Docente

ALBA LUCY ENRIQUEZ B.

UNIVERSIDAD DE NARIÑO
PRACTICA DE BIOQUIMICA
REACCIONES DE CARACTERIZACION DE AMINOÁCIDOS Y PROTEINAS

1, FUNDAMENTOS:

Para conocer si en una determinada muestra biológica hay proteínas pueden utilizarse numerosas reacciones de
identificación, unas relacionadas con la presencia en la cadena polipeptídica de determinados aminoácidos
generalmente triptófano y tirosina o bien basarse en la misma estructura polipeptídica, como es el caso de la reacción
del Biuret, propia de las series de al menos 2 enlaces peptídicos contiguos y que, por tanto, permite valorar casi todos
los tripéptidos y todos los péptidos del orden superior incluidas las proteínas. A continuación se exponen las principales
reacciones de caracterización de los aminoácidos, en las cuales se tiene en cuenta la reacción con el grupo Amino, o
la presencia de Azufre en algunos de ellos o la importancia que tiene el poseer una estructura Aromática lo que origina
unas características especiales.

REACCIÓN DE LA NINHIDRINA:
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con el grupo amino de aminoácidos libres y con los grupos amino
de la molécula proteínica para dar un compuesto azul violeta. Los aminoácidos prolina e hidroxiprolina también
reaccionan con la ninhidrina pero en este caso se obtiene un color amarillo en lugar del violeta. La reacción es muy
sensible por lo cual se utiliza en cromatografía y en la detección de aminoácidos y proteínas en muestras biológicas.

REACCIÓN DEL BIÚRET:

Cuando una disolución alcalina de sustancias que contienen enlaces peptídicos tales como el Biuret, la oxamida, los
polipéptidos y las proteínas, se añade sulfato cúprico, se forman sales complejas de color violeta. El nombre de
“reacción del biuret” proviene de un derivado de la urea, el biuret, que, en condiciones apropiadas, da esta reacción. El
biuret se forma en el curso del calentamiento de la urea, con desprendimiento de amoniaco.

El biuret contiene en su molécula dos enlaces amida sucesivos, de modo análogo a las proteínas, donde se presentan
numerosos enlaces peptídicos sucesivos. Este biuret en medio alcalino forma unos complejos de coordinación con el
cobre, de color azul morado característico. La reacción es cuantitativa y permite valorar la presencia de proteínas con
bastante exactitud e independientemente del tipo de proteína.

REACCIÓN XANTOPROTEÍCA
La reacción xantoproteíca (del griego xanthos, amarillo) permite descubrir en la molécula de proteína la presencia de
aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano).
Estos aminoácidos, al nitrarse, producen un compuesto de color amarillo, característico de los nitrobencenos. No todas
las proteínas dan positiva esta reacción ya que en unas pocas la presencia de tirosina, triptófano y fenilalanina es
extremadamente baja o nula. Este es el caso de la gelatina derivada del colágeno.

REACCIÓN DE MILLON
Esta reacción se debe a la presencia, en la molécula de proteína, de la tirosina, que tiene en su composición un grupo
fenólico. Este, por calentamiento con el reactivo de Millón (una mezcla de nitrato y nitrito mercúrico disueltos en ácido
nítrico concentrado), produce una coloración roja que se debe a la formación de nitrotirosina que, por adición de mercurio
en el curso del calentamiento, se transforma en una sal mercúrica de color rojo.

RECONOCIMIENTO DE ARGININA
La arginina, en presencia de α-naftol, se oxida con hipobromito, o hipoclorito de sodio un grupo imino. La arginina
oxidada, al combinarse con otra molécula de α-naftol, forma una sustancia de color rojo que permite reconocerla.

RECONOCIMIENTO DE TRIPTÓFANO.
El triptófano en presencia de iones de magnesio y de ácido oxálico (reactivo de Hopkins-Cole) y con la presencia de un
ácido mineral, como el ácido sulfúrico, produce coloraciones violetas en la interfase que se forma, debido a la formación
de complejos con el grupo indol del triptófano.

DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS EN LAS PROTEÍNAS

La determinación de la presencia de aminoácidos sulfurados se realiza mediante una hidrólisis (puede ser incompleta)
de la proteína en un medio fuertemente alcalino, que conlleva a la destrucción de los aminoácidos sulfurados liberando
el azufre que contienen en forma de sulfuro, ion que se puede poner de manifiesto con la adición de una sal soluble de
plomo, con el que precipita el sulfuro de plomo, de color negro fácilmente reconocible:

2. OBJETIVOS:
• Efectuar algunas reacciones para comprobar la presencia de proteínas.
• Comprobar la presencia de algunos aminoácidos en forma libre o haciendo parte de las proteínas con base en las
reacciones características de los grupos funcionales de esos aminoácidos.

3. MATERIALES Y REACTIVOS:
Baño maría 10 ml ninhidrina al 0.1% en acetona
Hielo 10 ml NaOH 30%
20 ml caseína 0.5% 1 ml sulfato cúprico 1%
20 ml gelatina 0.5% 10 ml ácido nítrico concentrado
20 ml suero sanguíneo 10 ml reactivo de Millón
1 clara de huevo diluida en 20 volúmenes de agua 10 ml de reactivo de Hopkins-Cole. 10 g de Mg en polvo
20 ml glicina 0.1% diluirlos en agua, se agrega 250 ml de ácido oxálico
5 ml prolina 0.1% fresco. Se agita y se filtra. Se acidifica el filtrado con
10 ml metionina 0.1% ácido acético y diluir hasta 1 litro con agua.
5 ml fenilalanina 0.1% 10 ml de ácido acético glacial.
10 ml tirosina 0.1% 1 ml α-naftol 0.05% en etanol-agua (1: 1)
5 ml triptófano 0.1% 1 ml hipobromito sódico 1N
5 ml arginina 0.1% en ácido sulfúrico 0.1N 10 ml acetato de plomo 5%
5 ml cisteina 0.1% en ácido clorhídrico 0.1N 10 ml de nitrito de sodio. 1%
5 ml cistina 0.1% en ácido clorhídrico 0.1N

MATERIAL QUE DEBE TRAER CADA GRUPO DE ESTUDIANTES:

Clara de un huevo, Un sobre de Gelatina sin sabor, y una cucharada de leche de soya en polvo, fosforera,
marcador o cinta de enmascarar, guantes, gafas, franela, tapabocas.

CONSULTA PREVIA AL LABORATORIO

Consultar la fórmula general de un aminoácido, y las estructuras de los siguientes aminoácidos: Glicina,
Alanina, Tirosina, Triptófano, Fenilalanina, Arginina, Cistina, Cisteina, Metionina.

4. PROCEDIMIENTO:

1. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS:

• Disolver en 100ml de agua a 37° medio sobre de gelatina sin sabor
• Solubilizar la clara de un huevo en con el doble de agua destilada
• Muestra de leche de soya: Diluir 5 g, en 100 ml de agua

ANTES DE COMENZAR EL LABORATORIO ROTULAR LOS TUBOS DE ENSAYO CON LOS NOMBRES DE LOS
AMINOACIDOS Y PROTEINAS QUE SE ENCUENTRAN EN LA MESA DE TRABAJO, ASI COMO CON LOS
NOMBRES DE LAS MUESTRAS PROBLEMAS DE PROTEINAS Y LA MUESTRA PROBLEMA DE AMINOACIDOS
ENTREGADA POR LA PROFESORA.

REACCIÓN DE LA NINHIDRINA

Tome 1 ml de la solución de cada una de las proteínas en un tubo de ensayo diferente (las preparadas por usted y una
de las que se encuentran en la mesa de reactivos) y 1 ml de glicina, metionina y prolina en tubos diferentes, agregue 1
ml de ninhidrina a cada tubo (proteínas y aminoácidos) y caliente a ebullición en baño maría durante 10 minutos. La
solución debe adquirir un color violeta azul o amarillo en el caso de la prolina. Discuta sus resultados y consulte la
reacción.
REACCIÓN DEL BIURET
Tome en diferentes tubos 1 ml de la solución de cada proteína y en otro tubo 1 ml de glicina se les añade 2 ml de
hidróxido de sodio al 30%, se mezcla cuidadosamente y se agregan tres gotas de sulfato cúprico al 1%. Se mezcla de
nuevo. La aparición de una coloración rojiza violeta indica la presencia de enlaces peptídicos. Analice sus resultados y
consulte la reacción.

REACCIÓN XANTOPROTEÍCA

Se toma en diferentes tubos 1 ml de la solución de cada proteína y en otros tubos 1 ml de la solución de los aminoácidos
(glicina, fenilalanina, tirosina, triptófano) agregue luego 1 ml de ácido nítrico concentrado a cada uno. En el caso de las
proteínas se observa la aparición de un precipitado blanco que corresponde a la proteína desnaturalizada. Caliente en
baño maría durante 5 minutos. La solución o el precipitado se tiñen de amarillo.

En caso de duda se deja enfriar el tubo de ensayo y se añaden 2 ml de hidróxido de sodio al 30%. El color amarillo vira
a naranja fuerte. Analice sus resultados y consulte la reacción.

REACCIÓN DE MILLON
Tome en diferentes tubos de ensayo 1 ml de la solución de cada proteína y 1 ml de las soluciones de aminoácidos
(glicina, tirosina y triptófano) adicione 0.5 ml del reactivo de Millón y agite, realice un calentamiento suave a temperatura
moderada por 5 minutos. Deje enfriar y posteriormente agregue 0,5 ml de nitrito sódico. En los tubos que contienen
proteínas se forma un precipitado blanco. Caliente los tubos en baño maría durante 5 minutos. La tirosina y las proteínas
que la contienen adquieren un color rojo. Analice sus resultados y consulte la reacción.

RECONOCIMIENTO DE ARGININA
A 1 ml de la muestra (proteínas, arginina y glicina) añada 0.1 ml de hidróxido de sodio al 30% y 0.3 ml de α-naftol al
0.05%. Se agita y se deja 5 minutos en un baño de hielo.
A continuación se añaden 2 gotas de hipobromito sódico 1N. La reacción es positiva indicando la presencia de arginina
u otra guanidina, al aparecer una coloración roja viva que se desvanece con relativa rapidez. La adición de 0.3 ml de
urea al 40% estabiliza el color.

RECONOCIMIENTO DE TRIPTÓFANO.
a) Reacción de Hopkins-Cole
A 1 ml de solución de aminoácidos (glicina, triptófano, metionina, glicina) y a 1 ml de proteína, adicione 1 ml de reactivo
de Hopkins-Cole. Agite y luego agregue cuidadosamente por las paredes del tubo inclinado, 1,5 ml de ácido sulfúrico
concentrado. La aparición de un anillo violeta en la interfase de los líquidos es señal de la presencia de triptófano.

B) REACCIÓN DEL ÁCIDO GLIOXÍLICO:

Se toma en diferentes tubos de ensayo 1 ml de los aminoácidos arginina, glicina, metionina y triptófano, y en otro tubo
1 ml de proteína. Adicione a cada tubo 1 ml de ácido acético glacial; luego deje caer lentamente por las paredes del
tubo 1 ml de ácido sulfúrico concentrado hasta que se formen dos fases. Observe el cambio de color en la interfase. Si
en ella se forma un anillo violeta, la reacción es positiva e indica la presencia del aminoácido triptófano.

RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS

Rotule 8 tubos de ensayo como: , metionina, cisterna, cisteína, arginina, albúmina de huevo, gelatina, leche de soya,
caseína. En cada uno agregue 2 mL. de la solución correspondiente, 2 mL. de NaOH 10%. Caliente hasta ebullición por
10 minutos, enfrié y agregue 1,0 mL. de acetato de Plomo al 10%. Caliente en baño de agua a ebullición por 5 min. La
formación de un precipitado gris oscuro o negro es prueba positiva para aminoácidos azufrados.

RESULTADOS:
Prueba:
Ninhidrina biuret xantoproteíca Millón arginina triptófano
AA y Prot.
Clara de huevo
Leche de soya
Caseína
Gelatina
Glicina
Prolina
Fenilalanina
 Tirosina
Triptófano
Arginina
Metionina
Cisteína
Cistina

En cada casilla escriba el signo + para la prueba positiva y el signo – para la prueba negativa. Además escriba el color
que presenta cada prueba y cuando realice el informe, coloree cada casilla con los colores observados
Compare sus resultados con los reportados en la literatura, determine las posibles causas de error, determine que
aminoácidos conforman las proteínas estudiadas en el laboratorio.
¿Qué grupos de alimentos son más ricos en proteínas?. ¿Pierden valor nutricional una proteína cuando se expone a
calor excesivo?
¿Son las proteinas estudiadas en el laboratorio de alto valor nutricional y porqué?