PREPARACIONES

MICROSCOPICAS
Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrir a la creación de
preparaciones microscópicas que pueden ser de dos tipos: húmedas y fijadas.

Estas, en base a la durabilidad en el tiempo también pueden ser temporales (si se descarta
inmediatamente luego de utilizarse) o permanentes (si se almacena, aplicando en algunos
casos algún tipo de sellador que se aplica en el cubreobjetos).

Preparaciones húmedas: Se realiza colocando una gota de la suspensión de

un microorganismo en un portaobjeto y posteriormente se coloca un
cubreobjetos. Luego se observa directamente.

Preparaciones fijadas: Se realizan generalmente para la observación de

bacterias. Se coloca una suspensión homogénea de bacterias sobre el
portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos).
Después se tiñen mediante diferentes técnicas. Estas preparaciones se
observan sin cubreobjetos y habitualmente, con objetivos de inmersión
aplicando aceite de inmersión. Se realiza por tanto un frotis y posteriormente
se fija para luego teñirlo.
 Preparación de frotis bacteriano y fijación.

Frotis: Es una película o capa muy delgada de una porción de cultivo de bacteria que se
realiza extendiéndola sobre un portaobjetos para separar lo mas posible las bacterias y tener
imágenes claras y nítidas.

Para hacer un frotis, cuando se parte de un cultivo de bacterias en medio líquido, se toma una o varias
cargas directamente con el asa y se extienden ampliamente sobre el portaobjetos de tal manera que las
bacterias se separen lo mejor posible.

La fijación tiene por objeto provocar modificaciones en la composición físico-química de la bacteria

(coagulación de las proteínas, etc.) de forma que ésta conserve definitivamente la estructura similar a
la que tenía en vivo, sin deformarse como consecuencia de los tratamientos a que se verá sometida
durante la tinción.

Por otra parte la fijación impide el arrastre de los microorganismos al quedar estos adheridos al
portaobjetos y hace que la pared celular sea más permeable a los colorantes.

Para la fijación pueden utilizarse agentes químicos (formol, metanol) o agentes físicos como el calor.
Nosotros emplearemos el calor
 Tinción.
Además de la ampliación de la imagen, en microscopía, hay que
tener en cuenta dos factores más: el contraste y la resolución.

Los objetos deben poseer un cierto grado de contraste con su

medio circundante para poder ser percibidos a través del
microscopio.

Por ello es que la mayoría de los organismos necesitan ser

previamente teñidos para poder distinguirlos del medio.

Las tinciones o coloraciones son técnicas que permiten observar

microorganismos y sus formas. En esta oportunidad observaremos
algunas formas típicas que presentan las bacterias: cocos
(esféricos), bacilares (bastones cilíndricos).
La observación de los microorganismos esté en función de la capacidad de los
mismos para retener o no determinadas sustancias colorantes, lo que
depende de la carga de la célula y del colorante.

Los colorantes pueden ser:

Básicos: sus moléculas están cargadas positivamente (cationes) y se
combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados
negativamente, tales como ácidos nucleicos y polisacáridos ácidos.
Ej. Azul de metileno, cristal violeta, safranina.

Ácidos: sus moléculas están cargadas negativamente (aniones) y se

combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales
como proteínas.
Ej. Eosina, fucsina acida y rojo Congo.

Neutros: sus moléculas son sales cargadas positivamente y negativamente.

 Coloración simple del frotis bacteriano.

Es la tinción de las bacterias utilizando colorantes específicos.

Es simple por que se usa un colorante.

Objetivo de la coloración.
Contrastar entre la bacteria ya coloreada y el medio que la rodea,
distinguiéndose su forma y disposición.
• Colorantes.
Son sustancias sintéticos y orgánicos
compuestos de moléculas cargadas positiva o
negativamente.

• Fundamento de la coloración.
De acuerdo a la naturaleza de la carga
molecular del colorante, así manifiesta un
grado de afinidad por los materiales celulares,
que poseen cargas contrarias.
Las tinciones pueden ser:
Simples.
Utilizan un solo colorante.
Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su
entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El
colorante tiñe las células (azul de metileno, safranina) o no (nigrosina).

Diferenciales.
Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y
por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los
microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción.
En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción de
Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un
colorante.

Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta

composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes.

Ej.; tinción de esporas, de flagelos, de capsula. Pueden utilizarse uno o más colorantes.
 Observación de estructuras de hongos.
Para observar estructuras de hongos (y algunos otros microorganismos en particular) es
necesario realizar preparaciones microscópicas húmedas.
En esta oportunidad observaremos estructuras de hongos que dañan plantas.

Al realizar preparaciones húmedas es necesario igualmente la utilización de colorantes

específicos para teñir las estructuras de los hongos, uno de ellos es el Lactofenol Azul
Algodón.

Este tipo de preparación se diferencia de los frotis en que éste no es fijado, se utiliza
cubreobjetos y se observa mediante el objetivo de 40x.

Algunos hongos (Fitopatógenos) causan daño a las plantas (enfermedades), lo cual afecta su
rendimiento.

La importancia de este tipo de preparaciones radica en que contribuye al buen diagnóstico

(en esta ocasión) de las enfermedades de las plantas y posteriormente aplicar medidas de
control que protejan la producción y favorezca la rentabilidad.

Para preparar laminas para observar hongos a partir de tejidos vegetales enfermos (hojas,
etc.), se raspa la superficie de la hoja con daño y se obtiene estructuras del hongo.
 Objetivos.
1. Realizar preparaciones microscópicas húmedas.
2. Realizar preparaciones microscópicas fijadas.
3. Identificar formas bacterianas.
4. Identificar estructuras de hongos.

Materiales y equipo.
· Cultivo de bacterias en medio sólido.
· Safranina
· Cultivo de bacterias en medio líquido.
· Tirro.
· Mechero de Bunsen.
· Láminas portaobjetos.
· Muestra vegetales enfermas.
· Microscopio.
· Bandeja de tinción.
· Laminas cubreobjetos.
· Asa bacteriológica.
· Solución salina o agua destilada.
· Lactofenol azul algodón.
· Aceite de inmersión. · Fósforos.
· Hoja de afeitar.
· Otros.
 PASO 1: PREPARACION DE FROTIS BACTERIANO.
Frotis bacteriano utilizando cultivo en medio sólido.

1. Colocar una pequeña gota de agua destilada estéril o solución salina en el centro de un portaobjetos limpio.
Es necesario utilizar poca cantidad de agua; por lo que se puede usar el pequeño aro del asa porque allí queda
retenida una cantidad de agua suficiente para hacer el frotis.

2. Flamear el asa de siembra (hasta que se torne rojo intenso), tomar en condiciones asépticas (cerca del mechero)
una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua.

3. Mezclar con el asa de siembra hasta formar una película homogénea.

Procurar que quede bastante extendida para facilitar su secado rápido.

4. Esperar a que el frotis se seque al aire. Se puede acelerar su secado, acercando la lámina al mechero.
En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el portaobjetos, pues las células pueden
deformarse o romperse.

5. Estando el frotis seco, proceder a fijarlo por aplicación de calor: pasar tres veces el portaobjetos por la llama
durante unos segundos, dejar enfriar el portaobjetos entre los pases a la llama (ya que el portaobjetos puede
quebrarse al sobrecalentarse).

6. El frotis ya fijo, puede teñirse o colorearse.

Frotis bacteriano utilizando cultivo en medio líquido (caldo nutritivo).

1.Tome el asa bacteriológica y esterilícela flameándola en el mechero.

Tome el cultivo en medio líquido, ábralo cerca del mechero y con el asa ya esterilizada tome
una porción del cultivo. Cierre el tubo.

2. Deposite la porción tomada en el centro de un portaobjetos y extiéndala en forma circular

a modo de formar una película homogénea.
Procurar que quede bastante extendida para facilitar su secado.

3. Esperar a que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el portaobjetos a

la llama del mechero.
En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el portaobjetos,
pues las células pueden deformarse o romperse.

4. Estando el portaobjetos seco, proceder a fijar el frotis por aplicación de calor:

pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos, dejar enfriar el
portaobjetos entre los pases (ya que el portaobjetos puede quebrarse al sobrecalentarse).

5. El frotis ya fijo, puede teñirse o colorearse.

 PASO 2: TINCION DE FROTIS BACTERIANO (COLORACIÓN SIMPLE).

1. Cubrir el frotis ya preparado con abundante colorante (safranina) y dejarlo actuar por 2
minutos.

2. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante.

Para ello se debe inclinar el portaobjetos y dejar que el chorro suave de agua caiga en su parte
superior, de manera que resbale sobre el frotis, sin que vaya dirigido directamente sobre él,
pues de ser así, podría arrastrar parte del frotis consigo.

3. Eliminar el exceso de agua del portaobjetos, golpeándolo con cuidado en uno de sus bordes
laterales, contra la superficie de la mesa de trabajo.

4. Secar el portaobjetos presionando entre dos papeles absorbentes, pero SIN FROTAR el
portaobjetos.

5. Aplicar una pequeña gota de aceite de inmersión sobre el frotis teñido y observar la
preparación al microscopio llegando hasta el 100x.

6. Hacer esquemas de lo observado y describir las formas bacterianas.

 Coloración simple del frotis.

2
1
Lavar con agua y eliminar exceso.

Safranina: 2 min.

4
3
Microscopio: 100x
Aceite de Inmersión.
Secar portaobjetos
“SIN FROTAR”.
PREPARACION MICROSCOPICA HUMEDA PARA OBSERVAR ESPORAS Y ESTRUCTURAS
DE HONGOS.

Para preparar láminas microscópicas (temporales) se siguen los siguientes pasos:

1.Tome una hoja de afeitar y raspe la superficie de la hoja en donde se observa la presencia
del hongo.

2. Coloque una gota pequeña de Lactofenol azul algodón en el centro de un portaobjetos y

deposite sobre la misma el contenido del raspado.

3. Coloque sobre la gota un cubreobjetos, haciéndolo con cuidado para evitar formación de
burbujas.

4. Observar en el microscopio hasta el lente de 40X. (No utilice el de 100X)

5. Hacer esquemas y dibujar las estructuras observadas del hongo (esporas y micelio).

6. Etiquetar el portaobjetos con el nombre del hongo, fecha y lado de mesa.