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Centro de Bachillerato

Tecnolgico e Industrial y
de Servicios 108

MTODOS PARA LA DETERMINACIN DE


PORTENAS EN LOS ALIMENTOS.

Laboratorista Qumico 5 B
Analiza muestras de alimentos y bebidas alcohlicas con base a
normas.
Catedrtico: Miguel ngel
Francisco Eduardo Aguilar Cruz No.4
Andrea Guadalupe Aguilar Gmez No.5
Hctor Eduardo Cansino Soto No.14
Fatima Alejandra Daz Mazariegos No.18
Carolina Hernndez Bermudez No.23
Sinar Pascacio Rojas No.40
Sonia Jaqueline Velasco Castro No.48
Pablo Ramn Ventura Suaznavar No.49
Metodo de Kjeldahl
INTRODUCCIN
En el trabajo de rutina se determina mucho ms frecuentemente la protena
total que las protenas o aminocidos individuales. En general, el
procedimiento de referencia Kjeldahl determina la materia nitrogenada total,
que incluye tanto las no protenas como las protenas verdaderas (Aurand et
al, 1987) El mtodo se basa en la determinacin de la cantidad de Nitrgeno
orgnico contenido en productos alimentarios, compromete dos pasos
consecutivos: a) La descomposicin de la materia orgnica bajo
calentamiento en presencia de cido sulfrico concentrado. b) El registro de
la cantidad de amoniaco obtenida de la muestra

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS


o 1 matraz Kjeldhal o Hidrxido de sodio al 40%
o 1 trampa de vapor (Kjeldhal) o Zinc granulado
o 1 matraz Erlenmeyer 500ml o Sulfato de cobre
o 2 esptulas pentahidratado
o 1 pipeta de 10ml o Sulfato de sodio anhidro
o 1 jeringa (pipetero) o cido clorhdrico 0.1N
o Equipo necesario para titular o cido brico al 2%
o Mangueras para el equipo o Parafina
Kjeldhal o Rojo de metilo preparado
o Perlas de ebullicin o Azul de metileno preparado
o Papel tornasol o Balanza analtica
o cido sulfrico concentrado
o
o Indicador Shiro Tashiro: Mezclar 2 partes de rojo de metilo y una de
azul de metileno.
o
o
o PROCEDIMIENTO
o
1. Determinar la masa, en la balanza analtica, de aproximadamente un
gramo de muestra y pasarla a un matraz Kjeldahl, aadirle 2 g de
sulfato de cobre, 10 g de sulfato de sodio anhidro, 25ml de cido
sulfrico concentrado y unas perlas de ebullicin.
2. Colocar el matraz en el digestor y calentar cuidadosamente a baja
temperatura hasta que todo el material est carbonizado, cada 10
minutos se deber girar el matraz.
3. Aumentar gradualmente la temperatura hasta que la disolucin est
completamente clara y dejar por 30 minutos ms a esa temperatura.
4. Enfriar y aadir de 200 a 300ml de agua para disolver completamente
la muestra, agregar 3 4 grnulos de zinc, un poco de parafina cuando
sea necesario (muy poca) y 50ml de hidrxido de sodio al 40%.
5. Inmediatamente conectar el matraz a un sistema de destilacin, el cual
previamente se le ha colocado en la salida del refrigerante un matraz
Erlenmeyer de 500ml que contenga 50ml de cido brico y unas gotas
del reactivo Shiro Tashiro como indicador.
6. Destilar hasta que haya pasado todo el amoniaco, que unas gotas de
destilado no den alcalinidad con el papel tornasol, aproximadamente
300ml.
o NOTA: Las primeras gotas de destilado deben hacer virar el color del
indicador de violeta a verde.
7. Retirar el matraz recibidor y titular el destilado con cido clorhdrico
0.1 N
o
o EXPRESIN DE RESULTADOS
o
o El Nitrgeno presente en la muestra, expresado en por ciento se
calcula mediante la siguiente frmula:
o
o % de nitrgeno = V x N x 0.014 x 100 m
o En donde: V = Volumen de cido clorhdrico empleado en la titulacin
en ml
o N = Normalidad del cido clorhdrico.
o m = Masa de la muestra en g. 0.014 = Miliequivalente del nitrgeno.
o
o El por ciento de protenas se obtiene multiplicando el por ciento de
nitrgeno obtenido por el factor correspondiente
o
o El contenido de nitrgeno en diferentes protenas es aproximadamente
de 16% por lo que multiplicando el por ciento de nitrgeno obtenido
por el factor 6.25 se obtiene la cantidad de protenas presentes en el
alimento.
o

o Metodo de Lowry
o

o FUNDAMENTO TERICO
o El mtodo de Lowry| (1951) es un mtodo colorimtrico de valoracin
cuantitativa de las protenas. A la muestra se aade un reactivo que
forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la intensidad de
color proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de
Lambert-Beer A= .l.c Este mtodo consta de dos etapas: 1) Los
iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando
complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos
complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems, provocan
el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena,
exponindose los residuos fenlicos de tirosina que van a participar en
la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin
alcalina en forma de su complejo con tartrato. 2) La reduccin,
tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los
grupos fenlicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayora de
las protenas, actuando el cobre como catalizador. El principal
constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido
fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los
grupos fenolicos da lugar a un complejo de color azul intenso.
o
o Reaccin entre la protena y los reactivos
o 2.- MATERIALES Y REACTIVOS
o Tubos de ensayo
o Tubos Falcon (50 mL)
o Pipetas
o Colormetro
o Cubetas de colormetro
o gitadores de tubos
o
o Reactivo A: Na2CO3 al 2%, NaOH 0,1 M
o Reactivo B1: CuSO4 5H2O al 1% - Reactivo
o B2: tartrato sdico-potsico al 2% - Reactivo
o C: Se prepara, mezclando los reactivos: A, B1 y B2, en proporciones
50:0,5:0,5 (en volumen)
o Reactivo Folin-Ciocalteau: reactivo comercial diluido a 1/4
o Solucin patrn de albmina de suero bovino (BSA) (2 mg/mL)
o Muestra problema
o
o 3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Para determinar la concentracin
de protenas de la muestra problema se construye una curva patrn o
de calibrado a partir de una solucin patrn (BSA) (2 mg/mL). La
concentracin que tienen las muestras problema se determina por
interpolacin de los valores de absorbancia en la curva patrn. El tubo
0, que slo contiene agua destilada y los reactivos, sirve de blanco
para el ajuste del colormetro a cero de absorbancia.
o Pasos a seguir:
1. Numerar del 0 al 6, tubos de plstico de 10 Ml
2. Pipetear las cantidades de agua, solucin patrn de albmina y
solucin problema sealadas en la tabla.
3. Preparar el reactivo C, a partir de A, B1 y B2
4. Pipetear a todos los tubos el reactivo C. Mezclar el contenido de cada
tubo y dejarlo reposar 15 minutos en oscuridad (dentro de la taquilla).
5. A continuacin aadir a todos los tubos el reactivo de Folin (diluido
1/4), mezclando bien por agitacin. Dejar reposar 30 minutos en la
oscuridad para que as se desarrolle completamente la reaccin
coloreada. f) Leer las absorbancias en el colormetro a 580 nm.
Previamente el aparato se ajusta a Absorbancia=0 con el blanco (tubo
n 0); de esa forma slo se mide el color producido por las protenas,
puesto que se resta el color debido a los reactivos. Anotar la medida
de absorbancia en la tabla.
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o

o Mtodo de Bradford
o

o FUNDAMENTO
o Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-250 (tambin
Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe en
dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma
azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de
extincin mayor que el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15
g), simple, rpido, barato y pocas sustancias interfieren en su
determinacin. Entre las sustancias que interfieren estn los
detergentes y las soluciones bsicas.
o
o MATERIALES Y REACTIVOS
o Reactivo de Bradford
o Tubos de ensayo
o Pipetas de automticas regulables de 20-100 l y de 200-1000 l
o Espectofotmetro
o Agua destilada
o Soluciones estndar de protena
o PROCEDIMIENTO
o Reactivo de Bradford Reactivo preparado del siguiente modo:
mezclar 10 mg de Comassie Blue G-250 con 10 ml de fosfrico al 88%
y 4,7 ml de etanol absoluto. Aadir H2O hasta 100 ml. Filtrar a travs
de papel de filtro y guardar en la oscuridad.
o Soluciones estndar de protenas
o Seroalbmina bovina 20 mg/ml
o Seroalbmina bovina 0,5 mg/ml
o Seroalbmina bovina 0,1 mg/ml
o Muestras M1 y M2
o La muestra M1 debe tener una concentracin de protenas entre 10
20 mg/ml
o La muestra M2 debe tener una concentracin de protenas entre 0,1-
0,5 mg/ml
o Aadir 1 ml del reactivo de Bradford a los tubos estndar y muestras
problemas preparadas como se indica en la Tabla IV. Dejar a
temperatura ambiente y leer Absorbancia a 595 nm frente al blanco. El
color es estable 1 hora
o
o

o
o

o Mtodo de Biuret
o
o
o
o FUNDAMENTO:

o Las protenas ocupan un lugar de mxima importancia entre las


molculas constituyentes de los seres vivos (biomolculas).
Prcticamente todos los procesos biolgicos dependen de la presencia
o la actividad de este tipo de molculas (Berg et al, 2008).
o Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es
una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de
purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la
actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico
de enfermedades, as como para muchos otros propsitos. Existen
diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de
estos mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas
para absorber luz en el UV, b) para la formacin de derivados
qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de unir ciertos
colorantes (Segal, 2005).

o La reaccin de biuret es una reaccin coloreada (violeta) debida a la


formacin de un complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos
que poseen ms de un enlace peptidico, como las proteinas (Cambell
et al, 2006):

o MATERIAL

o Mortero De Pistilo
o Gotas De Hidroxido De Sodio
o Mechero
o 24 Tubos De Ensaye
o Albumina Cericabumina
o Cloruro De Sodio Al 0.9%
o Reactivo Biuret
o Vortex
o Vaso Pp 1000 Ml
o Espectrofotometro

o MTODO

o Primero, se dispuso a tomar la casena y macerar con ayuda de un


mortero con pistilo, despus se pes para ocupar 0.1g para una
solucin de 1:10, al no disolverse bien se le agregaron gotas de
hidrxido de sodio hasta llegar a la homogenacin deseada, tambin

o Se realiz la solucin de leche 0.05ml para una solucin 1:20 y se


disolvieron en agua; Al mismo tiempo se calentaba agua hasta llegar a
una temperatura de 500C a 550C.

o A continuacin, se separaron 24 tubos de ensaye en dos grupos de 12


A y B los seis primeros se utilizaron para obtener la curva patrn y los
otros seis para obtener la curva problema esto en los dos grupos, el
tubo 1 se ocup como blanco, al tubo 2 0.1ml, al 3 0.2ml, al 4 0.4ml, al
5 0.8ml, al 6 1.0ml de albumina srica bovina (BSA) con concentracin
de 10 mg/ml, respectivamente.

o En seguida, los tubos 7 con 0.25ml y 8 con 0.5ml de casena, el 9 con


0.25ml y el 10 con 0.5ml de sobrenadante, el 11 con 0.25 ml y el 12
con 0.5ml de leche diluida, (todo esto obtenido en la prctica anterior);
a todos los tubos se les agrego Cloruro de Sodio al 0.9% con diferente
cantidad de 2.9ml al 2, 2.8ml al 3, 2.6ml al 4, 2.2ml al 5 y 2ml al 6.
Para tener una solucin de 3ml y reactivo de Biuret con la misma
cantidad de 3 ml, as logramos una solucin de 6ml, se homogenizo la
solucin por medio de un agitado tipo vortex. (Solamente al tubo 1 se
le agregaron 3 ml de reactivo de biuret y 3 ml de NaCl)

o Despus de tener todos los tubos con la solucin se colocaron en un


vaso de precipitados de 1000 ml con agua caliente y se dejaron
durante 10 minutos aproximadamente (hasta lograr tonalidades de
azul cielo a violeta), al trmino del tiempo se colocaron en agua a
temperatura ambiente, hasta lograr que se enfriara la solucin.

o Posteriormente se realiz la cuantificacin de la solucin por medio de


un espectrofotmetro a 540 nm de los tubos A y B, entre cada
medicin se lavaban las celdas; al tener todas las mediciones se
dispuso a realizar la curva obtenida.

o RESULTADOS

o Los valores de absorbancia obtenidos con el espectrofotmetro a 540


nm para cada una de las 12 soluciones se muestran a continuacin
(solamente se muestran los tubos A y no los duplicados):

o Tabla 1: Valores de absorbancia de cada una de las muestras.

o
o Absor
o Tu
banci
bo o Proten
o Solucin * a
No a (mg)
o a 540
.
nm
o 1 o 3 ml NaCl, o 0 o Blanco
o 2 o 0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl o 1 o 0.034
o 3 o 0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl o 2 o 0.071
o 4 o 0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl o 4 o 0.142
o 5 o 0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl o 8 o 0.277
o 6 o 1 ml BSA y 2 ml NaCl o 10 o 0.345
o 7 o 0.25 ml casena y 2.75 ml o ? o 0.079
NaCl
o 8 o 0.5 ml casena y 2.5 ml o ? o 0.198
NaCl
o 9 o 0.25 ml sabrenadante y o ? o 0.221
2.75 ml NaCl
o 10 o 0.5 ml sobrenadantey 2.5 o ? o 0.240
ml NaCl
o 11 o 0.25 ml leche diluida y 2.75 o ? o 0.044
ml NaCl
o 12 o 0.5 ml leche diluida y 2.5 o ? o 0.068
ml NaCl
o *A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de Biuret.
o
o
o Con los valores de la tabla anterior, tubos dos a seis, se realiz la
grfica 1, de la curva patrn de protena, obtenida por el mtodo de
regresin lineal de mnimos cuadrados; donde las abscisas (x)
representan la concentracin en mg de protena, y las ordenadas (y)
los valores de la absorbancia de cada concentracin.

0.35
f(x) = 0.03x + 0
R = 1
0.3

0.25

0.2

Absorbancia a 540 nm
0.15

0.1

0.05

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Proteina (mg)

o Figura 2: Curva patrn de protena.

o
o
o La determinacin de la cantidad de protena en las muestras problema,
tubos siete a doce, se obtuvo con el valor de la absorbancia obtenida
por el espectrofotmetro para cada muestra (tabla 1), mediante la
interpolacin de estos valores en la curva patrn (figura 3) y despejado
los valores respectivos de x de la ecuacin de la recta (y= mx + b) tal
como se muestra a continuacin (tabla 2):

o
o
o Figura 3: interpolacin de los valores de absorbancia de las muestras
problemas en la curva patrn.
o
o De acuerdo a la figura anterior, la cantidad aproximada de protena en
las muestras problema, de la siete a la doce, seria: 2.35, 5.7, 6.2, 6.9,
1.05 y 1.9 mg, respectivamente.

o
o La determinacin de la cantidad de protena en las muestras problema
despejando los valores de x de la ecuacin de la recta (y = 0.0344X
+0.0017) quedara:
y0.0017
o x=
0.0344

o
o Tabla 2: determinacin de la cantidad de protena utilizando
o la ecuacin de recta.
o

o Tubo No. o Absorbancia (y) a 540 nm o Protena (mg)


o 7 o 0.079 o 2.218
o 8 o 0.198 o 5.706
o 9 o 0.221 o 6.375
o 10 o 0.240 o 6.927
o 11 o 0.044 o 1.229
o 12 o 0.068 o 1.927
o

o Tomando en cuenta los factores de disolucin, por cada mililitro de


muestra se obtiene la siguiente tabla:

o
o Tabla 3: Concentracin de protena en las muestras problema.
o

o Tubo o Protena o Factor de disolucin o Protena (mg/ml)


No. (mg)
o 7 o 2.218 o 4x100 o 887.2
o 8 o 5.706 o 2x100 o 1141.2
o 9 o 6.375 o 4x10 o 225
o 10 o 6.927 o 2x10 o 138.54
o 11 o 1.229 o 4x20 o 98.32
o 12 o 1.927 o 2x20 o 77.08
o
o

o A continuacin se resumen los resultados finales en la siguiente tabla:

o Tabla 4: resultados finales de la concentracin de protena

o o Prot
o Absor
T o Prot ena
banci
ena (mg/
o Solucin * a
o o (mg ml)
o a 540
)
nm
o o 3 ml NaCl, o 0 o 0 o Blanc
1 o
o o 0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl o 1 o 10 o 0.034
2
o o 0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl o 2 o 10 o 0.071
3
o o 0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl o 4 o 10 o 0.142
4
o o 0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl o 8 o 10 o 0.277
5
o o 1 ml BSA y 2 ml NaCl o 10 o 10 o 0.345
6
o o 0.25 ml casena y 2.75 ml NaCl o 2.21 o 887. o 0.079
7 8 2
o o 0.5 ml casena y 2.5 ml NaCl o 5.70 o 1141 o 0.198
8 6 .2
o o 0.25 ml sabrenadante y 2.75 ml o 6.37 o 225 o 0.221
9 NaCl 5
o o 0.5 ml sobrenadantey 2.5 ml NaCl o 138. o 0.240
1 o 6.92 54
7
o o 0.25 ml leche diluida y 2.75 ml o 98.3 o 0.044
1 NaCl o 1.22 2
9
o o 0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl o 77.0 o 0.068
1 o 1.92 8
7
o *A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de Biuret.

o Mtodo BCA
o
o

o CUANTIFICACIN DE CONCENTRACIN DE PROTENAS POR


BCA
o
o Fundamento:
Las protenas pueden llevar a cabo funciones tan diversas por la
enorme posibilidad de combinaciones en la composicin y secuencia
de aminocidos.
Las protenas tambin se clasifican segn su composicin, las que se
forman solo de residuos de aminocidos y no tienen otras biomolecular
son PROTENAS SIMPLES; no todas las protenas son solubles en agua,
de hecho las protenas insolubles son esenciales para dar soporte y
mantener la integridad estructural de las clulas y organismos.
o
o
o Utilizamos: Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific)
o
o 1-Preparacin de reactivo BCA
o En 1 tubo de 10 ml , mezclamos Reagent A y Reagent B del kit, en la
siguiente proporcin :
o
o 50 l Reagent A / 1 l Reagent B
o
o Utilizamos placa de 96 pocillos
o
o 2- Preparacin de recta patron de BSA (Bovine Serum Albumin)
o El patrn de BSA que viene con el kit tiene una concentracin de
2mg/ml. Ajustar el volumen de BSA dependiendo de la concentracin
del stock.
o
o g BSA o BSA l o BCA l
o 0 o 0 o 100
o 1 o 0.5 o 100
o 2 o 1 o 100
o 5 o 2.5 o 100
o 10 o 5 o 100
o 15 o 7.5 o 100
o 20 o 10 o 100
o
o Lo hacemos por triplicado para tener 3 lecturas
o
o Esto se usa para generar una muestra patrn con g BSA en abscisas,
y A562 en ordenadas. La recta es buena si 0.98<R2<1
o
o 3- Preparacin de muestras a cuantificar (normalmente por triplicado,
pero depende de la cantidad de muestra que tengamos y la
concentracin que estimemos a ojo: si creemos que nuestra muestra
est muy concentrada, se pueden hacer diluciones de uso para medir,
ej. 1:2, o 1:5, usando buffer de lisis para no cambiar la composicin,
que puede afectar a las medidas).
o
o x l muestra + 100 l BCA
o
o 4- Incubar 30 minutos a 37 C , en estufa.
o
o 5- Lectura de valores de absorbancia en espectrofotmetro a =562
nm (algunos espectrofotmetros adquieren a 560 nm, esa medida
tambin vale).
o
o 6- Idealmente, interpolamos los valores obtenidos en la recta patrn (si
no se pasan por mucho, se puede extrapolar usando la frmula; si los
valores se pasan por mucho, hay que repetir la recta usando diluciones
de los lisados).
o
o 7- La concentracin final en g /ml viene dada por la media de valores
para un volumen dado de muestra dividido entre los l de volumen.
o
o Ej: en 3 l de muestra, obtenemos unos valores por
interpolacin de:
o 2.5 g
o 3 g
o 3.5 g
o
o el valor medio de estas medidas es 2.5 + 3 + 3.5 = 3 g
o 3 medidas
o
o 3 g = 1 g/l de protena en nuestro lisado
o 3 l muestra
o
o
o