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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD

Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente

INFORME FINAL PRÁCTICA DE LABORATORIO – MÉTODOS DE SIEMBRA Y TINCIÓN DE


MICROORGANISMOS

DIANA PATRICIA FONSECA MARTINEZ


CÓD: 1.098.220.848

JAIRO ALBERTO VILLAMIZAR GELVEZ


CÓDIGO: 1.090.436.515

YENI PAOLA BARAJAS SUAREZ


CÓDIGO: 1.098.724.065

TUTORA PRÁCTICA:
MARIA FERNANDA DOMINGUEZ
BIOLOGIA AMBIENTAL
GRUPO: 358006_64

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA


ESCUELA DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE
PROGRAMA DE INGENIERÍA AMBIENTAL
CEAD BUCARAMANGA
NOVIEMBRE DE 2016
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INTRODUCCIÓN

La microbiología es la ciencia que estudia los microorganismos, se encarga de conocer su


fisiología, comportamiento y daños o impactos que pueden ocasionar en el medio ambiente y en
la salud de las personas, además de la utilización de muchos de ellos para procesos productivos
e indicadores de contaminación. Las prácticas de laboratorio permiten que el estudiante se
familiarice gradualmente con los procedimientos realizados para el manejo adecuado de los
microorganismos, como la preparación de los sustratos o medios de cultivo, la observación de
bacterias y hongos. Durante el desarrollo de las prácticas de laboratorio se deben tener ciertas
conductas adecuadas que permitan el desarrollo correcto de cada sección práctica, por lo cual
se debe implementar normas de bioseguridad, que se encargan de prestarle al estudiante la
seguridad e higiene adecuada, que garantiza la protección contra infecciones, así como
garantizar la calidad de las técnicas y confiabilidad de los resultados.

En el laboratorio el estudiante debe cumplir con normas básicas e utensilios que le permiten
desarrollar adecuadamente cada práctica de laboratorio, entre algunas recomendaciones que
debe seguir el estudiante están:

 Se debe utilizar siempre la bata de laboratorio para el ingreso al laboratorio.


 Se debe utilizar calcado cerrado, que no permita el contacto de alguna sustancia con la
piel.
 Utilizar siempre guantes de protección (de látex o nitrilo), para evitar el contacto con los
microorganismos que se utilicen.
 Mantener el orden y aseo de la zona de trabajo.
 Se prohíbe ingerir o almacenar cualquier tipo de alimento dentro del laboratorio.
 Se prohíbe fumar o el consumo de sustancias peligrosas en el laboratorio.
 Mantener el cuidado y protección de los equipos y materiales utilizados para el desarrollo
de cada práctica de laboratorio.

Pata observar los microorganismos se necesita de un instrumento llamado microscopio


compuesto, es un instrumento óptico que tiene un doble aumento. El primer aumento lo realiza
el objetivo, el cual produce una imagen real y define la resolución del sistema. El segundo
aumento lo efectúa el ocular, que produce una imagen virtual aumentada de la imagen real
formada por el objetivo. La imagen observada es aumentada e invertida (Universidad Central de
Venezuela, s/f). Este tipo de microscopios están conformados por dos sistemas, uno óptico y
uno mecánico.

Los microorganismos necesitan de un sustrato para crecer o medio de cultivo en el cual se


desarrollan y pueden formar colonias. Para observar los microorganismos como bacterias o
hongos en el microscopio se necesita de una tinción que le permita ser observado fácilmente
para las bacterias se utiliza la tinción de Gram, en la cual se identificas bacterias Gram positivas
(coloración violeta) y Gram negativas (coloración fucsia). Los hongos son teñidos con azul de
lacto fenol que le permite dejar expuestas sus partes para el análisis al microscopio.
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OBJETIVO GENERAL

 Conocer los métodos de siembra y tinción de los microorganismos (bacterias y hongos),


para su estudio y observación en el microscopio óptico compuesto.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Conocer las normas de bioseguridad en el laboratorio

 Identificar los materiales y reactivos utilizados en los laboratorios de microbiología.

 Identificar los diferentes métodos de siembra de bacterias y hongos.

 Conocer los sustratos o medios de cultivos utilizados para la siembra de bacterias y


hongos.

 Comprobar el crecimiento de los diferentes microorganismos en el agar nutritivo, y


diferenciar el adecuado almacenamiento para hongos y bacterias.

 Conocer las técnicas de tinción para bacterias y para hongos.

 Conocer los diferentes colorantes utilizados en las técnicas de tinción de


microorganismos y determinar la función de los mismos.

 Realizar el frotis o fijación de los microorganismos para su posterior estudio en el


microscopio óptico compuesto.

 Identificar las partes de los microorganismos analizados en la práctica.

 Manejar adecuadamente el microscopio óptico compuesto y determinar la importancia de


los tornillos macrométrico y micrométricos.

 Conocer la importancia de determinar la presencia de microorganismos y su utilización


en la ingeniería ambiental.
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MARCO TEÓRICO

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y


nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos
distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos
discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio. Sembrar o
inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado,
con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado,
el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.

Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:


1. Que se efectúen asépticamente
2. Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados
3. Que se realicen solo los manipuleos indispensables
4. Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o
bien Flujo laminar.

Métodos de siembra:

El método de siembra a emplear dependerá de los objetivos que se pretendan alcanzar con el
cultivo, ya que en ocasiones se requiere que el desarrollo del microorganismo se produzca de
forma masiva, mientras que en otras resulta indispensables que las colonias queden aisladas o
que las manifestaciones del metabolismo tengan lugar con tensiones reducidas o privadas de
oxígeno, los métodos de siembra más empleados son los siguientes:

1. Siembra por estrías.


2. Siembra por punción.
3. Siembra volumétrica.
4. Siembra masiva.

Siempre que se utilicen instrumentos de siembra de platino o nicrón, deben ser calentados en la
llama del mechero hasta el rojo vivo, antes y después de realizar la siembra, con el objetivo de
destruir a los microorganismos contaminantes de la superficie del instrumento. Con
independencia del tipo de medio y el método de siembra a emplear ésta debe realizarse en las
proximidades de la llama del mechero y a que el calor emanado reduce el número de
microorganismos presentes en sus inmediaciones, lo cual es utilizado como un recurso a favor
del proceder aséptico.

Siembra por estrías:

Este método de siembra se realiza sobre la superficie de los medios de cultivo sólidos distribuidos
en placas de "Petry" o en tubos de ensayo solidificados en forma de cuña. Para la siembra por
estría se utiliza el asa de platino o el hisopo. En algunas ocasiones, como explicaremos más
adelante, se utilizan ambos instrumentos en la misma siembra.
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Siembra por punción:

Como es obvio, el instrumento de siembra a emplear será la aguja de platino y el medio de cultivo
sólido, generalmente, en tubo de ensayo. Las manipulaciones y la observancia de las
precauciones de asepsia, son similares que cuando se utiliza el asa. La particularidad que tiene
este método, es que la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente el medio de
cultivo.

Siembra volumétrica:

Este método de siembra consiste en sembrar una muestra liquida cuyo volumen no puede ser
predeterminado, en medio de cultivo sólidos o líquidos. Por ejemplo: En las muestras de exudado
vaginal tomadas con pipetas de Pasteur, no puede determinarse el volumen, ya que este tipo de
pipeta carece de escala de graduación, sin embargo, la orina empleadas en el urocultivo o la
sangre para el hemocultivo se puede determinar con pipeta o jeringuilla respectivamente el
volumen que será sembrado.

Siembra masiva:

Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la espátula de Driglaski. En este
caso la gota de muestra liquida se esparce con la espátula por toda la superficie del medio de
cultivo sólido imprimiendo un movimiento en espiral. La siembra masiva también se puede
realizar con un hisopo grueso embebido de un cultivo líquido, procediendo a su deslizamiento
sobre toda la superficie de una placa de agar.

Muerte de un microorganismo:

Desde el punto de vista microbiológico, un microorganismo muere cuando pierde de forma


irreversible la capacidad de dividirse. Como consecuencia de esta pérdida, no se produce
aumento en el número de microorganismos y, por tanto, no hay crecimiento.

Sin embargo, un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbiológico y
continuar desarrollando una actividad metabólica que se traduzca, por ejemplo, en liberación de
toxinas. Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicación (crecimiento) de
un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las condiciones
físicas o químicas del entorno. En estos casos, podríamos considerar como muertos
microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de nuevo
favorables
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TECNICAS DE TINCIÓN

Tinción de Gram:

Reconocido también como tinción diferencial, es ampliamente utilizado y de gran importancia en


taxonomía bacteriana y la microbiología en general; porque permite diferenciar dos grandes
grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El fundamento
radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen
una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una
capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa (Cedeño, y otros, 2011).

Las diferencias estructurales y químicas de los dos tipos de pared bacteriana son evidenciables
a través de la siguiente figura.

Figura 1. Paredes bacterianas (Gram+ y Gram-). Fuente: (Universidad de Valencia, 2012)

Gram (+):

Son aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de aquí el
nombre de "Gram-positivas" o también "grampositivas". Esta característica está íntimamente
ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organización
bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como taxón se
utiliza también el nombre de Posibacteria. Las restantes son las bacterias Gram negativas.

La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana citoplasmática y


una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano, que rodea a la anterior. La
pared celular se une a la membrana citoplasmática mediante moléculas de ácido lipoteicoico. La
capa de peptidoglicano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de
retener el tinte durante la tinción de Gram. A diferencia de las Gram-negativas, estas bacterias
no presentan una segunda membrana lipídica externa.
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Gram (-):

Son aquellas bacterias que no se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram: de ahí el
nombre de "Gram-negativas" o también "Gram negativas". Esta característica está íntimamente
ligada a la estructura de la envoltura celular, por lo que refleja un tipo natural de organización
bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias y cuando se tratan como taxón se
utiliza también el nombre de Negibacteria. Las bacterias Gram-negativas presentan dos
membranas lipídicas entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglicano, mientras
que las bacterias Gram-positivas presentan sólo una membrana lipídica y la pared de
peptiglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tinción
de Gram. Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades. Los cocos
Gram-negativos causan la gonorrea (Neisseria gonorrhoeae), meningitis (Neisseria meningitidis)
y síntomas respiratorios (Moraxella catarrhalis), entre otros. Los bacilos Gram-negativos incluyen
un gran número de especies. Algunos de ellos causan principalmente enfermedades
respiratorias (Hemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila,
Pseudomonas aeruginosa), enfermedades urinarias (Escherichia coli, Proteus mirabilis,
Enterobacter cloacae, Serratia marcescens) y enfermedades gastrointestinales (Helicobacter
pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi). Otros están asociadas a infecciones
nosocomiales (Acinetobacter baumanii).

Azul De Lactofenol:

Tiene tres funciones importantes a la hora de observar hongos del tipo mohos obtenidos por
aislamiento de medios inoculados. El fenol destruye la flora acompañante. El ácido láctico
conserva las estructuras fúngicas al provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al
interior del fúngico generando una película por así llamarlo protectora. Es útil para realizar el
examen directo de cultivos, ya que es una técnica rápida que permite visualizar perfectamente
las estructuras fúngicas. El colorante es fuertemente ácido y se usa para la tinción directa de
micelio micólico, el cual toma un delicado color azul claro

Fisiología de las bacterias:

La Fisiología microbiana comprende el estudio de las funciones realizadas por los


microorganismos. La función fundamental de todo ser vivo es el crecimiento, esto es aumentar
en forma ordenada el número y la masa de todos sus componentes celulares, tales como pared
celular, membrana citoplasmática, ácidos nucleicos (ADN y ARN), flagelos, fimbrias, entre otros.
Estas estructuras celulares están compuestas fundamentalmente de macromoléculas: proteínas,
polisacáridos, lípidos y ácidos nucleicos. Las bacterias son muy eficientes fisiológicamente,
sintetizan en forma muy rápida todos sus componentes celulares, siendo la mayoría
autosuficientes a pesar de su simpleza estructural. Para que esto ocurra, en la bacteria se
desencadenan una serie de procesos químicos que en su conjunto constituyen el metabolismo
bacteriano.
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Desde su hábitat o entorno la bacteria incorpora las sustancias necesarias para vivir, proceso
llamado nutrición. Una vez incorporados estos nutrientes, a través del metabolismo bacteriano,
la célula será capaz de reproducirse y transmitir su material genético a la progenie.

Nutrición y crecimiento bacterianos:

Las bacterias necesitan de un aporte energético para desarrollarse. Se distinguen distintos tipos
nutricionales según la fuente de energía utilizada: las bacterias que utilizan la luz son fotótrofas
y las que utilizan los procesos de oxirreducción son quimiótrofas. Las bacterias pueden utilizar
un sustrato mineral (litótrofas) u orgánico (organótrofas). Las bacterias patógenas que viven a
expensas de la materia orgánica son quimioorganótrofas. Los gases principales que afectan al
desarrollo microbiano son el oxígeno y el dióxido de carbono. Las bacterias presentan una
respuesta amplia y variable al oxígeno libre clasificándose en cuatro grupos:

 Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxígeno libre.


 Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre.
 Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en
ausencia de oxígeno libre.
 Microaerófilas: bacterias que crecen en presencia de pequeñas cantidades de oxígeno
libre.

Los organismos fotosintéticos deberán ser expuestos a una fuente de iluminación ya que la luz
es su fuente de energía. Esta fuente de iluminación no debe plantear problemas de variación de
temperatura, por lo que suelen usarse lámparas fluorescentes con un desprendimiento mínimo
de calor. El desarrollo de las bacterias depende de reacciones químicas, y la velocidad con que
se efectúan estas reacciones está influida por la temperatura, por lo que la temperatura puede
en parte determinar la velocidad de crecimiento de los microorganismos. Cada especie
microbiana posee una temperatura óptima de crecimiento clasificándose según esto en los
siguientes grupos:

 Psicrófilas: capaces de desarrollarse a 0° C o menos. Su temperatura óptima es


alrededor de los 15° C.
 Mesófilas: crecen mejor entre 25 y 40° C.
 Termófilas: crecen mejor entre 45 y 60° C.

Fisiología de los hongos:

Los hongos por sus características morfológicas, fisiológicas y ecológicas forman un reino
llamado FUNGI, caracterizado por poseer una estructura celular eucariota, carecen de clorofila,
unicelulares (levaduras) o pluricelulares (hongos filamentosos), típicamente inmóviles, de
nutrición heterótrofa y de reproducción sexuada y/o asexuada.
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Existen 2 grandes grupos de hongos:

1. Hongos levaduriformes
2. Hongos filamentados o miceliados o mohos

Hongos Levaduriformes:

Son hongos unicelulares globosos, ovales o alargados de 2 – 6 um que presentan reproducción


asexuada a través de yemación, fisión binaria o procesos intermedios Algunas presentan
reproducción sexuada por ascosporas o teliosporas. Algunas levaduras forman pseudomicelios,
que son brotes que continúan unidos a la célula madre formando cadenas con constricciones
completas sin unidad citoplasmática. Las levaduras se desarrollan a temperaturas óptimas entre
25 y 30°C y forman colonias lisas, de textura húmeda, cremosas o membranosas (sin hifas
aéreas) semejantes a las bacterias. A la observación en fresco, aparecen de mayor tamaño que
las bacterias y se observan células en yemación o fisión. Presentan una tinción Gram (+). Las
levaduras presentan metabolismo fermentativo, por lo cual su identificación se realiza por el
estudio de la fermentación de los azúcares.

Hongos Filamentosos o Mohos:

Son hongos formados por una serie de ramas tubulares llamadas hifas, el conjunto de las cuales
forman el micelio. Se reproducen por la formación de esporas, las cuales pueden ser
pigmentadas y le dan el color al hongo. Al centro de la colonia se ubican las hifas fértiles que
dan origen a las esporas, razón por la cual los hongos son más coloreados en esa zona. Se
caracterizan por presentar crecimiento rápido, tener reservorios naturales en el suelo, plantas,
animales y vegetales muertos, crecen a temperaturas de 25 – 30°C y sus esporas o conidios son
transportados por el aire, son normalmente inhalados y presentan gran resistencia en el medio
ambiente. La mayoría de los hongos filamentosos de interés clínico y vegetal, tienen una fase de
reproducción sexuada (telomorfa), pero es su forma asexual (anamórfica) la que casi siempre
produce las enfermedades y es observada en las muestras.
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MATERIALES UTILIZADOS EN LA PRÁCTICA DE LABORATORIO

Equipo/usos Boceto

Asa Redonda

Consta de una base hecha de acero


y un filamento de tungsteno que
termina en aro o en punta. Se usa
para el transporte de
microorganismos.

Asas Rectas

Sirve para trasladar una sola colonia


a medios de identificación, o sub-
cultivo
Mechero

es un instrumento utilizado en
laboratorios para calentar muestras
y sustancias químicas

Incubadora

Equipo diseñado para mantener una


cámara a temperatura, atmósfera y
humedad controladas, con el fin de
conservar organismos vivos en un
entorno que resulte adecuado para
su crecimiento

Microscopio

Instrumento diseñado para ser


posible la observación y examen de
seres muy pequeños o los
elementos formativo de uno de ellos
y que están fuera de la visibilidad
adecuada del ojo humano.
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Autoclave

Dispositivo que sirve para esterilizar


material de laboratorio, utilizando
vapor de agua a alta presión y
temperatura, evitando con las altas
presiones que el agua llegue a
ebullir a pesar de su alta
temperatura.
Cajas Petry

Recipiente redondo, de cristal o


plástico, con una cubierta de la
misma forma que la placa, pero algo
más grande de diámetro, para que
se pueda colocar encima y cerrar el
recipiente, aunque no de forma
hermética.

Vinipel

Envoltura plástica utilizada para


forrar cualquier tipo de superficie

Agar Nutritivo

medio de cultivo usado


normalmente como rutina para todo
tipo de bacteria

Papa de Dextrosa

Base para el crecimiento de hongos


y levaduras
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PROCEDIMIENTO DE LAS PRÁCTICAS REALIZADAS

Figura 2. Métodos de resiembra de microorganismos en el laboratorio de microbiología.


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Figura 3. Métodos de tinción de microorganismos en el laboratorio de microbiología.


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ANÁLISIS DE RESULTADOS

Para realizar la resiembra de los microorganismos es necesario de un sustrato o medio de cultivo


que le permita proporcionar a las bacteria y hongos las condiciones físicas, químicas y nutritivas
para que puedan desarrollarse adecuadamente, estos sustratos reciben el nombre de Agar, el
Agar nutritivo es utilizado para el crecimiento de las bacterias y el Agar PDA (papa dextrosa)
para el crecimiento de hongos. Para el desarrollo de la práctica se realizaron los dos medios de
cultivo siguiendo una serie de especificaciones que vienen en el recipiente que contiene el agar,
en él se indica el peso a tomar y el tratamiento que se le debe realizar. Cuando se tiene el medio
de cultivo preparado se procede a realizar la resiembra de los microorganismos, los cuales fueron
aportados por la universidad a través de la tutora la cual pudo conseguir muestras clínicas para
el análisis. Para la siembra se utilizaron dos tipos de asas, la primera de tipo redonda (utilizada
para la siembra de bacterias), la segunda denominada de aguja o recta (utilizada para la siembra
de hongos)

Siembra de bacterias: para realizar la siembra de bacterias se prepara el agar nutritivo,


tomando 5,6 gramos de agar y llevándolos a un volumen de 200 mL de agua destilada.
Se calienta el agua Se le agrega el agar Se vierte en las cajas Petri y se
destilada en el mechero nutritivo cubren con papel vinipel

Las cajas son cubiertas Se introduce en la autoclave por 15 minutos a una presión de
con papel de azúcar 120 atm y temperatura de 150 ºC, se deja enfriar y está listo
para su utilización
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Transcurrido los 15 minutos son retirados de la autoclave, se les retira la envoltura y se


almacenan en la nevera por 5 minutos, con el medio ya solidificado se realiza la respectiva
siembra, las bacterias deben ser sembradas con el asa redonda y utilizando el método de estría,
para la cual se deben seguir los siguientes pasos:

 Se esteriliza el asa redonda, se somete a la flama del mechero por 1 minuto hasta que
se tenga un rojo incandescente, se retira por unos pocos segundos y se introduce en la
muestra clínica para tomar una cepa de bacterias y se llevan al agar nutritivo utilizando
el método de estría.
 Una vez realizada la siembra tapar inmediatamente la caja de Petri y se esteriliza
nuevamente el asa.
 Cubrir con papel vinipel e incubar a 37 ºC, durante 24 horas invirtiendo la caja Petri antes
de su almacenamiento.
 Al finalizar la siembra esterilizar el área de trabajo con limpiones, mantener durante todo
el proceso el mechero encendido.

Figura 4. Siembra de bacterias en agar nutritivo.

Siembra de Hongos: para realizar la siembra de bacterias se prepara el agar PDA, tomando 7,8
gramos de agar y llevándolos a un volumen de 200 mL de agua destilada.

Se vierte en las cajas Petri


Se calienta el agua destilada en el Se le agrega el
y se cubren con papel
mechero agar PDA
vinipel
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Las cajas son cubiertas con papel de Se introduce en la autoclave por 15 minutos a
azúcar una presión de 120 atm y temperatura de 150 ºC,
se deja enfriar y está listo para su utilización

Transcurrido los 15 minutos son retirados de la autoclave, se les retira la envoltura y se


almacenan en la nevera por 5 minutos, con el medio ya solidificado se realiza la respectiva
siembra, los hongos deben ser sembrados con el asa de aguja o recta y utilizando el método de
punción, para la cual se deben seguir los siguientes pasos:

 Se esteriliza el asa de aguja, se somete a la flama del mechero por 1 minuto hasta que
se tenga un rojo incandescente, se retira por unos pocos segundos y se introduce en la
muestra de hongo filamentoso para tomar un pedazo del hongo y se llevan al agar PDA
utilizando el método de punción, el cual se realiza con tres puntos en forma de triángulo.
 Una vez realizada la siembra tapar inmediatamente la caja de Petri y se esteriliza
nuevamente el asa.
 Cubrir con papel vinipel y trasladar hacia un sitio oscuro y a temperatura ambiente,
durante 8 días.
 Al finalizar la siembra esterilizar el área de trabajo con limpiones, mantener durante todo
el proceso el mechero encendido.

Figura 5. Siembra de hongos en agar PDA.


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Realización de la tinción y observación en el microscopio óptico compuesto:

La segunda parte de la práctica consiste en la lectura del crecimiento bacteriano y de los hongos,
lastimosamente las bacterias no se desarrollaron y los hongos si se formaron adecuadamente.
Para realizar la tinción de Gram se utiliza nuevamente las muestras clínicas debido a que las
muestras que se sembraron en el laboratorio no crecieron. Para realizar las tinciones y
observación de en el microscopio se realiza el frotis, el cual consiste en fijar el microorganismo
a la lámina porta objetos. Para desarrollar el frotis del microorganismo y la tinción se desarrollan
los siguientes pasos:

 Esterilizar el asa redonda para las bacterias y se toma una muestra de las bacterias de
carácter clínico, se extiende sobre la lámina portaobjetos en toda la mitad.
 Colocar la lámina encima de la flama del mechero y hacer 3 pasadas rápidas para que el
microorganismo quede fijo sobre la lámina.
 Dejar secar al ambiente el residuo resultante de la lámina durante 15 minutos.
 Realizar la coloración compuesta, colocar sobre la lámina portaobjetos con la bacteria
fijada una gota de cristal violeta y esperar 1 minuto (lavar el exceso con agua destilada);
adicionar una gota de lugol y esperar 1 minuto (lavar el exceso con alcohol acetona);
adicionar unas gotas de alcohol acetona durante 25 segundos, por ultimo adicionar
fuscina o safranina durante 30 segundos y lavar el exceso con agua destilada.
 Dejar reposar la muestra al ambiente por 15 minutos antes de realizar las observaciones
en el microscopio.
 Realizar el montaje de la muestra en el microscopio y observar a los diferentes aumentos.

Nota: Para la tinción de los hongos se coloca una parte de la muestra en el centro de una lámina
portaobjetos y se adiciona una gota de azul de lactofenol, la muestra se analiza directamente y
no se realiza la fijación.

Figura 6. Realización de la tinción de Gram para la observación en el microscopio.


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Tabla 1.
Resultados de la práctica de laboratorio realizada durante la tinción de microorganismos
y observación en el microscopio óptico compuesto.
Tinción de Gram – montaje de Bacterias
4X 10 X Descripción observación

En el objetivo de 4X se evidencian
pequeñas manchas de color rosa,
las cuales se presumen son
bacterias Gran negativas.
En el objetivo de 10X se puede
penetrar más la característica de las
manchas, pero todavía no se
evidencia claramente la forma de las
bacterias.

40 X 40 X Durante la observación de la
muestra en el aumento de 40 X, se
logra evidenciar la forma de las
bacterias las cuales poseen forma
de bacilos y solo se logra diferenciar
la membrana celular,
lastimosamente no se pudro realizar
las observaciones en el aumento de
100 debido a que no se contaba con
el aceite de inmersión.
Tinción con azul de Lactofenol – montaje para Hongos
4X 10 X

Se evidencia la presencia de un
hongo de carácter filamentoso, en el
aumento de 4 X y 10 X, se logra
observar pequeños segmentos que
componen el hongo o micelio, dado
su grado de filamentoso. El hongo
posee una coloración parda en el
centro pero no se logra evidenciar
claramente los componentes que
posee.
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40 X 100 X
En los aumentos de 40 X y de 100 X
se logra adentrar más a la
constitución de este hongo,
utilizando suavemente el tornillo
micrométrico se logró penetrar más
en la imagen, y se evidencia la
presencia de micelio, que conformo
el hongo de carácter filamentoso y
en el aumento mayor se observan
las hifas y los conidios pequeñas
esferitas con un punto oscuro o
pardo en el centro de tales esferas,
las cuales están conectadas a las
hifas las cuales están segmentadas.

CONCLUSIONES

Se identificaron las normas de higiene en un laboratorio, esto con el fin de no contraer


enfermedades producidas por microorganismos.

Durante el desarrollo de las diferentes prácticas se logra comprender el procedimiento adecuado


para la siembra y crecimiento de los diferentes microorganismos en el agar nutritivo y/o Papa
dextrosa respectivamente para bacterias y Hongos.

Durante las observaciones realizadas en el microscopio óptico compuesto se evidencia de la


importancia de los tornillos macrométrico y micrométrico, siendo este último el encargado de
darle la definición y penetración a las imágenes.

Se logra determinar que las bacterias sembradas en el agar nutritivo no se desarrollaron


adecuadamente, posiblemente al ineficiente proceso de esterilización o incubación que no
permite el crecimiento bacteriano, debido a este inconveniente se analizaron las muestras
clínicas presentadas por la tutora y se determinó durante las observaciones en los diferentes
aumentos que las muestras son bacterias Gran negativas por la presencia de una coloración
rosa y que poseen forma de bacilos.

Durante el desarrollo de la resiembra de los microorganismos se logra diferenciar los diferentes


tipos de asas utilizadas para la siembra, siendo el método de estría utilizado para bacterias y el
método de punción para los hongos.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Cedeño, K., Lau, L., Gracias, L., Bernal, K., González, F. M., & Echeto, Y. (19 de Diciembre de
2011). Laboratorio de Microbiología. Recuperado el 17 de Noviembre de 2016, de
http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com.co/p/tincion-de-gram_20.html

Explorando el universo de la Microbiología. (2014). Fisiología Bacteriana. Recuperado el 17 de


Noviembre de 2016, de http://microbiologiavip.blogspot.com.co/2012/02/fisiologia-
bacteriana.html

Libro de autores Cubanos (2016) Métodos de Siembra. Recuperado el 17 de Noviembre de


2016 de http://gsdl.bvs.sld.cu/cgi-bin/library?e=d-00000-00---off-0preclini--00-0----0-10-0---0-
--0direct-10---4-------0-1l--11-ptZz-br-50---20-about---00-0-1-00-0-0-11-1-0utfZz-8-
00&a=d&cl=CL1&d=HASH01ebc63ab80c0bbb5a182dab.20.4

López, L., Hernández, M., Adriana, C., Ortega, S., Cerón, G., & Franco, R. (2014). Las
tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Investigación en Discapacidad,
CENIAQ. (1), 10-18. Recuperado de http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-
2014/ir141b.pdf

Microbiología celular (2015) Tema No 2 Cultivo de Microorganismos, Recuperado el 17 de


Noviembre de 2016 de http://www.unavarra.es/genmic/microgral/Tema%2002.-
%20Cultivo%20de%20microorganismos.pdf

Universidad Central de Venezuela. (s/f). El Microscopio. Faculta de Ciencias. Recuperado de


http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/labbiolvegetal/archivos/1%20El%20Microscopi
o.pdf

Universidad de Valencia. (2012). Prácticas de microbiología. Recuperado el 17 de Noviembre


de 2016, de http://www.uv.es/~jjmateo/microb/Gram(II).doc

Universidad Nacional Autónoma de México. (2016). Generalidades de la micología Bacteriana.


Recuperado el 17 de Noviembre de 2016, de
http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/micologia/generalidades.html

Universidad Nacional de San Juan. (s/f). Microscopía Óptica, trabajo práctico Nº 1. Recuperado
de http://dea.unsj.edu.ar/biologia1/micro.pdf

Universo. (2009). Gram (+) y Gram (-). Recuperado el 17 de Noviembre de 2016, de


http://fuffupapachon.blogspot.com.co/2009/11/gram-y-gram.html