias de distintos tamaños, indican la presencia de productos amplificados no deseados y habrá que repetir la
reacción.

A) RESULTADO POSITIVO.

Cuando la PCR se realiza con fines exclusivos de detección la observación de una banda específica es suficiente para afirmas
que la secuencia diana está presente en la muestra.
 Para descartar un falso negativo, en cada tanda de PCR se procesa un control negativo, la calle correspondiente al control
negativo debe aparecer limpia. Si se detecta alguna banda se indica la presencia de contaminación por algún reactivo o pipeta.

B) RESULTADO NEGATIVO.

La ausencia de una banda específica indica la ausencia de secuencia diana y el control sería negativo. Sin embargo algún
reactivo puede no funcionar correctamente o la muestra puede tener inhibidores de PCR.

Para descartar esas posibilidades, el control positivo se realiza simultáneamente con las muestras para validar la mezcla de la
reacción. Si todos funcionan bien, aparecerá una banda especifica. En caso contrario se invalida la tanda.

Para descartar inhibidores se realiza un control positivo, una nueva PCR donde se amplifica un gen control presente en la
muestra. Si se amplifica bien, la muestra es negativa. Si el control es positivo de la muestra no amplificada, no es apta para la
PCR.

3. MODALIDADES DE LA PCR ESTANDAR.

3.1. PCR POR INICIO EN CALIENTE / HOT START PCR.

Para evitar la aparición de productos amplificados no deseados relacionados principalmente con la naturaleza de los
cebadores. Se basa en evitar la actividad de la enzima a bajas temperaturas, se puede lograr con varias estrategias:

- Preparando la muestra de reacción sin ADN polimerasa: se dispensa en los tubos y se colocan en el termociclador.
Puesto en marcha, se añade la enzima individualmente a cada tubo cuando la temperatura del termociclador supere los
65ºC.
- Aislando la ADN polimerasa del resto de los componentes de la mezcla: se mantiene la enzima aislada del resto de
componentes hasta alcanzar una temperatura elevada. Por ejemplo incluyendo la ADN polimerasa en el interior de
esferas de cera, al alcanzar temperaturas elevadas, la enzima se libera.
- Suministrando ADN polimerasa inactiva: bloqueándola con un Ac específico o modificándola químicamente con una
unión termolábil a un grupo bloqueante. Al alcanzar la temperatura de desnaturalización, la enzima recobra su actividad,
por desnaturalización del Ac o por la ruptura de la unión termolábil.
3.2. PCR DE GRANDES FRAGMENTOS.

Permite aumentar el rendimiento cuando se amplifican fragmentos entre 5 y 35kb. Ya que el rendimiento de la PCR
disminuye cuando se amplifican fragmentos mayores de 5kb, por la acumulación de productos truncados, más cortos que no
pueden ser usados como molde en los siguientes ciclos.

El diseño de estas PCR afecta a la composición de la mezcla de reacción y a la programación del termociclador.

A) MEZCLA DE REACCION.
- Mezcla de ADN polimerasas: es la más importante. Se emplea una mezcla de 2 ADN polimerasas termoestables:
o Una mayoritaria sin actividad correctora.
o Otra minoritaria con potente actividad correctora (actividad exonucleasa 3´-5´).
- Uso de aditivos: glicerol que estabiliza las ADN polimerasas y el DMSO, favorece la desnaturalización.
- Concentraciones bajas de potasio en el tampón de reacción: favorecen la eficiencia de la amplificación de fragmentos
largos.
B) PROGRAMACION DEL TERMOCICLADOR.

Para polimerizar con éxito, hay que aumentar el tiempo de extensión en cada ciclo, hasta 25 minutos. Los tiempos de
desnaturalización se acortan para minimizar la inactivación de las polimerasas.

3.3. PCR DE ALTA FIDELIDAD.

Son PCR realizadas en condiciones especiales para evitar introducir en los amplicones mutaciones puntuales por
incorporación de nucleótidos erróneos. Son:

- Utilización de ADN polimerasas termoestables con actividad correctora.

- Favorecer las condiciones óptimas ajustando: pH (ausente) en la mezcla de reacción y la concentración de iones de
magnesio.
4. OTRAS TECNICAS DE PCR.
4.1. PCR ANIDADA/ NESTED-PCR.

Consiste en la realización de dos reacciones PCR acopladas, de manera que la segunda PCR utiliza como ADN molde de los
productos de amplificación de la primera.

Se usa para aumentar la sensibilidad en casos donde el rendimiento de la PCR estándar es bajo o para aumentar la
especificidad cuando no es posible evitar el acúmulo de productos no deseados con una PCR estándar. Los cebadores usados:
 - Cebadores externos: en la primera PCR se diseñan para amplificar un fragmento de mayor longitud que posee la región
de interés.
- Cebadores internos: en la segunda PCR se diseñan para amplificar la región de interés e hibridan en el interior del
fragmento, amplificado en la primera PCR.

Las muestras que se tienen que amplificar en la 2º PCR es el producto de reacción de la 1º PCR.

4.2. PCR MULTIPLE/ MULTIPLEX PCR.

Consiste en la amplificación de varias secuencias diana simultáneamente, en el mismo tubo, en una sola reacción de PCR.

Se utilizan varios juegos de cebadores, cada uno para una región diferente. Tienen que cumplir varios requisitos:

- La temperatura óptima de todos los cebadores para hibridar debe ser similar, todos se deben unir al ADN molde con las
misma eficiencia a la temperatura programada para cada fase de hibridación.
- Los amplicones generados por cada pareja de cebadores, deben tener el tamaño suficientemente diferente para
diferenciarse en la electroforesis.
- No pueden hibridar unos con otros formando dímeros.

Control positivo interno: se añade a la mezcla de reacción una pareja de cebadores diseñados para amplificar una secuencia
control que debe estar presente en el ADN molde problema. Tres resultados posibles:

- Positivo: se observan 2 bandas en la electroforesis: la específica de la secuencia que se está estudiando y la del control
positivo.
- Negativo: se visualiza solo la banda del control positivo.
- PCR no válida: no se observa ninguna banda, indica que la muestra contiene inhibidores de PCR.
4.3. PCR CON TRANSCRIPCION INVERSA (RT-PCR).

Permite analizar y amplificar moléculas de ARNm. Para amplificar ARN mediante PCR es necesario realizar:

- Un paso previo de síntesis de ADNc mediante una retrotranscriptasa (RT) o transcriptasa inversa.
- Un segundo paso en el que una ADN polimerasa termoestable utiliza el ADNc como molde y lo amplifica.
A) ESTRATEGIAS PARA LA TRANSCRIPCION DEL ARN MOLDE.

Las RT, necesitan cebadores que formen una pequeña región de doble hélice para poder sintetizar el ADNc. A partir de ARN
purificado se obtienen 3 estrategias diferentes:

- Estrategia similar al random priming: utilizando como cebadores una mezcla de hexanucleótidos que hibridan al azar
con todas las moléculas de ARN presentes en la muestra. Se transcribe todo el ARN de la muestra a ADNc.
- Usar como cebador un oligo-T: hibridará con las colas de poli-A de los ARNm presentes en la muestra. Se transcriben
ADNc todas las moléculas de ARNm presentes en la muestra.
- Usar un cebador específico de una secuencia determinada: uno de los cebadores que se va a utilizar en la PCR
posterior. Se transcribe a ADNc, exclusivamente un fragmento de ARN que contiene la secuencia que queremos
amplificar.
5. PCR A TIEMPO REAL.

PCR a tiempo real: se monitoriza el proceso de amplificación mediante el uso de productos fluorescentes, por lo que la detección
de los amplicones se realiza ciclo a ciclo. Se realiza en un termociclador a tiempo real que posee un lector de fluorescencia.
Ventajas:

- Mayor rapidez en la detección cualitativa de secuencias diana en la muestra.

- Resultados mas fidedignos pues la detección instrumental de fluorescencia es más objetiva y sensible que la tinción con
bromuro de etidio de un gel de electroforesis.
- Minimiza los problemas de contaminación pues la detección y amplificación se realizan en el mismo tubo.
- Permite la cuantificación de amplicones producidos y del ADN diana inicial presente en la muestra.

5.1. CINETICA DE LA AMPLIFICACION.

Curva de amplificación: curva sigmoidal que se obtiene al representar la emisión de fluorescencia en cada ciclo de PCR
respecto al número de ciclo que se produce. Fases:

- Zona o fase de ruido: la fluorescencia que se detecta se debe a la señal fluorescente de fondo de cada tubo. Primeros
ciclos de PCR, donde el numero de amplicones está por debajo del nivel de detección del aparato. La amplitud depende
de la cantidad de secuencia diana de la muestra. Cuanto menor es el número de secuencias diana, más ciclos se necesitan.
- Zona o fase de crecimiento exponencial: curva lineal y de gran pendiente. Abarca pocos ciclos (de 4 a 6), corresponde
a la autentica fase exponencial de producción de amplicones.
- Zona o fase de meseta: lineal de pendiente reducida por la drástica disminución del rendimiento en los últimos ciclos de
PCR.

Las curvas producidas por el termociclador necesitan un sistema fluorescente de detección de los amplicones.

5.2. SISTEMAS DE FLUORESCENTES DE DETECCION DE AMPLICONES.

A) SISTEMAS DE DETECCION INDEPENDIENTES DE SECUENCIA.

Los sistemas de detección independientes de secuencia: se basan en el empleo de agentes fluorescentes intercalantes
(SYBR green I).

Agentes fluorescentes intercalantes: sustancias fluorescentes que aumentan su emisión de fluorescencia cuando se
intercalan con ADN de doble hélice. El aumento de amplicones se correlaciona con un aumento de la emisión de
fluorescencia. La medida de la fluorescencia se realiza al final de cada ciclo al terminar la fase de extensión ya que los
amplicones tienen forma de doble hélice.

Inconveniente: baja especificidad ya que el agente intercalante se une a cualquier molécula de ADN en doble hélice.

B) SISTEMAS DE DETECCION ESPECIFICOS DE SECUENCIA.

Sistemas de detección específicos de

secuencia: se basa en la utilización de sondas
oligonucleotídicas marcadas con fluorocromos
que hibridan de manera específica en la región
central del amplicón. La fluorescencia se asocia
con los productos deseados, aumentando la
especificidad.
PRINCIPIO DE TRANSFERENCIA DE ENERGÍA FLUORESCENTE
POR RESONANCIA (FRET)
Consiste en la transferencia de energía lumínica de un fluorocromo a otro.
Ambos fluorocromos deben estar físicamente próximos y el espectro de
emisión del primero tiene que solaparse con el espectro de excitación del
segundo. El fluorocromo que transfiere energía se denomina donante.

Si se cumple, el donante recibe energía cuando se excita con la longitud de

Se usan dos fluorocromos acoplados a la sonda,
onda adecuada y transfiere esa energía al fluorocromo receptor que se excita
según el principio de transferencia de energía
y emite una fluorescencia característica, el aceptor actúa como quencher,
fluorescente por resonancia (FRET) evitando su emisión de fluorescencia característica.
- Sondas de hidrólisis/TaqMan:
oligonucleótidos sintéticos que tienen un
fluorocromo donante (notificador/reporter)
en el extremo 5´y un quencher en el 3´.
La sonda hibrida en la región central del
fragmento que se amplifica, para evitar que
la ADN polimerasa pueda extenderlo tiene el extremo 3´fosforilado. Se mide al final de la fase de extensión de cada
ciclo.
- Balizas moleculares/molecular beacons: tipo especial de sondas oligonucleotídicas específicas para PCR a tiempo real.
Notificador en 5´y quencher en 3´se diferencian porque ambos extremos son secuencias cortas repetidas e invertidas. La
parte central es la auténtica sonda con una secuencia complementaria de la región central del fragmento que se amplifica.
En condiciones normales, adquieren una estructura secundaria, horquilla, con la región central formando un bucle. No se
detecta la fluorescencia del notificador.
Cuando la sonda se une al ADN molde, los dos extremos se separan y excitan el notificador que emite fluorescencia.
La fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación.
- Sondas FRET: parejas de sondas que hibridan en la zona central del amplicón en regiones adyacentes.
Una porta un notificador en 3´y otra un quencher en 5´. Al hibridar, ambos fluorocromos quedan muy próximos por lo
que al excitar el notificador, se transfiere la energía al quencher, que se excita y emite su fluorescencia.
La fluorescencia se mide al final de la fase de hibridación, excitando el notificador y detectando el quencher.
5.3. APLICACIONES DE LA PCR A TIEMPO REAL.
A) PCR CUANTITTATIVA A TIEMPO REAL (qPCR).

PCR cuantitativa a tiempo real: es una aplicación de la tecnología PCR a tiempo real que permite cuantificar la cantidad
inicial de una molécula de ácido nucleico en una muestra.

El termociclador detecta el ciclo en el que la fluorescencia alcanza un valor por encima del límite de detección. Este ciclo se
denomina punto de corte, Cp o ciclo umbral, Ct. La curva de amplificación es inversamente proporcional a la cantidad inicial
de la molécula diana en ella. Cuanto mayor número de secuencias diana haya en la muestra, menos ciclos de PCR serán
necesarios para alcanzar Cp. Puede expresarse de dos maneras:

- Cuantificación absoluta: expresan el resultado final en unidades de concentración o en número de copias por unidad de
volumen (para ver cargas virales). Requiere la elaboración de una curva de calibración con patrones conocidos.
- Cuantificación relativa: consiste en expresar la concentración de la secuencia diana en relación con la concentración de
un gen de referencia presente en todas las muestras con un número constante de copias (para expresión génica).
B) CURVAS DE FUSION Y DETECCION DE MUTACIONES.

Curva de fusión: es la gráfica que se obtiene representando la fluorescencia frente a la temperatura. Se realiza una vez
concluida la PCR. Para ello se baja la temperatura hasta que se garantice que todo el ADN se encuentra en doble hélice (60-
65ºC). Posteriormente se eleva la temperatura hasta alcanzar la temperatura de desnaturalización (95ºC) y se monitoriza la
variación de la fluorescencia.

Si la PCR ha sido específica: la fluorescencia es máxima y disminuye hasta llegal al punto de fusión del amplicón, aparece
un punto de inflexión. Para visualizar este punto, el software calcula otra curva denominada curva de picos de fusión, en esta
curva el punto de fusión del amplicón se visualiza con un pico.

Si se han sintetizado productos no deseados: en la curva aparecen varios puntos de inflexión.

Actualmente se usan curvas de fusión obtenidas con sondas fluorescentes únicas o FRET, para detectar mutaciones puntuales.
La detección se basa en la disminución de la Tm del híbrido, forma una sonda pequeña cuando hay una base desapareada.
Tres tipos de curva de picos de fusión:

- Curva con un único pico de fusión a la temperatura correspondiente al punto de fusión de la sonda: indica ADN
molde sin mutaciones.
- Curva con un único pico de fusión a una temperatura menor al punto de fusión de la sonda: presencia de una
mutación en homocigosis.
- Curva con dos picos de fusión, uno a la temperatura de fusión de la sonda y el otro a una temperatura menor:
mutaciones en heterocigosis.

El empleo de sondas FRET debe cumplir 2 requisitos:

- La sonda con el notificador tiene que hibridar en la región de la mutación.

- La sonda con el notificador tiene una Tm ligeramente inferior a la sonda con el quencher.