AYUDA MEMORIA – USOS DE PCR

1.- QUE ES LA PCR

 Sabemos que el objetivo de la reacción en cadena de la polimerasa es obtener muchas

copias de un fragmento de DNA, para después poder visualizar este fragmento y
utilizarlo en otras aplicaciones si es necesario.
 El requisito fundamental para poder llevar a cabo la reacción es disponer de
fragmentos cortos de DNA de cadena sencilla hacia a los extremos del fragmento a
amplificar. Estos fragmentos servirán como cebadores para que una enzima
polimerasa sea capaz de incorporar nucleótidos complementarios a la cadena molde.
 Una vez completada la reacción la cantidad fragmento amplificado se puede visualizar
mediante técnicas sencillas de separación de fragmentos de DNA.
 La reacción en cadena de la polimerasa fue desarrollada en 1983 por el Doctor Kary
Mullis. El Dr. Mullis recibió en 1993 el Premio Nobel de Química por este
descubrimiento.

2.- COMO FUNCIONA UNA PCR

ELEMENTOS

ADN molde los Los iones facilitan la unión del cebador a la

Se trata del fragmento de ADN que queremos
amplificar mediante la PCR.
Desoxirribonucleótidos-trifosfato:
Como sabéis, el ADN está compuesto por 4 tipos de
nucleótidos, formados por 4 bases nitrogenadas:
adenina, guanina, citosina y timina. Es de esperar,
entonces, que estos 4 desoxirribonucleótidos-
trifosfato sean indispensables para poder obtener
nuevas moléculas de ADN
Cebadores (en inglés, primers)
Los cebadores son oligonucleótidos, secuencias
cortas de ADN, que se unen a la molécula de ADN
molde y sirven como punto de inicio para comenzar
la síntesis de ADN. En la PCR necesitamos dos
cebadores, cada uno complementario a una cadena
del ADN que buscamos amplificar. Estos
oligonucleótidos determinan la región del ADN a
amplificar.
ADN polimerasas
Las reinas de esta técnica bioquímica. En la PCR se
pueden utilizar diferentes ADN polimerasas,
obtenidas de varios organismos. Sin embargo, la
más utilizada dada su efectividad, es la ADN
polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus,
también llamada Polimerasa Taq. Esta polimerasa
es idónea para la PCR por su resistencia a las altas
temperaturas que se utilizan en el proceso.
Iones divalentes de magnesio
En la PCR se utilizan iones de carga positiva como
cofactores de la polimerasa. Estos cationes son
esenciales para la función de la ADN polimerasa.
cadena molde y permiten la incorporación de los
nucleótidos a la cadena creciente.
Solución tampón
Una solución tampón es una disolución que es
capaz de regular el pH, es decir, las condiciones de
acidez o basicidad, de nuestra PCR. Esto es muy
importante, porque los cambios en el pH de la
disolución pueden alterar los resultados de nuestra
PCR o evitar que se produzca
Estos son los ingredientes básicos. Sin embargo,
como en cualquier receta de cocina, necesitamos
algo (un instrumento) para procesar los
ingredientes y conseguir los resultados que
buscamos. En el caso de la PCR es muy importante
regular las condiciones de temperatura en las que
se encuentran las reacciones. Para ello, se utiliza un
“horno” especial, el termociclador.
Termociclador
Un termociclador es un aparato que regula la
temperatura en cada ciclo de la PCR. Gracias a él es
posible realizar esta técnica en muchísimo menos
tiempo, ya que, para realizarla, se debe modificar la
temperatura de la solución en varias ocasiones.
¡Bien! Ya sabemos qué elementos básicos
necesitamos para realizar una PCR. Ahora, solo nos
queda conocer el procedimiento a seguir en esta
técnica:
PROCESOS
 Los procesos que se llevan a cabo son:
desnaturalización, hibridación y
elongación.
 En primer lugar, es necesario que el DNA
se desnaturalice, es decir, que las dos
cadenas de DNA se separen. Esta primera
fase se conoce como desnaturalización y
se lleva a cabo elevando la temperatura a
alrededor de 94ºC.
 El siguiente paso consiste en un descenso
de la temperatura para permitir que los
cebadores se unan por
complementariedad al DNA molde. Esta
segunda fase se conoce como hibridación.
Temperaturas habituales en esta fase
oscilan entre 35 y 60ºC.
3.- IDENTIFICACION DE CADAVERES
1. El presente de la necro identificación
en general, y de la investigación
odontológica en particular, lo
constituye el estudio del ADN. El
descubrimiento de los marcadores
genéticos polimórficos constituye el
inicio de una nueva etapa en la biología
forense.
2. El ADN se encuentra contenido en los
elementos celulares del tejido pulpar
dental (odontoblastos, fibroblastos y
células endoteliales). Este, como tejido
conectivo laxo especializado, está
rodeado por otros tejidos duros.
3. La cavidad oral es una fuente útil de
ADN, ya que se obtiene a partir de la
saliva, las células de la mucosa oral y
de órganos dentales. La fuente
principal del ADN es la sangre, aunque
en diferentes situaciones de este tipo
de muestra no está disponible para el
análisis.
 Por último, en la fase de elongación o
extensión, la enzima polimerasa incorpora
nucleótidos complementarios a partir del
extremo 3’ libre de la región en que han
hibridado los cebadores. La temperatura a
la que se lleva a cabo esta fase depende
de la enzima polimerasa empleada; si se
utiliza Taq polimerasa (La polimerasa Taq
es un tipo de ADN polimerasa
termoestable, nombrada de esta forma
debido a que es producida por la bacteria
Thermus aquaticus) la temperatura de
elongación suele ser de 72ºC.
4. Cuando los tejidos del cuerpo se han
descompuesto y hasta cierto grado se
han quemado, las estructuras del
esmalte y el complejo pulpodentinal
pueden persistir, por lo cual se hace
necesario extraer el ADN de los tejidos
calcificados. En el laboratorio se debe
emplear la molienda criogénica, donde
un molino congelador con un émbolo
ferromagnético oscila hacia atrás y
hacia adelante en la alternancia de la
corriente eléctrica, usando nitrógeno
líquido, que se utiliza para enfriar la
muestra, la cual es extremadamente
frágil, pero protege al ADN de la
degradación de calor. El órgano dental
se reduce a polvo, a efectos de
aumentar la superficie y exponer las
células atrapadas con agentes
bioquímicos que liberan ADN o
suficiente material biológico para el
análisis de reacción en cadena a la
polimerasa (PCR). Finalmente, este
análisis produce un perfil de ADN que
se puede comparar con las muestras
ante mortem conocidas (cabello, uñas,
sangre almacenada, frotis, etc.) o
también llamado ADN paternal
4.- PATERNIDAD
La PCR-Sec prueba de exclusión de paternidad
se utiliza principalmente para determinar
relaciones de parentesco entre individuos,
esto se realiza identificando repeticiones
cortas en tándem (STRs) que son marcadores
moleculares utilizado para esta finalidad,
analizando secuencias del genoma muy
variables, es decir, que entre los individuos de
una población se encuentran diferentes
formas alternas denominadas alelos. Estas
secuencias permiten diferenciar a un individuo
de otro y al heredarse de padres a hijos,
permiten establecer relaciones biológicas de
parentesco, por lo que se les conoce como
marcadores genéticos o microsatélites (son
secuencias cortas del AND que se repiten
consecutivamente) cabe señalar que para cada
marcador una persona tendrá dos alelos, uno
materno y otro paterno y dicha combinación
de alelos que recibimos de nuestros padres se
le denomina genotipo, único e irrepetible para
cada individuo.
Como su nombre lo indica claramente, este es
uno de los genes que determina si somos
hombres o mujeres. Sin embargo, este gen no
es exclusivo de uno u otro sexo y está, de
hecho, presente tanto en el cromosoma
masculino como en el femenino. Sin embargo,
cuando el ADN se analiza, el cromosoma
masculino (cromosoma Y) muestra un pico
mucho más corto que en la Amelogenina del
cromosoma femenino (cromosoma X.)
La siguiente figura muestra un
electroferograma, gráfica en cuyos picos se
representan los dos alelos para cada STR
(marcador genético) y la escalera Alélica, que
es la referencia, donde se asignan todos los
posibles alelos en cada uno de los quince
marcadores. En una prueba de paternidad
incluyente, uno de los dos alelos del hijo debe
coincidir con uno de los dos alelos que
presente el padre.

Para realizar esta técnica primero se amplifica

el ADN humano mediante la Reacción en
cadena de la polimerasa, se consigue
amplificar en una sola reacción a los 15 STRs y
la amelogenina en una llamada PCR multiplex.

El Gen Sexual: Amelogenina

5.- AGRESION SEXUAL
Para no seguir agotando las muestras en la visualización microscópica se decide realizar una
extracción de ADN mediante la lisis diferencial. Este método permite realizar de forma conjunta una
visualización de espermatozoides tras la primera lisis y una extracción de ADN posterior, para
determinar si se obtiene un perfil genético de varón a partir de las muestras analizadas.

Tras la extracción de ADN a partir de las dos tomas vaginales de forma conjunta, los extractos
generados se cuantifican mediante PCR a tiempo real utilizando el sistema Quantifiler Duo (Applied
Biosystems) obteniéndose los resultados que se recogen. Se recurre al análisis de STR del cromosoma
Y para la detección del componente minoritario de varón mediante PCR. Los fragmentos generados
son separados en un secuenciador mediante electroforesis capilar en condiciones estándar y de alta
sensibilidad (purificación de productos de PCR y cambio en las condiciones de inyección aumentando
el tiempo y el voltaje