FACULTAD DE MEDICINA - DEPARTAMENTO DE CS.

BÁSICAS
MEDICINA 2015

GUÍA ACTIVIDAD PRÁCTICA 3:

PROPIEDADES DE LOS AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

OBJETIVOS OPERACIONALES
 Identificar aminoácidos por la reacción de la ninhidrina y su diferenciación con las
proteínas.
 Reconocimiento de proteínas por reaccione de precipitación por desnaturalización térmica
y por ácido tricloroacético (TCA).
 Determinación del punto isoeléctrico (pI) de la caseína.

Fundamento Teórico:

Los aminoácidos son las unidades constituyentes de las proteínas, las cuales son de gran interés en
las organizaciones estructurales y funcionales de células y tejidos. Éstos son 20 y, desde el punto
de vista químico, son ácidos carboxílicos (R-COOH), portadores de un grupo amino (-NH2) y un
radical variable R, el cual es responsable de su actividad biológica y química.

Según la naturaleza del grupo R, los aminoácidos pueden ser clasificados en cuatro grandes
grupos: apolares, polares sin carga, aniónicos y catiónicos. La reactividad de estos grupos
funcionales ha sido aprovechada de diversas maneras en el estudio y análisis de las proteínas.

1. Identificación de aminoácidos por la reacción de la ninhidrina y su diferenciación con las

proteínas.

Introducción.

Los aminoácidos reaccionan con ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) formando un

compuesto azul violáceo, excepto para la prolina e hidroxiprolina que es amarillo.

En la formación de este compuesto coloreado, la ninhidrina produce una desaminación oxidativa

del aminoácido, liberando NH3, CO2, un aldehído con un carbono menos que el aminoácido
original y ninhidrina reducida (hidrantina). El NH3 formado reacciona con otra molécula de
ninhidrina y con la ninhidrina reducida formando un compuesto azul violáceo.

Esta reacción ha sido utilizada para la determinación cuantitativa de los aminoácidos, ya que el
compuesto coloreado absorbe luz aproximadamente a 570 nm, y en valores de pH comprendidos
entre 4 y 8.
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La reacción de las proteínas con ninhidrina es muy débil debido a la baja concentración de grupos
amino libres, por lo cual en términos prácticos se considera negativa.

Parte Experimental.

Materiales: Reactivos:

1. Gradilla con tubos de ensayo 1. Solución alcohólica de ninhidrina al

2. Plumones 0,1%.
3. Micropipeta p1000 2. Solución neutra de aminoácidos 0,1 M.
4. Puntas para p1000 3. Solución neutra de caseína: 0,5 g de
5. Vórtex. caseína en 100 mL de tampón fosfato
6. Baño María hirviente. 0,1 M a pH = 7,0.

ESQUEMA DE TRABAJO

Componentes 1 2 3 (Blanco)
Solución neutra de aminoácidos [mL] 2,5 - -
Solución neutra de caseína [mL] 2,5 -
Agua destilada [mL] - - 2,5
Solución alcohólica de ninhidrina [mL] 0,5 0,5 0,5
Resultados

Mezcle por agitación en vórtex. Caliente todos los tubos en Baño María hirviente por 2 minutos y
deje enfriar.

Resultados: Indique con cruces los resultados obtenidos en cada tubo, considerando (-) si no hay
reacción, (+), (++), o (+++), según la intensidad de la coloración.
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2. Reconocimiento de proteínas por reacciones de precipitación por desnaturalización por calor

por ácido tricloroacético.

Introducción.

Las propiedades biológicas de las proteínas, así como muchas de sus propiedades físico-químicas,
dependen depende dela integridad de sus estructuras. Cuando estas estructuras se alteran,
aunque no haya ruptura de los enlaces peptídicos (estructura primaria), la proteína pierde sus
propiedades funcionales, y altera sus propiedades físico – químicas; este fenómeno se denomina
desnaturalización.

Los agentes desnaturalizantes, como los ácidos fuertes (tricloroacético, por ejemplo), bases
fuertes (por ejemplo, NaOH), el calor sobre 50 ⁰C, entre otros, actúan esencialmente destruyendo
los enlaces hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, y las uniones disulfuro, alterando por lo tanto, la
estructura secundaria y terciaria de las proteínas.

La proteína desnaturalizada presenta una solubilidad disminuida y habitualmente precipita.

Parte Experimental.

Materiales: Reactivos:

1. Gradilla con tubos de ensayo 1. Muestra proteica.

2. Plumones 2. Ácido tricloroacético al 10% (m/v).
3. Micropipeta p1000
4. Puntas para p1000
5. Vórtex
6. Baño María hirviente
ESQUEMA DE TRABAJO

2 4
Componentes 1 3
(Blanco 1) (Blanco 2)
Muestra proteica [mL] 0,5 - 0,5 -
Agua destilada [mL] - 0,5 - 0,5
Ácido tricloroacético al 10% m/v [mL] - - 0,5 0,5
Resultados

Mezcle por agitación en vórtex. Caliente todos los tubos en Baño María hirviente durante 2-3
minutos.

Resultados: Indique la ausencia (-) o presencia de opalescencia (+) o precipitado (++) en los tubos
que corresponda.
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3. Determinación del punto isoeléctrico (pI) de la caseína.

Introducción.

La insolubilidad de la caseína (una fosfoproteína) en su punto isoeléctrico puede ser utilizada

como un método conveniente para determinar este punto.

Si a una serie de tubos que contienen iguales volúmenes de una solución de caseína disuelta en
una solución de acetato de sodio, se le agrega cantidades variables de ácido acético, se obtienen
tubos con diferentes pHs.

Si se conoce el pK del ácido acético (4,7), el pH resultante en cada tubo puede ser calculado por
medio de la ecuación de Henderson – Hasselbach:

[sal]
pH = pK + log
[ácido]

Después de la experiencia, el pH del tubo que contenga un máximo de precipitación es tomado

como punto isoeléctrico.

Parte Experimental.

Materiales: Reactivos:

1. Gradilla con tubos de ensayo 1. Caseína al 0,5% en acetato de sodio 0,1

2. Plumones mol/L.
3. Micropipeta p1000 2. Ácido acético al 1 mol/L.
4. Puntas para p1000
5. Vórtex
6. Baño María hirviente

Procedimiento:

1. Rotule una serie de tubos de ensayo del 1 al 9.

2. En el tubo 1, agregue 3,2 mL de ácido acético 1 mol/L y 6,8 mL de agua destilada.
3. Mezcle bien en el vórtex.
4. Añada 5 mL de agua destilada en cada uno de los 8 tubos restantes.
5. Saque 5 mL de la solución del tubo 1 y agréguelos al tubo 2. Mezcle bien en el vórtex.
6. Luego, saque 5 mL del tubo 2 y transfiéralos al tubo 3, mezcle en vórtex. Continúe del mismo
modo hasta completar la serie.
7. En el tubo 9, una vez efectuada la mezcla, saque 5 mL de solución y elimínelos.
8. Posteriormente, a cada tubo, agregue 1 mL de solución de caseína en acetato de sodio 0,1
mL. Mezcle bien.
9. Anote el efecto inmediato que se produce en los diferentes tubos y el que se observa después
de 15 minutos.
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ESQUEMA DE TRABAJO

Componentes 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH
Agua destilada [mL] 6,8 5 5 5 5 5 5 5 5
Ácido acético 1 mol/L [mL] 3,2 - - - - - - - -
Solución a agregar al
5 5 5 5 5 5 5 5 5
siguiente tubo [mL]

Agregue a cada tubo 1 mL de caseína en acetato 0,1 mol/L.

Resultados inmediatos
Resultados a los 15 min

Emplear los siguientes símbolos:

- : no cambia + : opalescencia ++ : precipitado

Resultados:

Conociendo las concentraciones del ácido acético y del acetato, calcule el pH de cada tubo.

Determine a qué pH hay mayor insolubilidad de la caseína (mayor cantidad de precipitado). Este
pH corresponderá al punto isoeléctrico (pI).
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4. Para conseguir preparaciones duraderas, los tejidos se someterán a la acción de sustancias

que detengan en forma rápida los procesos degenerativos de las células (autolisis) y que al
mismo tiempo conserven las estructuras que los elementos histológicos presentan “in vivo”.
Los reactivos que cumplen esa finalidad se denominan en Técnica Histológica: “Fijadores”.

Este laboratorio se iniciará con la observación y análisis del efecto de las soluciones “fijadoras
experimentales sobre la desnaturalización de proteínas” sobre proteínas en solución.

Objetivos:
 Se analizará concentración, temperatura, velocidad de difusión, etc.
 Se utilizarán algunos modelos experimentales consistentes en soluciones proteicas, de modo
de poder comparar el comportamiento de estas con diferentes soluciones químicas fijadoras y
así poder compararlos sus efectos con lo que ocurre en el tejido.

Actividad:
Disponga de 6 Placas Petri pequeñas, agregando a cada uno de ellos 20 ml de las siguientes
soluciones fijadoras:
 Formalina neutra al 10 %;
 Solución acuosa saturada de Acido Pícrico;
 Alcohol absoluto;
 Metanol puro
 Acetona pura
 Ácido acético al 5 %.

Agregue a cada uno de ellos 2 ml de clara de huevo crudo (evite agregar clara floculada o
densa). Observe lo acontecido con la mezcla proteica y la solución fijadora: Inmediatamente, a
los 5 minutos, a los 15 minutos; a los 30 minutos; a la hora. Registre, grafique y explique estos
resultados en el informe, de acuerdo con los efectos observados. Confeccione una tabla y
clasifique las soluciones experimentales de acuerdo con los cambios ejercidos en la solución
proteica (cambios en la coloración y consistencia), utilizando para ello un mondadientes de
madera. Realice dos gráficos: 1) tiempo transcurrido v/s intensidad de coloración y 2) tiempo
transcurrido v/s consistencia. Además, confeccione una tabla clasificando los fijadores como
coagulantes y no coagulantes de acuerdo a los acontecido.

Actividad:
A) Efecto de las diferentes soluciones experimentales en el volumen tisular:
A) A partir de una solución de gelatina al 10 %, confeccione 10 cubos de 2 cm de arista o bien
cilindros de longitud de diámetro uniforme a partir de moldes plásticos o de otro material.
Disponga los cubos de gelatina en recipientes que contengan un volumen de 50 cc de
sustancia química experimental.
B) Realice secciones de hígado fresco de 2 x 2 cm de arista (estos pueden provenir de material
de autopsia o bien, de cerdo, evitando aquel material que presente signos de autolisis).
Coloque los trozos de hígado en un recipiente de vidrio que contenga 50 ml de cada una de las
soluciones experimentales utilizadas anteriormente. Observe los resultados, midiendo con
una regla, la distancia entre cada arista y registre sus resultados a: 30 minutos y 1 horas,
respectivamente.
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C) Tanto para los cubos de gelatina, como para los trozos de hígado, disponga un cubo en 50
cc de agua corriente a modo de control.
Grafique los resultados obtenidos con la gelatina y los trozos de hígado al ser tratados con las
soluciones experimentales “A” y “B” de la actividad, respectivamente. Señales las
conclusiones que obtuvo de esta actividad práctica.

 Formalina neutra al 10 %;
 Solución acuosa saturada de Acido Pícrico;
 Alcohol absoluto;
 Metanol puro
 Acetona pura
 Ácido acético al 5 %.

- Corte trozos de hígado de 2cm de espesor y póngalos en un recipiente de vidrio que

contenga 50 ml de cada una de las soluciones experimentales. En el fondo del frasco coloque
una gasa para que toda la superficie del tejido quede en contacto con la solución
experimental.

- A diferentes intervalos de tiempo, realice secciones sucesivas no mayores a los 2 mm de

cada uno de los tejidos sometidos a la acción de las diferentes soluciones químicas (fijadoras).
Realice dichas secciones siempre por la misma cara de corte: a la hora, 2 horas, 3 horas y 24
horas. Observe el plano de corte y mida la distancia de penetración de la solución
experimental (desde el borde externo hacia el centro). Grafique los resultados de sus
observaciones para ambos casos.

Observe la penetración obtenida con la mezcla de la soluciones experimentales y compárelo

con la obtenida con ambas soluciones experimentales por separado. Señale las conclusiones
que obtuvo en esta actividad.