REACCIONES DE CARACTERIZACION DE AMINOÁCIDOS Y

PROTEINAS

OBJETIVOS:

• Efectuar algunas reacciones para comprobar la presencia de proteínas.

• Comprobar la presencia de algunos aminoácidos en forma libre o haciendo parte de las
proteínas con base en las reacciones características de los grupos funcionales de esos
aminoácidos.

FUNDAMENTOS:

Para escudriñar si en una determinada muestra biológica hay proteínas pueden utilizarse
numerosas reacciones, unas relacionadas con la presencia en la cadena polipeptídica de
determinados aminoácidos generalmente triptófano y tirosina o bien basarse en la misma
estructura polipeptídica, como es el caso de la reacción del Biuret, propia de las series de al
menos 2 enlaces peptídicos contiguos y que, por tanto, permite valorar casi todos los tripéptidos y
todos los péptidos del orden superior incluidas las proteínas.

Reacción de la ninhidrina:

La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con el grupo amino de aminoácidos libres

y con los grupos amino de la molécula proteínica para dar un compuesto azul violeta.
Los aminoácidos prolina e hidroxiprolina también reaccionan con la ninhidrina pero en este caso
se obtiene un color amarillo en lugar del violeta. La reacción es muy sensible por lo cual se
utiliza en cromatografía y en la detección de aminoácidos y proteínas en muestras biológicas.

Reacción del Biuret:

Cuando una disolución alcalina de sustancias que contienen enlaces peptídicos tales como el
Biuret, la oxamida, los polipéptidos y las proteínas, se añade sulfato cúprico, se forman sales
complejas de color violeta.

El nombre de “reacción del biuret” proviene de un derivado de la urea, el biuret, que, en

condiciones apropiadas, da esta reacción. El biuret se forma en el curso del calentamiento de la
urea, con desprendimiento de amoniaco:

El biuret contiene en su molécula dos enlaces amida sucesivos, de modo análogo a las proteínas,
donde se presentan numerosos enlaces peptídicos sucesivos. Este biuret en medio alcalino forma
unos complejos de coordinación con el cobre, de color azul morado característico. La reacción es
cuantitativa y permite valorar la presencia de proteínas con bastante exactitud e
independientemente del tipo de proteína.

H2N -C- NH2 + H2N -C- NH2 H2N-C– NH -C- NH2 + NH3
‫׀׀‬ ‫׀׀‬ ‫׀׀‬ ‫׀׀‬
O O O O
Urea Urea biuret amoniaco

Reacción xantoproteíca

La reacción xantoproteíca (del griego xanthos, amarillo) permite descubrir en la molécula de

proteína la presencia de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano).
Estos aminoácidos, al nitrarse, producen un compuesto de color amarillo, característico de los
nitrobencenos. No todas las proteínas dan positiva esta reacción ya que en unas pocas la
presencia de tirosina, triptófano y fenilalanina es extremadamente baja o nula. Este es el caso de
la gelatina derivada del colágeno.

Reacción de Millon

Esta reacción se debe a la presencia, en la molécula de proteína, de la tirosina, que tiene en su

composición un grupo fenólico. Este, por calentamiento con el reactivo de Millon (una mezcla
de nitrato y nitrito mercúrico disueltos en ácido nítrico concentrado), produce una coloración roja
que se debe a la formación de nitrotirosina que, por adición de mercurio en el curso del
calentamiento, se transforma en una sal mercúrica de color rojo.

Reconocimiento de arginina

La arginina, en presencia de α-naftol, se oxida con hipobromito, perdiendo un grupo imino.

La arginina oxidada, al combinarse con otra molécula de α-naftol, forma una sustancia de color
rojo que permite reconocerla.

Reconocimiento de triptófano.

El triptófano en presencia de iones de magnesio y de ácido oxálico (reactivo de Hopkins-Cole) y

con la presencia de un ácido mineral, como el ácido sulfúrico, produce coloraciones violeta en la
interfase que se forma, debido a la formación de complejos con el grupo indol del triptófano.

Determinación de la presencia de aminoácidos azufrados en las proteínas

La determinación de la presencia de aminoácidos sulfurados se realiza mediante una hidrólisis

(puede ser incompleta) de la proteína en un medio fuertemente alcalino, que conlleva a la
destrucción de los aminoácidos sulfurados liberando el azufre que contienen en forma de sulfuro,
ion que se puede poner de manifiesto con la adición de una sal soluble de plomo, con el que

NH3+ NH3+

HS – CH2 – CH – COO- + 2 NaOH HO – CH2 – CH – COO- + Na2S + H2O

Cisteina

Na2S + (H3C – COO)2Pb 2 H3C – COONa + PbS

negro

precipita el sulfuro de plomo, de color negro fácilmente reconocible:

MATERIALES Y REACTIVOS:

Baño maría sulfato cúprico 1%

Hielo ácido nítrico concentrado
caseína 0.5% reactivo de Millon
gelatina 0.5% reactivo de Hopkins-Cole. 10 g de Mg en
glicina 0.1% polvo diluirlos en agua, se agrega 250 ml de
prolina 0.1% ácido oxálico fresco. Se agita y se filtra. Se
metionina 0.1% acidifica el filtrado con ácido acético y diluir
fenilalanina 0.1% hasta 1 litro con agua.
tirosina 0.1% ácido acético glacial.
triptófano 0.1% α-naftol 0.05% en etanol-agua (1: 1)
arginina 0.1% en ácido sulfúrico 0.1N hipobromito sódico 1N
cisteina 0.1% en ácido clorhídrico 0.1N acetato de plomo 10%
cistina 0.1% en ácido clorhídrico 0.1N nitrito de sodio. 5%
ninhidrina al 0.1% en acetona ml de urea 40%
NaOH 30% 24 tubos de ensayo a cada grupo.
Pipetas de 5 ml.

PROCEDIMIENTO:

Realice las diferentes pruebas con la solución de proteína obtenida en la practica de “aislamiento
de proteínas” con la solución de proteína de los que se encuentran en la mesa de reactivos y con
los aminoácidos que se mencionan en cada caso.

Reacción de la ninhidrina

En diferentes tubos de ensayo tome 1 ml de la solución de cada una de las proteínas (la obtenida
por usted y una de las que se encuentran en la mesa de reactivos) y en otros 1 ml de la muestra
problema, glicina, metionina y prolina, agregue 1 ml de ninhidrina a cada tubo y caliente a
ebullición en baño maría durante 10 minutos. La solución debe adquirir un color violeta azul o
amarillo, en el caso de la prolina.
Detección de aminoácidos azufrados:

En diferentes tubos de ensayo tome 1 ml de la solución de cada una de las proteínas (la obtenida
por usted y una de las que se encuentran en la mesa de reactivos) y en otros 1 mL de la muestra
problema, glicina, metionina, cisteina y cistina y se añade a cada uno 1 ml de hidróxido de sodio
al 30%, se calienta en baño maría durante 10 minutos. Se enfrían los tubos en un baño de agua
fría, se añaden 2,5 ml de acetato de plomo al 5%, se agita bien, se calienta suavemente y se
observa el oscurecimiento progresivo de la solución.

Reacción del biuret

En diferentes tubos de ensayo tome 1 ml de la solución de cada una de las proteínas (la obtenida
por usted y una de las que se encuentran en la mesa de reactivos) y en otros 1 mL de la muestra
problema y glicina, se les añade 2 ml de hidróxido de sodio al 30%, se mezcla cuidadosamente y
se agregan tres gotas de sulfato cúprico al 1%. Se mezcla de nuevo. La aparición de una
coloración rojiza violeta indica la presencia de enlaces peptídicos.

Reacción xantoproteíca

En varios tubos de ensayo se toma 1 ml de la solución de proteína separada por usted y una
proteéna de la mesa y en otros tubos 1 ml de la muestra problema y 1 mL de la solución de los
aminoácidos (glicina, fenilalanina, tirosina, triptófano) agregue luego 1 ml de ácido nítrico
concentrado. En el caso de las proteínas se observa la aparición de un precipitado blanco que
corresponde a la proteína desnaturalizada. Caliente en baño maría durante 5 minutos. La
solución o el precipitado se tiñen de amarillo.
En caso de duda se deja enfriar el tubo de ensayo y se añaden 2 ml de hidróxido de sodio al 30%.
El color amarillo vira a naranja fuerte.

Reacción de Millon

Tome 6 tubos de ensayo en adicione en cada uno 1 ml de la solución de proteína problema, de la

proteína de la mesa, de la muestra problema, y de los aminoácidos glicina, tirosina y triptófano.
Adicione 0.5 ml del reactivo de Millon y agite. Posteriormente agregue 0,5 ml de nitrito sódico y
agite. En los tubos que contienen proteínas se forma un precipitado blanco. Caliente los tubos en
baño maría durante 5 minutos. La tirosina y las proteínas que la contienen adquieren un color
rojo.

Reconocimiento de arginina

Tome 6 tubos de ensayo y adicione a cada uno 1 ml de proteína problema, proteína de la mesa, de
la muestra problema y de los aminoácidos arginina, glicina y prolina. Añada 0.1 ml de hidróxido
de sodio al 30% y 0.3 ml de α-naftol al 0.05%. Se agita y se deja 5 minutos en un baño de hielo.
A continuación se añaden 1 ml de hipobromito sódico 1N. La reacción es positiva indicando la
presencia de arginina u otra guanidina, al aparecer una coloración roja viva que se desvanece con
relativa rapidez. La adición de 0.3 ml de urea al 40% estabiliza el color.
Reconocimiento de triptófano.

a)Reacción de Hopkins-Cole
Tome 6 tubos de ensayo y adicione 1 ml de solución de aminoácidos glicina, triptófano,
metionina, de proteína problema, proteína de a mesa y muestra problema y adicione 1 ml de
reactivo de Hopkins-Cole a cada uno. Agite y luego agregue cuidadosamente por las paredes del
tubo inclinado, 1,5 ml de ácido sulfúrico concentrado. La aparición de un anillo violeta en la
interfase de los líquidos es señal de la presencia de triptófano.

b)Reacción del ácido glioxílico:

Se toma en diferentes tubos de ensayo 1 ml de los aminoácidos arginina, metionina y triptófano,
y en otro tubo 1 ml de protena problema, proteína de la mesa y muestra problema. Adicione a
cada tubo 1 ml de ácido acético glacial; luego deje caer lentamente por las paredes del tubo 1 ml
de ácido sulfúrico concentrado hasta que se formen dos fases. Observe el cambio de color en la
interfase. Si en ella se forma un anillo violeta, la reacción es positiva e indica la presencia del
aminoácido triptófano.

RESULTADOS:
Prueba: ninhidrina biuret xantoproteíca Millon arginina triptófano azufrados

Aminoácidos
Y proteínas

proteína 1*
proteína 2*
Glicina
Prolina
Fenilalanina
Tirosina
triptófano
Arginina
Metionina
Cisteina
Cistina