Anlisis de la protena de la clara de huevo

Facultad de Ciencias Bsicas |1

ANALISIS DE LA PROTEINA DE LA CLARA DE
HUEVO
FACULTAD DE CIENCIAS BSICAS, PROGRAMA DE QUMICA, UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI
.

Jackeline Montero
Montero.jacke@gmail.com

Victoria Arredondo
vickytoria1707@yahoo.com
Aracely Angulo
aracelyangulo28@hotmail.com
Yamileth Orozco
yamilunitaa@gmail.com




Resumen
Se estudi el comportamiento de las protenas que se encuentran presentes en la clara del huevo, cuando se someti una
solucin de clara a diferentes condiciones fsico-qumicas entre ellas la temperatura, Acetona, cido Ntrico, cido
Clorhdrico se present la desnaturalizacin debido a cambios en la estructura y enlaces dbiles entres los aminocidos que
conforma la protena; Sin embargo cuando la disolucin de la clara se somete a soluciones salinas y de NaOH 0,5 M se
observ un aumento en la solubilidad. Tambin se efectu una solubilizacin reversible con el sulfato de amonio y la
solubilizacin irreversible con el cido tricloroactico.
Adems, se efectuaron la reaccin xantoproteica la cual fue positiva por lo tanto confirmo la presencia de grupos fenlicos
en las protenas que constituyen la clara de Huevo. La reaccin de Biuret fue positiva confirmando la presencia de
protenas solubles. Generalmente se observ que las protenas de la clara del huevo son muy sensibles a la
desnaturalizacin cuando se cambian sus condiciones de pH, de temperatura y de concentracin inica en el medio.


Palabras Clave: Protenas, Desnaturalizacin, Reaccin Xantoproteca, Reaccin de biuret


I. INTRODUCCIN
Las protenas no son nicamente polipptidos,
son polipptidos con una secuencia de
aminocidos propia. Si se altera la secuencia de
aminocidos de una protena, pueden
producirse anomalas funcionales y
enfermedades.
La composicin de la clara y la yema de huevo
de gallina tanto del punto de vista cuantitativo
como cualitativo en % peso es:
Clara de Huevo: 88% Agua, 11% Protenas y
0.2% Grasa.
Yema de Huevo: 48% Agua, 17,5% Protenas,
32.5% Grasas.
Las protenas de la clara son: Ovoalbmina,
con albmina, Flavoprotena, Ovomucoide,
Avidina, Ovomucina, Cistatina, Lisozima.
La mayor parte de las protenas presentes en la
clara de Huevo son la Ovoalbmina.
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La albmina es una protena muy estable, de
carcter cido pI =4.8. Esta formada por una
nica cadena poli peptdica, de 582
aminocidos. En cuanto a su composicin de
aminocidos tiene alto contenido de
aminocidos cargados Asprtico, Glutmico,
Lisina y Arginina, as como de Cistena de las
que posee 35, formando puentes disulfuro. As
mismo tiene un bajo contenido de metionina y
triptfano.
2

Los 17 puentes disulfuro son la base de la
estructura nica de la molcula de albmina, de
su organizacin en nueve bucles agrupados en
tres dominios I, II y III.
2

Figura 1. Esquema de la disposicin en bluqes
de la albmina y principales sitios de unin de
los ligandos.
2

La desnaturalizacin de una protena es la
alteracin de su estructura secundaria, terciaria,
o cuaternaria, dejando intacta la estructura
primaria, el resultado de esto es que la protena
nativa (Como se encuentra en la clula) pierde
su actividad biolgica. En algunos casos el
proceso de desnaturalizacin es reversible. La
desnaturalizacin de las protenas ocurre
cuando se expone al calor, la luz ultravioleta,
los cidos, las bases, los disolventes orgnicos y
las sales de los metales pesados. Estos agentes
alteran la fuerza de dispersin, los enlaces de
hidrgeno y los enlaces inicos. En la siguiente
figura 2 se ilustra el proceso de
desnaturalizacin: Los enlaces disulfuro se
rompen por la accin del agente reductor.
3


Figura 2. Desnaturalizacin de la protena
3

Contenido de protena soluble es el factor ms
importante para fisicoqumica de la protena ya
que de aqu se dan propiedades y correlaciones
con propiedades funcionales tales como
emulsibilidad, formacin de espuma y la
gelificacin. Hamid-Samimi y Swartzel (1985)
menciona que el 5% de prdida de protena
soluble puede ser el lmite mximo para
producir un producto funcionalmente
aceptable.
4

Determinacin del grado de hidrlisis. Para el
seguimiento y control de la hidrlisis de
protenas es necesario evaluar el grado de
hidrlisis, DH, que se define:

DH = n enlaces peptdicos hidrolizados x 100
n total enlaces peptdicos

Los diferentes mtodos utilizados para medir el
DH se basan fundamentalmente en:

1) la determinacin de nitrgeno soluble tras
precipitar la protena con cido tricloroactico.
2) la determinacin de los grupos -amino
libres.
3) la valoracin del protn liberado tras la
ruptura de un enlace peptdico a determinados
pHs.
5


La reaccin xantoproteica es una prueba
funcional para determinar la presencia de
protenas y la reaccin de biuret se da cuando
la protenas reacciones con los iones sulfato de
cobre por medio de los pares de electrones
libres del Nitrogno que se encuentran
presente en los aminocidos.
3

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En este trabajo los principales objetivos son
determinar el efecto de la temperatura, los
solventes orgnicos, la concentracin salina, los
pH extremos y los iones metlicos pesados
sobre la estabilidad de las protenas de la clara
del huevo. Adems de analizar cuando ocurre
insolubilizacin reversible e irreversible; y
tambin aplicar la reaccin xantoproteca y la
reaccin de Biuret .
II. MTODO
1. Coagulacin de una protena:

Se colocaron 7 tubos de ensayo en una gradilla
y se enumeraron. Se separ 5 ml de la clara de
huevo en el tubo de ensayo 1, al resto se agreg
agua, se agit y se complet a 100 ml y se filtra.
A cada tubo se numer de 2 a 3 mL de la
solucin de albmina.

Tubo No. 1: Se calent suavemente y
poco a poco en un bao de agua,
controlando la temperatura mediante
un termmetro colocado en el interior
del tubo. Se determin la temperatura
a la cual se insolubiliza la protena.

Tubo No. 2: Se agregaron 2 ml de
acetona. Se dej en reposo y se
observ lo que pasaba al cabo de
algunos minutos.

Tubo No. 3: Se adicion 1 ml de HCl
9 N. Se observ lo que pasaba.

Tubo No. 4: Se adicion 2 ml de NaCl
al 20 %. Se observ lo que pasaba.

Tubo No. 5: Se adicion 2 ml de
HNO3 al 20%. Se observ lo que
pasaba.


Tubo No. 6: Se adicion 4 ml de
NaOH 5 M. Se observ lo que pasaba.


Tubo No. 7: Control


2. Precipitacin de la protena por
iones metlicos pesados:

En un tubo de ensayo se adicion 3 ml de la
solucin de albmina, y se adicion 1 ml de
acetato de plomo 0.005 M. Se observ lo que
pasaba. Posteriormente se adicion 1mL de
cido Etilendiamintetractico 0,05 M. Se agit
y se observaron los cambios.

3. Insolubilizacin reversible e
reversible:

En un tubo de ensayo se adicionaron 5 ml de la
solucin de albmina, se agregaron en
porciones pequeas y agitando para que se
disuelva bien, 2.36 g de Sulfato de Amonio. Se
observaron los cambios.

En otro tubo de ensayo, se adicionaron 5 ml de
la solucin de albmina y aada 1 ml de cido
Triicloroactico al 50 %. Se observaron los
cambios.
Se centrifugaron las suspensiones de ambos
tubos a 3000 r.p.m., durante 10 minutos. Se
separ el sobrenadante de ambos tubos por
decantacin, se desech y se conserv el
sedimento de ambos tubos. A cada tubo se
adicion 4 mL y se agit bien. Se observaron
los resultados.


4. Reaccin xantoproteca:

Se coloc en un tubo de ensayo 3 ml de la
solucin de albmina y agreg 3 ml de cido
ntrico al 20 %. Se observaron los cambios.
Se calent en un bao de agua por algunos
minutos. Se observaron los cambios.
Se enfri el tubo y posteriormente se
adicionaron 3 ml de Hidrxido de Amonio. Se
observaron los resultados.


5. Reaccin de Biuret:

Se adicion en un tubo de ensayo 3 ml de la
solucin de albmina. Se adicion el mismo
volumen de Hidrxido de Sodio 5 M, y 5 gotas
de sulfato Cprico 0.1 M. Se observaron los
cambios.

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III. RESULTADOS Y ANALISIS DE
RESULTADOS
Coagulacin de protenas:

Tabla 1. Resultados coagulacin de la protena
Tubo de ensayo Observaciones
Calor
La temperatura formacin
suspensin blanca fue de 62
C
Acetona
Se forma una suspensin
color blanco
HCl 9N
Se forma una suspensin
color blanco
NaCl 20%
No se forma nada visible
(Translcido)
HNO3 20%
Se forma una suspensin
color blanco
NaOH 5M
No se forma nada visible
(Translcido)
Control: slo
con solucin de
clara
Solucin Translcida
ligeramente turbia



Figura 4: Coagulacin de la protena


En sta prctica se trabaj con la clara de
huevo, puesto que all la protena se encuentra
con agua. Con la yema de huevo es muy difcil
trabajar ya que en ella se encuentra grasa que
pueden causar interferencias en las propiedades
de las protenas. Antes de iniciar con la
pruebas se verific que la clara quedar muy
bien separada de la yema para evitar cualquier
contaminacin con otra protenas.

En esta seccin experimental, se prepar una
solucin de clara y se observ el
comportamiento de la protena frente cidos
como el cido ntrico al 20%, cido clorhdrico
y solventes orgnicos como la acetona muy
similar ya que se present la coagulacin de la
protena, es decir que al agregar el agente
desnaturalizante la protena pierde sus
estructuras secundaria y terciaria y luego, como
un mecanismo de defensa y para su destruccin
se coagula formando una suspensin blanca.
Para analizar mejor lo que ocurre al agregar los
agentes desnaturalizantes se debe tener en
cuenta la siguiente tabla:

Tabla 2. Puntos isoelctricos protenas de la
clara del huevo2

Protena Punto isoelctrico
Ovoalbmina 4,5
Conalbmina 6,1
Ovomucoide 4,1
Lisozima 10,7
Ovomucina 4,5 5,0
Avidina 9,5
Cistatina 5,1

Al observar la tabla 7 y debido a que el cambio
en el pH modifica el punto isoelctrico, se
comprende como al agregar un cido a la clara
del huevo la cual tiene un pH normal de 7,6
7,9 el pH disminuye a tal punto que la protena
precipita. Este comportamiento se le llama
precipitacin de la protena por adicin de
cationes o aniones, dnde al adicionar a las
protenas el cido, se disminuye el pH dejando
a la protena por debajo de su punto
isoelctrico y con carga positiva, para luego
reaccionar con los aniones del cido originando
un producto insoluble que precipita.
6


La acetona genera un cambio en el entorno de
la protena pero no es capaz de romper los
enlaces covalentes en la cadena polipeptdica,
solo rompe la uniones relativamente dbiles
como las fuerza de vander waals y las
interacciones hidrofbicas, por lo que se
mantiene, en ltima instancia, la estructura
primaria
7


Las sales neutras ejercen efectos pronunciados
sobre la solubilidad de las protenas globulares.
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A baja concentracin, las sales incrementan la
solubilidad de muchas protenas, fenmeno que
recibe el nombre de solubilizacin por salado.
Las sales de los iones divalentes, MgCl2 y el
(NH4)2SO4, son mucho ms eficaces en la
solubilizacin de las protenas que las sales de
iones monovalentes, NaCl, NH4Cl y KCl. La
capacidad de las sales neutras para influir en la
solubilidad de las protenas est en funcin de
su fuerza inica, que constituye una medida,
tanto de la concentracin como del nmero de
las cargas elctricas existentes en los cationes y
los aniones aportados por la sal. Este
fenmeno denominado Salting in se observ
cuando se agreg el NaCl a la protena ya que
se observ cmo mejoro su solubilidad al
agregar la sal. Este mismo fenmeno se
observ con la solucin de Hidrxido de Sodio
5M por lo tanto las bases muy diluidas mejoran
la solubilidad y no generan una
desnaturalizacin irreversible.
2

La desnaturalizacin de protena por accin del
calor es un proceso irreversible debido a que
un aumento inusual de la protena provoca
mutacin en la protena y de esta forma y de
esta forma una prdida de su estabilidad y
actividad. A una temperatura norma de hasta
37C la protena conserva su estabilidad y
forma activa, sin embargo cuando esta
temperatura aumenta por encima de los 40C
o 50C, la protena se vuelve inestable e
inactiva. El calentamiento de la disolucin de la
protena causa un incremento en la energa de
vibracin y rotacin que pueden rebasar el
delicado equilibrio de interacciones dbiles que
estabilizan la conformacin plegada funcional.
Las temperaturas elevadas causan la
inactivacin irreversible por medio de cambios
covalentes.
8


Precipitacin de la protena por iones
metlicos pesados:

Tabla 3. Resultados reaccin con acetato de
plomo

Tubo de
ensayo
Observaciones
Solucin clara
con acetato de
plomo 0,005 M
Se forma una
suspensin blanca
Solucin clara
+ acetato de
plomo +
AEDT
Se precipitan sales y
el sobrenadante es
transparente



Figura 5. Solucin de albmina con Acetato
de plomo.


Figura 6. Solucin de albmina con Acetato
de plomo+EDTA vs Control

Por otra parte, se realiz el procedimiento de
mezcla la solucin proteica con acetato de
plomo y se observ al agregar este, la
formacin de la suspensin color blanco como
muestra la figura 3.
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Los Metales pesados, tales como el plomo (Pb)
y el mercurio (Hg), precipitan a las protenas y,
por lo tanto las inactivan perdiendo su eficacia
o funcin. Luego, al agregar el EDTA (cido
etilendiamino tetractico) el cual es un agente
quelante, este atrapa al metal Pb y forma un
quelato, que permite que la protena vuelva a
solubilizarse en el medio como muestra la
figura 6 en donde se aprecia este fenmeno y se
obtiene una solucin translcida nuevamente.
6


CH
2
CH
2
H
2
C
CO
CH
2 O
O
Pb
N
O O
N
CH
2
OC
CH
2
CO
CO


Figura 7. Complejo del Pb con EDTA

Insolubilizacin reversible e irreversible:

Tabla 4. Resultados insolubilizacin reversible
e irreversible

Tubo de
ensayo
Observaciones
Centrifugaci
n y dilucin
del
sedimento
en agua
Solucin
albmina
clara +
sulfato de
amonio
Se forma una
suspensin
color blanco
La suspensin
blanca se
solubiliza y
desaparece
Solucin
albmina
clara +
cido
tricloroac
tico
Se forma una
suspensin
color blanco
La suspensin
blanca no
desaparece



Figura 7. Solucin de albumina + sulfato de
Amonio-Solucin de albumina + acido
tricloroactico



Figura 8. Control-Solucin de albumina +
cido tricloroactico - Solucin de albumina +
sulfato de Amonio-

La solubilizacin reversible ocurre cuando se le
agrega a la protena sulfato de amonio que es
una sal y como al agregar esta ocurre
precipitacin salina como se mencion
anteriormente la protena precipita.
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Luego por centrifugacin a 3000 r.p.m durante
10 minutos se favorece an ms la
precipitacin y la desnaturalizacin.
Es importante destacar que en esta parte del
proceso la nica protena que precipit fue la
ovoalbmina ya que se requiere de una
solucin saturada de la sal sulfato para lograr
esto, mientras que las otras protenas precipitan
cuando la concentracin de la sal es
50%(m/V).
4


Al agregar el cido tricloroactico ocurre un
descenso del pH por debajo el punto
isoelctrico y hace que estas protenas
precipiten formando la suspensin blanca.
Posteriormente, ambos slidos se diluyen con
agua y se observa que el slido tratado con la
sal es soluble mientras que el tratado con cido
no.
Se cree que esto ocurre debido a que es posible
renaturalizar una protena quitando el agente
desnaturalizante, en el caso de la sal al agregar
agua nuevamente al precipitado se disminuye
nuevamente la fuerza inica y las protenas
comienzan a tomar sus formas estructurales
superiores.
Mientras que con el residuo cido no ocurre lo
mismo porque ya se ha formado un nuevo
producto insoluble entre el anin del cido y las
protenas, y por lo tanto el precipitado final
permanece.


Figura 9. Control- Solucin de albumina +
sulfato de Amonio+ Agua -Solucin de
albumina + cido tricloroactico + Agua


Reaccin Xantoproteica


Figura 10. Proceso reaccin xantoproteca.
Izquierdo adicion de cido Nitrico- Derecho
Calentamiento

En la reaccin xantoproteica se utiliz para
determinar la presencia o no de protenas en
una en la clara del huevo.
Esta reaccin fue positiva debido a la presencia
de un grupo fenilo en la molcula proteica. Los
complejos de la molcula proteica que son de
importancia en esta reaccin son la tirosina y el
triptfano. La fenilalanina no reacciona en las
condiciones que se realiza en el laboratorio. La
reaccin xantoproteica a su vez se puede
catalogar con una sustitucin electrofilica
aromtica debido a que al tratar un compuesto
con cido ntrico y calor se produce una
nitracin del anillo aromtico que se manifiesta
en un compuesto color amarillo.
7





Figura 11. Reaccin Xantoproteica Vs Control

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Figura 11. Reaccin Xantoproteca

Reaccin de Biuret:


Figura 12. Prueba de Biuret positiva.

El mtodo de biuret fue la prueba simple y la
por medio de la cual fue posible confirmar la
presencia de protenas solubles en la clara del
huevo. Las protenas que contienen dos o ms
enlaces peptdicos forman un complejo
purpura violeta con las sales de cobre II como
el que se observa en la figura 12, es posible que
este color se deba a la formacin de un in
coordinado tetra cprico con dos grupos amida
adyacentes como se observa en la figura 13.
9


El desarrollo de color es diferente para cada
protena y su intensidad se puede determinar
espectroscpicamente a 540 nm


Figura 13. Formacin del complejo protena y
Cobre II.

IV. CONCLUSIONES
Las protenas en la clara del huevo pueden
desnaturalizarse con mucha facilidad, tan solo
por agitacin; tambin lo hacen por calor, por
diferencias del pH, por aumento de la fuerza
inica y por iones metlicos pesados.
La protena del huevo se mantiene estable y
activa a temperaturas menores de 37C por lo
tanto es la temperatura ideal para la coccin de
un huevo.

La desnaturalizacin puede ser reversible e
irreversible, este efecto es un comportamiento
verstil de las protenas y de que sea reversible
o no depende del medio en que se encuentre la
protena y de su estructura conformacional.

Se puede separar una protena mediante
precipitacin salina con sulfato de amonio o
mediante centrifugacin diferencial.

La reaccin xantoproteica fue positiva para la
clara de huevo confirmando la presencia
aminocidos aromticos en la protena del
huevo.

La prueba de Biuret fue positiva para la clara de
huevo por lo tanto se confirm la presencia de
protenas solubles. Esta tcnica fue cualitativa
sin embargo la intensidad del compuesto
coloreado formado permite la cuantificacin de
protena por mtodos espectrofotomtricos.

Los metales pesado son causantes de la
desnaturalizacin de las protenas sin embargo
es una reaccin reversible gracias a que el
EDTA secuestra el metal dejando la protena
libre nuevamente.

V. REFERENCIAS

1. Javier, H. ESTUDIO SOBRE LA DESNATURALIZACIN DE
PROTENAS Y DETERMINACIN DE ALGUNAS PROPIEDADES DE LAS
PROTENAS Revista Innovacin y Experencias Educativas. [Online],
2010.
Anlisis de la protena de la clara de huevo
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2. Teijn, J. M., Fundamentos de bioqumica estructural.
Tbar: 2006.
3. Qumica Orgnica. Euned.
4. Wu, L.; Zhao, W.; Yang, R.; Chen, X., Effects of pulsed
electric fields processing on stability of egg white proteins. Journal of
Food Engineering 2014, 139 (0), 13-18.
5. GUADIX , A. G. U., E. M.; PEZ -DUEAS , M. P.;
GONZLEZ -TELLO , P. Y CAMACHO , F., Technological processes and
methods of control in the hydrolysis of proteins. Ars Pharmaceutica
2000, 41:1, 79- 89.
6. Mora, S. Q., Manual de experimentos de laboratorio para
bioqumica. Euned.
7. Bioqumica: la Ciencia de la Vida. Euned.
8. Melo, V.; Ruiz, V. M.; Cuamatzi, O., Bioqumica de los
procesos metablicos. Revert: 2007.
9. V, N. B.; C, G. L.; R, C. H. H., Qumica de Alimentos:
Manual de laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica: 2003.