Curso: Microbiología Semestre: 2020 - I

PRACTICA_ SEMANA_01

1. NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

Las normas generales de seguridad y bioseguridad para laboratorios, están dirigidas a todas
aquellas personas cuya actividad tienen relación con el trabajo de laboratorio, en donde es
necesario observar medidas y precauciones para evitar accidentes, manejar correctamente los
incidentes, y para minimizar sus consecuencias.
 Conocer los agentes, sustancias y productos
peligrosos que existen en el laboratorio de
microbiología.
 Las puertas y ventana deberán permanecer
cerradas para mantener la adecuada contención
biológica.
 En las áreas de trabajo no debe colocarse
material de escritorio ni libros, dado que el papel
contaminado es de muy difícil esterilización.
 Todas las superficies de trabajo se limpiarán y desinfectarán diariamente, y siempre que se
produzca un derrame al interior del laboratorio.
 Todas las áreas estarán debidamente marcadas con la señal de riesgo biológico.
 El transporte de muestras se
realizará en recipientes herméticos o
neveras rotulados y deben ser de fácil
desinfección. Estas no serán
utilizadas para otros fines.
 Lavarse las manos
frecuentemente durante las
actividades rutinarias, tras acabar la
práctica y siempre antes de
abandonar el laboratorio.
 Está prohibido pipetear con la boca, este procedimiento se realizará con pipeta automática y
cada alumno será capacitado por el docente para el manejo apropiado.
 Para realizar procedimientos de alto riesgo biológico deberá usarse la cabina de bioseguridad
biológica.
 El mandil es de uso exclusivo dentro del
laboratorio, y su transporte debe ser teniendo las
condiciones de segura para evitar contagio o
diseminación de microorganismos.
 Los residuos y muestras peligrosas que van a
ser incinerados fuera del laboratorio deben ser
transportados en contenedores cerrados,
resistentes e impermeables. SEGUIR LEYENDO

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2. MANEJO DEL MICROSCOPIO

El microscopio es un instrumento que permite observar en un tamaño aumentado elementos
que son imperceptibles a simple vista. En el laboratorio se utiliza como herramienta para
describir las características generales de distintos organismos unicelulares y pluricelulares, así
como también su estructura, fisiología y otros. Es fundamental que el estudiante identifique las
partes ópticas y mecánicas, como conocimiento previo para las siguientes prácticas del curso.

Partes del microscopio óptico

En un microscopio óptico podemos distinguir entre el sistema óptico y el sistema mecánico
El sistema óptico incluye el conjunto de lentes y elementos de manipulación de la luz necesarios
para generar una imagen aumentada.
El sistema mecánico proporciona el soporte estructural a los anteriores elementos. La

Normas para el uso correcto del microscopio óptico

1. Quitar la funda protectora del microscopio.
2. Enchufar/encender el microscopio.
3. Colocar en primera instancia el objetivo de menor aumento para lograr un enfoque correcto.
Este paso en muy importante y se debe realizar siempre, ya que permitirá la observación de
una panorámica del preparado y la ubicación de áreas de interés para su análisis posterior.
4. Subir el condensador utilizando el tornillo correspondiente.
5. Colocar el preparado sobre la platina, con el cubre-objetos hacia arriba y sujetándola con las
pinzas/guías.
6. Enfoque el preparado mirando a través del ocular y lentamente mueva el tornillo
macrométrico.
7. Recorra todo el preparado y haga sus observaciones. Elija el sitio donde debe seguir
observando a mayor aumento.
8. Cambie al objetivo de mediano aumento (20 X) y para lograr el enfoque siga moviendo
lentamente el tormillo macrométrico. Al cambiar de objetivo, la imagen debe estar

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ligeramente enfocada gracias a que la mayoría de microscopios son parafocales; es decir, una
vez logrado el primer enfoque, al pasar al objetivo de aumento inmediato superior la imagen
queda en un foco aproximado y solo se debe realizar un ajuste.
9. Realice la observación y haga sus anotaciones. Seleccione la estructura que va a observar a
mayor aumento y colóquela en el centro del campo.
10. Cambie al objetivo de mayor aumento. Si realizó el enfoque de manera correcta con el
objetivo anterior, al colocar el objetivo de mayor aumento la imagen solo se debe enfocar
girando única y lentamente el tornillo micrométrico. NUNCA se debe utilizar el tornillo
macrométrico con los objetivos de mayor aumento, pues al estar éste muy cerca del
preparado, se corre el riesgo de partirlo (quebrar la lámina).
11. Al lograr el enfoque con el objetivo de mayor aumento debe realizar la observación
moviendo constantemente el tornillo micrométrico para variar los planos de enfoque. De
igual manera, abra o cierre el diafragma para regular la intensidad de la luz y mejorar el
contraste. Haga sus observaciones.
12. Una vez finalizada la observación, aleje la platina y coloque nuevamente el objetivo de
menor aumento.
13. Retire la muestra.
14. Limpie el lente objetivo si usó medio de inmersión, apague la/s lámpara/s.
15. Cubra el microscopio con la funda protectora.

Recomendaciones
NUNCA dañar, rayar, dejar caer las lentes u otros componentes ópticos.
NUNCA forzar los controles de foco.
NUNCA tocar las superficies ópticas. Durante la clase se discutirá cuál es el procedimiento para
limpiar los lentes objetivos correctamente. SEGUIR LEYENDO

3.OBSERVACION AL MICROSCOPIO OPTICO

Dentro de una gota de agua procedente de estanques, se puede observar la gran diversidad
existente en el mundo de los seres vivos microscópicos. VER EL SIGUIENTE VIDEO y LEER EL
DOCUMENTO ADJUNTO

4.CARACTERISTICAS MACROSCOPICAS DE LAS COLONIAS DE BACTERIAS

Colonias: Son agrupaciones macroscópicas, visibles a simple vista y corresponden al crecimiento

en un punto de una única línea celular hasta formar una colonia (todas las células que componen
la colonia provienen de una única célula). El cultivo se realiza en un medio de cultivo sólido para
formar colonias que serán distintas y características para cada tipo bacteriano; el medio sólido

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impide el posible movimiento de los individuos de la colonia y favorece su agrupamiento. Para

obtener colonias
bacterianas nunca se
emplea un medio de
cultivo líquido.

Estas colonias
presentan una
morfología
macroscópica
fácilmente reconocible
y variable en función
de:
 Las características del medio de cultivo sólido donde se ha desarrollado la bacteria constituyen
un criterio de gran importancia a la hora de hacer una valoración taxonómica de la misma.
 El tipo de bacteria problema: Las bacterias de mayor movilidad presentan mayor tendencia a
dar colonias extendidas y planas frente a las que no presentan esta característica

Es importante considerar que un mismo tipo de bacteria puede dar lugar a distintos tipos de
colonias dependiendo del medio de cultivo sólido empleado, e igualmente, distintos tipos
bacterianos pueden crecer formando colonias similares.
De cualquier forma, la verificación de las diferentes formas, tamaños y aspectos de las colonias
va a servir como un dato más en la tipificación de la bacteria problema.
Lo ideal es que las colonias se encuentren más separadas que juntas y que en el proceso de la
siembra no haya habido contaminación. Y verificación de que el medio de cultivo no está
contaminado
El tamaño, forma y aspecto de las colonias suele ser bastante constante para cada género y
especie bacteriana, hecho que se puede utilizar como característica diferencial. Para ello
debemos considerar los siguientes aspectos de las colonias: tamaño, forma, superficie,
consistencia, transparencia y coloración y presencia o no de halos de transparencia.

Tamaño de las colonias.

Tamaño pequeño: colonias puntiformes con aproximadamente 0,5 mm de diámetro o inferiores.
Tamaño mediano: de 1 a 2 mm de diámetro.
Tamaño grande: de 4 a 6 mm de diámetro.
Tamaño muy grande: colonias extendidas en forma de velo invadiendo toda la superficie del
medio de cultivo.

Forma de la colonia.
Incluye la forma, elevación y borde de la colonia. Según la forma se dividen en puntiforme,
circular, rizoide, filamentosa, irregular y fusiforme.

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Según la elevación: plana, convexa

(semiconvexa), cóncava (semicóncava),
umbiculada, acuminada, planoconvexa,
papilada, en meseta, semiesférica,
umbeliforme, elevada, etc
Según los bordes: entero, lobulado, rizoide,
filamentoso, ondulado, aserrado, espiculado,
redondeado, etc.

Superficie de la colonia.
Corresponde al aspecto de la colonia, y pueden ser lisas, rugosas, planas, acuminadas,
umbilicadas, mucosas, secas, etc. Es muy importante la diferenciación entre colonias lisas y
rugosas, donde las segundas suelen presentar cápsulas u otros componentes superficiales que
proporcionan un aspecto más compacto o rugoso, relacionando este tipo de bacterias con una
mayor virulencia, la cual se pierde cuando la bacteria sufre un cambio de rugosa a lisa (no
obstante, existen bastantes excepciones en este hecho).
Consistencia de la colonia.
Las colonias pueden ser duras, viscosas, mucosas, secas, muy secas, cremosas, etc. En general, al
mayor parte de las bacterias forman colonias de consistencia más o menos cremosa, aunque
existen muchas excepciones y también, con poca frecuencia, pueden tener consistencia mucosa
como la de la mayor parte de las levaduras.

Transparencia y coloración.
En general es frecuente algún tipo de color en las colonias; esto puede ser debido a la elaboración
de algún tipo de pigmento, a la formación de alguna sustancia por parte de la bacteria o por la
utilización de algún sustrato del medio que acidifique o alcalinice a éste de forma que, ante la
presencia de indicadores de pH que están en el medio, cambia de color, hecho que nos ayuda a
conocer la utilización de ese sustrato por parte de la bacteria (tipificación bioquímica). La
transparencia puede ser completa, en cuyo caso, se habla de colonias translúcidas,
semitransparentes o completamente opacas, dependiendo del tipo bacteriano o del medio de
cultivo utilizado.

Presencia o ausencia de halos de transparencia

Es muy frecuente la presencia de distintos sustratos en el medio de cultivo que influyen de forma
decisiva en el aspecto de la colonia, uno de ellos es la presencia o no de halos de transparencia
en torno a la colonia. VER DOCUMENTO

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Crecimiento bacteriano en medios de cultivo

Agar nutritivo Agar Lowenstein – Jensen

Agar Sangre

Agar MacConkey

5. CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS DE LAS BACTERIAS

Cuando se requiere conocer los detalles morfológicos de las bacterias es necesario recurrir a
técnicas de coloración. Los colorantes empleados pueden ser naturales o sintéticos. Las
coloraciones pueden ser directas (contacto de la suspensión bacteriana con el colorante) o
indirecto (utilización de mordiente).

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Preparación del frotis

Consiste en suspender una porción de material bacteriano en solución salina isotónica. Las
láminas portaobjetos deben estar libres de grasa, pelusa, pegamento, rotulados anteriores, etc.
Para ello deben limpiarse perfectamente con alcohol y dejar secar. Como el material bacteriano
suele presentar cierta transparencia, es difícil visualizarlo una vez fijado, por lo que se aconseja
marcar del revés la zona a utilizar. Luego se coloca una pequeña porción de solución salina (media
gota) sobre el portaobjeto y con la ayuda del asa se emulsiona suavemente el material bacteriano
sólido. Luego se deja secar espontáneamente. La fijación del frotis fija la estructura citológica al
portaobjeto evitando que el material sea arrastrado durante la tinción y mata a las bacterias
consiguiendo además que sus paredes sean más permeables a los colorantes. Esta fijación se
realiza por calor pasando el revés del frotis del portaobjeto durante un segundo 2 o 3 veces por
la llama del mechero de Bunsen. Debe evitarse el sobrecalentamiento porque ocasiona
deformaciones.

Coloración simple
Se utiliza un solo colorante (básicos: Azul de metileno, Safranina, Cristal violeta)

Técnica operatoria
1. Hacer frotis
2. Agregar colorante por un minuto
3. Enjuagar con agua
4. Secar y observar

Coloración de Gram
Este método fue descripto por primera vez en 1884 por el danés Christian Gram. Actualmente es
aplicado universalmente como paso inicial de fundamental importancia en la sistemática
bacteriana. Brinda un carácter taxonómico que permite distinguir empíricamente entre bacterias
grampositivas y gramnegativas. La diferente estructura química de la pared celular es la
responsable de esta propiedad. Las bacterias grampositivas forman un compuesto estable con el
violeta de genciana mordenteado por lugol y resisten la decoloración con la mezcla alcohol-
acetona. Así, las bacterias grampositivas aparecen teñidas de violeta y las gramnegativas se tiñen
de rosado. Esta coloración también permite distinguir entre los distintos tipos de células o
agrupaciones bacterianas: cocos, bacilos, estreptococos, diplococos, etc.

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Se utilizan los siguientes reactivos:

 Solución Cristal Violeta: disolver 2 g. de cristal violeta en 100 ml de alcohol metílico.
 Solución de Lugol: disolver 1 g. de cristal de yodo y 2 g. de yoduro de potasio en agua csp
300 ml. Solución decolorante: mezclar 50 ml de acetona con 50 ml de alcohol etílico 95º.
 Solución de contraste: disolver 1 g. de safranina en 100 ml de agua destilada.
Técnica operatoria
1- Colocar los portaobjetos con el extendido bacteriano sobre un soporte de tinción.
2- Cubrir con la solución de cristal violeta o violeta de genciana y dejar actuar 30 segundos.
3- Lavar con agua y sacudir el exceso.
4- Cubrir con lugol (actúa como mordiente) y dejar en contacto un minuto.
5- Lavar y sacudir el exceso.
6- Cubrir el portaobjeto con la solución decolorante y dejar actuar durante 10 o 20 segundos. 7-
Lavar con agua y sacudir el exceso.
8- Cubrir la solución de contraste y dejar en contacto durante 30 segundos.
9- Lavar con agua y sacudir el exceso.
10- Dejar secar al aire
11- Observar al microscopio con objetivo de inmersión (gota de aceite).

Teóricamente una explicación de la coloración por el método de Gram, es la afinidad tintorial de

la pared celular, en razón a la naturaleza y composición química. En ambos tipos de bacterias se
forma inicialmente un complejo con la coloración primaria (complejo violeta de genciana-lugol).
Este complejo es retenido por las bacterias grampositivas resistiendo la decoloración. Las
gramnegativas, sin embargo, son más permeables al alcohol por su alto contenido lipídico y esto
permite que el complejo coloreado sea arrastrado. Así las grampositivas conservan el color inicial

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del complejo y se observan de color violeta, mientras que las gramnegativas se decoloran y
aceptan el colorante de contraste observándose de color rosado.

Endosporas
Las endosporas son un tipo de células en reposo. Esta capacidad la tienen muchas bacterias Gram
positiva. Generalmente las bacterias formadoras de endosporas tienen forma bacilar (Bacillus,
Clostridium y Desulfatomaculum), con una excepción, con forma cocácea (Sporosarcina). Se
producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes,
temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada
forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la
espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva
forma vegetativa. La capacidad de germinar perdura durante años. Algunas de las bacterias
productoras de endosporas son patógenas para el hombre, por lo que su estudio y observación
son de enorme interés. Son fáciles de reconocer al microscopio por ocupar un lugar intracelular
durante su formación.

Tinción de esporas (WIRTZ-CONKLIN)

Fundamento: Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los
factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el
microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción.

La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.
2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.
Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo
harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

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Cápsula. Tinción negativa

Esta es una preparación de bacterias incoloras sobre un fondo coloreado. Ocurre porque los
colorantes ácidos, no son atraídos por la mayoría de las bacterias por que los iones negativos del
colorante son repelidos por la superficie bacteriana cargada nativamente, de modo que el
colorante es repelido por la bacteria y colorea en cambio el fondo de la preparación y así resultan
los microorganismos muy visibles por al contraste con el fondo oscuro.

Técnica operatoria
Colocar una gota de Maneval A (rojo congo) separadamente en una lámina.
Tomar una asada de Klebsiella pneumoniae y mezclarlo en la gota de Maneval A, haciendo
movimientos giratorios con el asa. Extender la suspensión de manera que quede una película
delgada.
Secar a temperatura ambiente. NO FIJAR EL FROTIS AL
CALOR.
Cubrir la preparación con Maneval B (fucsina ácida) y dejar
que actúe durante un minuto.
Lavar suavemente con agua corriente y secar el frotis
mediante un ligero contacto con una toalla de papel.
Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
Se observa de un fondo oscuro, las cápsulas se observan
como halos incoloros. y las células bacterianas de color
rojo.

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