Ingeniería Ambiental

Microbiología
Profesor:
M.I. Jesús Miguel Castro Montoya
Practicas:
Practica 3. Obtención de cultivos puros
a partir de cultivos mixtos utilizando
diversas técnicas de aislamiento
Practica 4. Identificación presuntiva de
bacterias por su morfología
colonial y características microscópicas.

practica 5.conservación de sepas

Entrega: 27/03/23
Alumno: Samantha Jatziry Rivera
Aldapa

Práctica 3. Obtención de cultivos puros a partir de cultivos mixtos utilizando diversas técnicas de
aislamiento

Competencia general
• Obtiene cultivos puros a partir de poblaciones mixtas, utilizando técnicas adecuadas de
aislamiento y transferencia. Competencias específicas
• Prepara el área de trabajo y evita contaminación, mediante la aplicación de la técnica
adecuada. Selecciona las técnicas de siembra adecuadas para alcanzar un objetivo específico.
• Obtiene cultivos puros transfiriendo colonias aisladas por estría cruzada y diseminación
con varilla acodada.
Competencias transversales
• Organiza el material para su fácil identificación y manejo.
• Genera informes de experimentos realizados a partir de la búsqueda, procesamiento y
análisis de información procedente de diversas fuentes.
Actitudes y valores
• Sustenta una postura personal sobre el tema, considerando otros puntos de vista de
manera crítica y reflexiva.
• Respeta a sus compañeros y las normas del laboratorio.
Antecedentes teóricos
El cultivo de microorganismos consiste en proporcionar a éstos, las condiciones físicas, químicas y
nutricionales adecuadas para su multiplicación de manera controlada. El cultivo se inicia con la
siembra o inoculación del microorganismo (inóculo) en un medio de cultivo adecuado e incubado
a una temperatura adecuada para el crecimiento de los microorganismos. La siembra puede
realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, asa, hisopo o pipeta estéril. En la
naturaleza los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas, en las que unos
individuos interaccionan con otros estableciendo complejas relaciones. En estas condiciones, el
grado de dificultad que implica el estudio de los microorganismos en poblaciones mixtas, es muy
alto. El aislamiento de individuos a partir de poblaciones mixtas y la obtención de cultivos puros
formados por microorganismos de un solo tipo, constituyó un avance trascendental en la
Microbiología, posibilitando su estudio. El cultivo axénico o puro es aquel que contiene un solo
tipo de microorganismo y que proviene de una sola célula, el crecimiento de ésta, origina en
medio sólido, una masa celular visible que recibe el nombre de colonia. Cada colonia representa
una población de microorganismos procedentes de una sola célula, a partir de la cual se tiene la
seguridad de obtener el cultivo puro de un solo tipo de microorganismo. La obtención de un
cultivo puro a partir de una población mixta, se efectúa mediante el aislamiento y la transferencia.
El aislamiento se realiza mediante técnicas como la estría cruzada y la diseminación en superficie
con varilla acodada, entre otras, basadas en diluir la muestra inicial para obtener colonias aisladas.
La transferencia consiste en transferir las colonias aisladas a tubos con medio de cultivo sólido
inclinado, para obtener un cultivo puro. El medio de cultivo utilizado en el proceso de aislamiento
dependerá, entre otros parámetros, de los requerimientos nutricionales de los microorganismos
que se desee aislar y de la presencia de microorganismos que, por sus características y por la
cantidad en que se encuentren en la muestra, dificulten la obtención del microorganismo objeto
del aislamiento. En este último caso, es necesario utilizar medios de enriquecimiento y medios
selectivos que inhiban el desarrollo de microorganismos contaminantes. Una vez que se ha
obtenido un cultivo puro, se puede mantener haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o
bien congelando las células en glicerol (10-30%) a -70° C, en Nitrógeno líquido a -173° C, o
mediante liofilización. Los cultivos puros son esenciales para el estudio y caracterización de los
microorganismos.
Materiales
• Bitácora de laboratorio
• Cronómetro
Equipo
• Cámara fotográfica
• Gabinete de bioseguridad
• Mecheros Fisher
• Espátulas
• Varillas acodadas de vidrio
• Varillas acodadas de poliestireno estériles
• Asas de siembra
• Matraces Erlenmeyer de 100, 250 y 500 ml
• Probetas de 100
• Placas de Petri estériles
• Tubos de cultivo
• Gradilla para tubos
• Pipetas graduadas de 1 ml
• Dispensadores para pipetas
• Micropipetas de 0.1 – 5.0 ml
• Puntillas estériles para micropipetas 0.1 – 5.0 ml
• Pipetas Pasteur
• Vaso de precipitado de 100, 250 y 500 ml
• Piseta
• Algodón
• Gasa
• Parafilm
• Papel estraza
• Papel metálico
• Papel secante
• Guantes de asbesto
• Guantes de latex y cubreboca estériles
• Marcadores indelebles
• Cinta masking con indicador de esterilidad
• Solución de fenol al 5% o benzal al 10%
• Solución de cristal violeta
• Solución de lugol
• Solución alcohol-acetona (3:1)
• Solución safranina al 0,5%
• Alcohol de 96º
• Agua destilada
• Agar nutritivo
• Agar eosina azul de metileno
• Material biológico: cultivos mixtos
• Microscopio óptico
• Autoclave
• Incubadora con termómetro
• Baño María
• Horno Pasteur
• Balanza analítica
• Planchas agitadoras para placas de Petri
Fundamento
Mediante el aislamiento se logra la separación de los microorganismos que se encuentran en un
cultivo mixto, y las colonias aisladas es posible transferirlas a un medio sólido para obtener un
cultivo axénico o puro.
Procedimiento 1

1. Aislamiento de microorganismos por estría cruzada o estría múltiple

• Desinfecte el área de trabajo con una solución de fenol al 5% o de benzal al 10%.

• Prepare una placa de agar eosina azul de metileno estéril por cada integrante del equipo
de trabajo, y una placa más que se usará como control. Siga el mismo procedimiento para la
preparación y esterilización de medios de cultivo, que realizó en la práctica no. 2.
• En caso de no utilizar el gabinete de bioseguridad, encienda los mecheros y coloque junto
a los mecheros, todo el material necesario de modo tal, que trabaje sin dificultad a una distancia
no mayor a 15 cm de la llama de los mecheros.
• Esterilice el asa de siembra de manera directa en el mechero hasta que alcance el rojo
incandescente y enfríe 10 segundos en la proximidad de la llama del mechero. En caso de trabajar
en el gabinete de bioseguridad, utilice asa desechable, o bien, utilice mecheros Fisher para
esterilizar el asa.

• Utilice los cultivos mixtos que obtuvo en la práctica anterior. Si el microorganismo a aislar
se encuentra en medio de cultivo líquido, abra el tubo del cultivo sosteniendo la tapa del tubo con
el dedo meñique de la misma mano con la que sostiene el asa, NUNCA deposite la tapa sobre la
mesa o gradilla, pues está cargada de microorganismos. Flamee la boca del tubo y tome el inóculo
agitando suavemente el asa dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensión
superficial en el extremo del asa de siembra. Flamee nuevamente la boca del tubo antes de cerrar,
para fijar al vidrio los microorganismos que pudieran estar presentes en ésta.

1) Esterilice el asa y deje enfriar.

2) Destape y lame la boca del tubo.
3) tome el inóculo, vuelva a flamear y tape el tubo. Precauciones: El asa de siembra se
maneja como si se tratase de un lápiz. La boca del tubo de cultivo se flamea después de abrir y
antes de cerrar el tubo. El tapón del tubo se mantiene en el dedo meñique de la misma mano con
la que sostiene el asa. Absolutamente todo el procedimiento es realizado cerca del mechero o
bien, en el gabinete de bioseguridad.
• Si el microorganismo a aislar se encuentra en medio de cultivo sólido, coloque la placa en
forma invertida sobre la mesa de trabajo junto al mechero.

• Esterilice el asa en el mechero. Levante la parte que contiene el medio de cultivo con los
microorganismos, llévela a la proximidad de la llama del mechero (si es que no trabaja en gabinete
de bioseguridad) enfríe el asa en la orilla del medio de cultivo, donde no se ve masa microbiana y
tome una pequeña porción de una colonia aislada mediante un ligero roce con el asa de siembra.

• Una vez que ya tiene el asa cargada con microorganismos procedentes de un cultivo en
medio líquido o sólido, tome una placa de Petri con agar nutritivo estéril y extienda sobre un área
pequeña de la superficie del medio de cultivo, en forma de estrías muy juntas (carga), pero sin
hacer presión para no dañar el agar.

• Flamee y enfríe el asa y después roce la siembra realizada previamente, extienda de nuevo
por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameado
y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría.

• Deje una placa sin inóculo como control de esterilidad del medio.
• Incube las placas a 35ºC durante 24 horas, en posición invertida (las inoculadas y el
control.
2. Aislamiento de microorganismos por diseminación en superficie con varilla acodada o asa
Digralsky.
• Prepare 5 tubos de cultivo con 9 ml de agua destilada estéril y 11 placas de Petri con agar
nutritivo estériles. Siga el mismo procedimiento para la preparación y esterilización de soluciones
y medios de cultivo, que realizó en la práctica no. 2.
• Coloque en una gradilla los 5 tubos de cultivo con 9 ml de agua destilada estéril. Con
mictropipeta y puntilla estéril, tome1 ml del cultivo mixto en medio líquido que obtuvo en la
práctica anterior, y deposítelo en el primer tubo, homogeneice y rotule como 10-1 . De este tubo
tome 1 ml y deposítelo en el segundo tubo, homogeneice y rotule como 10-2 , siga el mismo
procedimiento hasta llegar a la dilución 10-5. Utilice una puntilla estéril diferente para cada
dilución. No deseche los tubos de dilución, ya que se requerirán para realizar el método de vertido
en placa.
• Si utiliza varilla de vidrio, introduzca el brazo más corto de la varilla acodada, en alcohol al
70%. Si utiliza varilla acodada de poliestireno, esta puede esterilizarla por radiación.
• Use una micropipeta y deposite 0,1 ml de de la dilución 10-1 en una placa con agar
nutritivo estéril (por duplicado). Tome la varilla acodada, expóngala a la llama del mechero
durante unos segundos, enfríe unos segundos, y luego utilice el brazo más corto de la varilla para
dispersar el inóculo, de manera uniforme sobre la superficie completa del agar, hasta que se
absorba, como se muestra en la figura de la parte inferior. Siga el mismo procedimiento para cada
una de las diluciones. Considere que las placas han de hacerse por duplicado.
• Deje una placa más, sin inóculo como control de esterilidad del medio.
• Incube las placas a 35ºC durante 24 horas, en posición invertida (las inoculadas y el
control)
3. Transferencia de colonias aisladas para obtener cultivos puros
La técnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo de
recipiente que los contiene. Se pueden presentar los siguientes casos:
• Siembra de un medio líquido a medio líquido: el procedimiento se puede realizar con asa,
aguja o pipeta y en tubos de cultivo, matraces o frascos de dilución.

• Siembra de medio sólido a medio líquido: el procedimiento se realiza con asa o aguja y en
tubo de cultivo, matraces o frascos de dilución.
• Siembra de medio sólido a medio sólido: el procedimiento se puede realizar con asa o
aguja y en tubo de cultivo, ya sea en superficie en placa de Petri por estría o en profundidad en
tubo de cultivo.
• Siembra de medio líquido a medio sólido: El procedimiento se realiza con asa, aguja o
pipeta Pasteur y en tubo de cultivo inclinado o en placa de Petri por estría.
• Tras la incubación de las placas inoculadas por estría cruzada y las inoculadas con varilla
acodada, realice frotis del crecimiento bacteriano a partir de ambas placas y tíñalos con la tinción
de Gram, si todas las células observadas coinciden morfológicamente, proceda a transferir la
colonia a tubo con agar inclinado para obtener un cultivo puro.
• Usando el asa de siembra estéril, transfiera a un tubo con agar nutritivo estéril e inclinado,
una pequeña porción de una colonia completamente aislada, de cualquiera de las placas de Petri
utilizadas para el aislamiento en superficie con varilla acodada o estría cruzada.
• Introduzca el asa en el tubo de agar inclinado hasta el fondo, diluyendo el inóculo en el
agua de condensación que se acumula en esa parte, luego mueva el asa suavemente sobre la
superficie del agar con un movimiento de zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte
superior del medio.
• Deje un tubo de cultivo con agar inclinado, sin inocular, como control. Incube los tubos,
incluyendo el control, a una temperatura de 35ºC durante 24 horas.
• Después de la incubación, observe en los tubos de cultivo, la aparición de crecimiento
bacteriano sobre la superficie del agar.
• Mantenga los cultivos puros, previamente rotulados, entre 2-8ºC para formar un cepario.
Observaciones y resultados

Conclusiones
Con esta practica aprendimos que en la naturaleza los microorganismos se encuentran formando
poblaciones mixtas con otros tipos de microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se llaman
por ello cultivos mixtos. Sin embargo, el conocimiento de los microorganismos se consigue
mediante el estudio de cepas aisladas, cultivadas en el laboratorio en cultivos puros (o axénicos).
En ocasiones el estudio molecular conduce a la caracterización de los microorganismos, aún en
poblaciones mixtas. Sin embargo la identificación bacteriana y la caracterización completa solo es
posible tras el aislamiento de la bacteria y la obtención de cultivos puros. Por ello el primer
problema al estudiar una bacteria es su aislamiento del resto de los microorganismos presentes
(enn una muestra patológica, de agua, de suelo, de alimentos, etc.). Una vez que se ha logrado el
aislamiento es posible obtener la bacteria de interés en cultivo puro.
Evaluación
• La evaluación es sistemática con una planeación flexible y criterios definidos. Continua a
través de la observación de los desempeños en los aspectos puntuales relacionados con el trabajo
de laboratorio; formativa y sumativa, los desempeños logrados abonan a la competencia general
del curso.
• Se centra en recabar evidencias (de conocimiento, producto, desempeño y actitud), de los
aprendizajes de los alumnos, para lograr el desarrollo de las competencias propuestas para esta
actividad.
• Se evalúa el reporte que elabora el alumno, considerando los criterios establecidos en la
rúbrica diseñada para tal fin, además de las respuestas del siguiente cuestionario:
1. ¿Qué entiende por cultivo mixto y qué por cultivo puro? Un cultivo mixto es aquel en el
cual hay una siembra y salen diferentes tipo de microrganismos, por ejemplo e.coli, Salmonella,
etc, y el puro es aquel en el cual se extrae del cultivo mixto pero de una sola especie como el e.coli
solo.
2. ¿En qué consiste el aislamiento por estría cruzada? Consiste en separar las colonias y así
poder hacer la observación mejor
3. ¿Por qué se recomienda enfriar el asa en el medio de cultivo antes de realizar las estrías
cruzadas? Para que el microrganismo no se muera
4. ¿Cuáles fueron las ventajas y desventajas que presentaron los métodos utilizados? Las
ventajas fueron que al realizar este método se obtuvieron las colonias que se estaban buscando
(una colonia aislada de las demás) y la desventaja fue que no se lograba distinguir entre una estria
y otra, por lo tanto hubo pequeños errores
5. ¿En qué ocasiones o circunstancias se debe emplear cada uno de los métodos anteriores?
Al estar buscando un microorganismo patógeno que dañe las plantas, o que beneficie.
Bibliografía
Bibek, R. 2009. Fundamental Food Microbiology. First Edition. Wiley-Blackwell Ed. Madigan, M.T.,
Martinko, J.M., Dunlap, P. V. y Clark, D.P. 2009. Brock Biología de los microorganismos. 12ª
edición. Editorial Pearson.
Tortora, Gerard J.Funke, Berdell y Case, C. 2007. Introducción a la Microbiología. 9ª.edición. Ed.
Panamericana Winn, W. et al. 2008. Koneman. Diagnóstico microbiológico. Texto y Atlas en color.
6a. ed. Ed. Panamericana.
Practica 4. Identificación presuntiva de bacterias por su morfología colonial y características
microscópicas

Competencia general
Realiza adecuadamente la identificación presuntiva de algunas bacterias mediante criterios
morfológicos
macroscópicos y microscópicos.
Competencias específicas
Identifica y describe correctamente las características morfológicas de las colonias bacterianas,
con base a
criterios establecidos.
Elabora preparaciones en fresco y permanentes utilizando técnicas de tinción simple, diferencial,
selectiva y
negativa.
Distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativas, así como distintas estructuras
bacterianas
manipulando adecuadamente el microscopio óptico.
Competencias transversales
Sigue instrucciones y procedimientos de manera reflexiva, comprendiendo como cada uno de
sus
pasos contribuye al alcance de un objetivo.
Desarrolla habilidades de búsqueda, procesamiento y análisis de información procedente de
fuentes diversas
y la organiza de forma oral y escrita.
Actitudes y valores
Asume compromisos con responsabilidad al colaborar en equipo de aprendizaje para la
consecución de
objetivos comunes.
Respeta el trabajo de los demás y las normas de bioseguridad del laboratorio.
Antecedentes teóricos
Cuando se cultivan las bacterias sobre medios de cultivo sólidos, las células aisladas se multiplican
sucesivamente hasta dar un crecimiento visible conocido con el nombre de colonias, las
características de estas,
tales como el tamaño, pigmentación, forma, borde, elevación, superficie, apariencia general, se
usan en la
identificación de las especies. Una de las características más importante de las bacterias, es su
morfología,
definida por el su arreglo y estructura. Existen bacterias en forma redondeada (cocos), en forma
cilíndrica
(bacilos) y en forma de espirales (espirilos) y a su vez, cada categoría se clasifica con base a
diferentes
arreglos. Las principales dificultades en la observación y estudio de los microorganismos, son su
reducido
tamaño y su transparencia a la luz visible, por tanto, la observación y estudio de su morfología y
algunas de sus
estructuras, requiere, además del microscopio, llevar a cabo preparaciones las cuales pueden
realizarse en
fresco, o bien fijas y teñidas. La preparación fresca solo se usa durante la observación y se
desecha; en tanto
que una preparación permanente dura por largos periodos de tiempo, gracias a que se utiliza, para
su montaje,
un agente como el bálsamo de Canadá, que permite que el cubreobjetos permanezca adherido al
portaobjetos.
La forma más sencilla de preparar un microorganismo para su examen microscópico, es hacer una
preparación
en fresco, la cual puede realizarse mediante una preparación en fresco simple o mediante una
preparación en
gota pendiente. Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos en su
estado
natural; el inconveniente es que no permite aumentar el contraste, por la escasa diferencia entre
los índices de
refracción del medio y de los microorganismos. Para aumentar el contraste de las células sin
afectar su
viabilidad, en las preparaciones en fresco, suele agregárseles colorantes muy diluidos como el
cristal violeta.
Otra forma de examinar un microorganismo al microscópico, es mediante una preparación fija y
teñida, que
consiste en extender la muestra sobre un portaobjetos, en una capa muy delgada que permita el
paso de la luz.
Este extendido llamado “frotis” puede hacerse suspendiendo el desarrollo microbiano en una
pequeña gota de
agua mediante el asa y distribuyéndolo en el portaobjetos; colocando en el portaobjetos una gota
de crecimiento
microbiano; utilizando hisopo o cinta adhesiva; o bien por impronta, presionando el portaobjetos
sobre
muestra. Una vez realizado el frotis, sigue el proceso de fijación, que tiene por objeto adherir la
muestra al portaobjetos y coagular el protoplasma antes de teñir la célula, desnaturalizando las
proteínas para facilitar la acción del colorante. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más
usual, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos,
alcoholes o sales metálicas. Después de la fijación le sigue el proceso de tinción que puede ser
positiva (cuando se colorea directamente a los microorganismos o a las estructuras en estudio;
utilizan colorantes) o negativa (cuando se oscurece el fondo de la preparación y se observa sólo la
silueta incolora de los microorganismos). La fijación produce el encogimiento de las células; la
tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores de lo que son realmente. Algunas
tinciones requieren la utilización de sustancias químicas denominadas mordientes, como el ácido
fénico, ácido tánico y lugol., que actúan como sustancia puente entre el colorante y la estructura a
teñir, permitiendo su coloración; en otros casos, altera su estructura celular, permitiendo su
tinción.
Los colorantes aumentan el contraste y se clasifican como naturales o sintéticos, estos últimos son
más utilizados y tienen afinidad específica por los materiales celulares. Algunos colorantes son
cationes (por ejemplo, azul de metileno, cristal violeta y safranina) que se combinan con los
constituyentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleicos. Otros colorantes son
aniones (por ejemplo, eosina, fucsina ácida y l rojo Congo) y se combinan con los constituyentes
celulares cargados positivamente como muchas proteínas. Otro grupo de colorantes son
sustancias liposolubles como el negro Sudán, que se combinan con los materiales lipídicos de la
célula. Las tinciones pueden clasificarse en simples, diferenciales y selectivas. La tinción simple es
aquella en la que sólo se utiliza un colorante de tipo básico como la safranina, cristal violeta o
azul de metileno para incrementar el contraste. La tinción diferencial es la que emplea
secuencialmente dos o más colorantes que permiten distinguir tipos de microorganismos en
función de diferencias en su estructura y composición química, por ejemplo la tinción de Gram
basada en las propiedades de la pared celular bacteriana. La tinción selectiva se utiliza para
identificar determinadas estructuras, en estas tinciones se colorea únicamente una parte de la
célula. Entre las más usadas están la tinción de esporas de Wirtz-Conklin, la de flagelos de Leifson,
la tinción negativa para cápsulas bacterianas y la tinción de núcleo de Feulgen.
Materiales
Bitácora de laboratorio
Mecheros Fisher
Cronómetro
Gradilla para tubos
Portaobjetos y cubreobjetos
Asa de siembra
Varilla para coloración
Pinzas portaobjetos
Probeta de 100 ml
Pipetas graduadas de 1 ml
Dispensadores para pipetas
Espátulas
Piseta
Frascos goteros
Aplicadores de madera
Marcador indeleble
Cubreboca y guantes de latex estériles
Algodón
Parafilm
Papel seda
Papel secante
Papel metálico
Aceite de inmersión
Bálsamo de Canadá
Alcohol etílico absoluto y de 96º
Solución de fenol al 5% o de benzal al 10%
Solución de cristal violeta
Solución de lugol
Solución alcohol-acetona (3:1)
Solución ácido-alcohol (3% HCl en alcohol 96º)
Solución safranina al 0,5%
Solución fuscina fenicada Equipo
Cámara fotográfica
Gabinete de bioseguridad
Microscopio óptico
Refrigerador
 Balanza analítica
Autoclave

Solución nigrosina al 10% o tinta china

Solución verde de malaquita al 5%
Solución de azul de metileno de Loeffler
Solución de extrán al 5%
Xilol
Agua destilada
Material biológico: cultivos en medio líquido y sólido de E. coli, Sacharomyces cerevisiae,
Bacillus subtilis, B. thuringiensis y Klebsiella sp.
Procedimiento Fundamento
Las características macroscópicas de las colonias bacterianas, pueden ser diferentes si los
microorganismos crecen en diferentes medios de cultivo.
1. Observación macroscópica del desarrollo bacteriano en un medio de cultivo agarizado
Inicie desinfectando el área de trabajo con una solución de fenol al 5% o de benzal al 10%.
A partir del cultivo bacteriano en placa de Petri, obtenido en la práctica anterior, observe y
describa las colonias.
Utilizando algunos criterios morfológicos como tales como el tamaño (grande 5 mm,
mediana 2-3 mm o pequeña 1-2 mm); aspecto (mucosa, seca, opaca, brillante o transparente) y el
color de la colonia en un medio específico.
Utilice también los criterios que se marcan en el dibujo que se muestra a continuación.

2. Observación macroscópica del crecimiento bacteriano en cultivos líquidos

A partir del cultivo en medio líquido obtenido en la práctica anterior, observe y describa el
desarrollo bacteriano utilizando los siguientes criterios:
Turbidez uniforme
Formación de película
Sedimento
3. Observación de características microscópicas Preparación en fresco
Anote en un extremo del portaobjetos, el contenido de la
preparación, la fecha y su nombre.
Tome una asada del cultivo líquido de microorganismos obtenido en la práctica anterior y
deposítela directamente sobre la superficie de un portaobjetos. Deposite suavemente un
cubreobjetos sobre la superficie de la muestra. Observe con el objetivo de menor aumento (10X) y
luego con el de mayor (40X) aumento.
Elabore esquemas de lo observado.
Preparación de frotis
Rotule el portaobjetos que utilice para hacer el frotis como en el caso anterior. Coloque
una pequeña gota de agua destilada en el centro de un portaobjetos limpio. Flamee el asa de
siembra hasta el rojo vivo, deje enfriar el asa y tome en condiciones asépticas, una pequeña
cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido, que le fue asignado y transfiéralo a la gota de
agua que se encuentra en el portaobjetos. Remueva la mezcla con el asa hasta formar una
suspensión homogénea que quede extendida en una capa muy delgada.
 Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos
primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión de
microorganismos, directamente sobre el portaobjetos.

Fijación de muestras
Una vez preparado el frotis, pase el portaobjetos de 3-5 vedes por la periferia de la llama
dejando enfriar el portaobjetos entre cada pase.
En caso de utilizar metanol (para bacterias procedentes de medio líquido), añada unas
gotas de metanol sobre la extensión completamente seca. Golpee el portaobjetos por su canto
con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el exceso de metanol. Espere a
que el metanol se evapore completamente.
Una vez realizado el frotis y haber realizado la fijación, continúe con el proceso de tinción.
3.4. Tinción de los frotis o preparaciones
Realice las diferentes tinciones siguiendo el procedimiento general para tinciones que se
muestra a continuación:

Tinción simple Fundamento

La tinción simple se basa en la utilización de un sólo colorante tal como el azul de metileno, para la
observación al microscopio.
Procedimiento
Una vez que haya preparado y fijado el frotis, colóquelo sobre la varilla de coloración y
cubra la preparación con azul de metileno durante 1 - 2 minutos. Lave la preparación con agua de
grifo para eliminar el colorante, inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su
parte superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente
sobre él, pues podría arrastrar parte del frotis consigo. Elimine

la máxima cantidad de agua de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la
superficie de la mesa de trabajo.
Seque al aire y coloque la preparación al microscopio añadiendo sobre la misma, una gota
de aceite de inmersión. Observe al microscopio con el objetivo de inmersión (100X).
Tinción diferencial de Gram Fundamento
El cristal violeta penetra la pared celular tanto de bacterias Grampositivas como Gramnegativas; el
lugol actúa como mordiente formando un complejo con el cristal violeta. Al decolorar con una
mezcla de alcohol y acetona, la pared de las Grampositivas, formada por una gruesa capa de
peptidoglucano, impide la salida del complejo cristal violeta-lugol, manteniéndose la coloración
violeta. En las Gramnegativos por el contrario, el complejo cristal violeta-lugol sale por los poros
que ha generado el alcohol-acetona en la membrana externa de la pared celular. La bacteria por lo
tanto se decolora y al agregar la safranina se tiñe de rojo.
Procedimiento
Una vez que haya preparado y fijado el frotis, colóquelo sobre la varilla de coloración y
cúbralo con cristal violeta durante 2 minutos. Retire el cristal violeta NO LAVE CON AGUA.
Añada inmediatamente lugol durante 1 minuto.
Decolore con alcohol-acetona 20 segundos.
 Escurra y tiña con safranina durante 30 segundos.
Lave con bastante agua el exceso de colorante.
Seque la preparación al aire y observe al microscopio con el objetivo de inmersión.
En el apartado de observaciones, de esta práctica, haga esquemas de lo observado y
concluya sobre lo mismo.

Tinción selectiva para esporas (Wirtz-Conklin) Fundamento

Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores
ambientales adversos, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el
microscopio óptico como estructuras refringentes. Las esporas no pierden el colorante verde de
malaquita en el lavado, en tanto que las formas vegetativas si, quedando teñidas con el
colorante de contraste.
Procedimiento
Prepare un frotis a partir de Bacillus subtilis y otro de Bacillus thuringiensis y colóquelos
sobre una varilla de coloración.
Cubra la preparación con verde de malaquita y caliente a emisión de vapores durante 1
minuto, utilizando unas pinzas y algodón humedecido con alcohol. EVITE que el colorante hierva y
que la muestra se seque, añada más colorante si este se evapora.
Lave con abundante agua el exceso de colorante. Agregue safranina como colorante de
contraste, durante 1 minuto y después de este tiempo, lave con abundante agua el exceso de
colorante.
Seque la preparación al aire y observe al microscopio con el objetivo de inmersión.
Anote la morfología y disposición de las endosporas de las dos especies de Bacillus.
En el apartado de observaciones, de esta práctica, haga esquemas de lo observado y
concluya sobre lo mismo. La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria
constituyen un carácter taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género.
Tinción negativa para observación de cápsulas Fundamento
Las partículas del colorante no pueden penetrar a la cápsula, que se observa como una zona clara
y
transparente, alrededor de la célula, que aparece refráctil sobre un fondo oscuro.
Procedimiento
Coloque una asada de nigrosina al 10% o tinta china en un portaobjetos y mezcle con una
asada del cultivo líquido de Klebsiella sp o de Sacharomyces cerevisiae
Tome un portaobjetos y con éste, distribuya suavemente la mezcla sobre toda la superficie
del portaobjetos, un hasta obtener una capa fina del material que se va a observar.
Haga la observación de la muestra con objetivo de 40X o con objetivo de inmersión,
utilizando en este caso,
una gota de aceite de inmersión.

En el apartado de observaciones, de esta práctica, haga esquemas de lo observado y

concluya sobre lo mismo.
4. Preparación de muestras permanentes
Anote en un extremo del portaobjetos, el contenido de la preparación, la fecha y su
nombre.
Realice un frotis de la muestra.
Proceda a realizar la deshidratación de la muestra utilizando una serie de concentraciones
de etanol hasta llegar al absoluto (80%, 90%, 95%, 100%). Preparare cuatro placas de Petri con su
correspondiente concentración de etanol y vaya sumergiendo la muestra entre 10 y 15 minutos en
cada una de las concentraciones, con el objetivo de que la preparación quede totalmente
deshidratada.
Seque el portaobjetos al aire y monte la preparación empleando un agente montante
como bálsamo de Canadá, medio de montaje hidrofóbico constituido por sustancias no miscibles
en el agua.
Una vez montada la muestra, coloque un cubreobjetos y observe al microscopio.
5. Recomendaciones generales
Después de observar las preparaciones, es necesario sumergir los portaobjetos en una
solución sanitizante durante 10 minutos, lavar con detergente, enjuagarlos y conservarlos en un
frasco con alcohol al 95%.
Observaciones y resultados
Se pudo observar bajo microscopio que se presentaron microrganismo gran negativos siendo el
único microorganismo negativo en las practicas realizadas en el laboratorio

Conclusiones

Se aprendio a identificar el agente etiológico responsable del proceso infeccioso y para conocer
las implicaciones patogénicas, Generalmente se reporta la morfología colonial tal como uno la
percibe, por ejemplo si se ves que las colonias bacterianas son como puntitos, pues reportan que
son puntiformes, si son lisas pues reportan que son lisas.

Seguridad e higiene
Se siguen los procedimientos de bioseguridad e higiene indicados en el reglamento interno
del Laboratorio.
Al finalizar el experimento, se realiza un proceso de limpieza de material y equipo
utilizado, siguiendo las recomendaciones generales para tal fin.
Tanto los residuos como los desechos biológicos reciben el tratamiento adecuado para
evitar contaminación.
Evaluación
La evaluación es sistemática con una planeación flexible y criterios definidos. Continua a
través de la observación de los desempeños en los aspectos puntuales relacionados con el trabajo
de laboratorio; formativa y sumativa, considerando que los desempeños logrados abonan a la
competencia general del curso.
Se centra en recabar evidencias (de conocimiento, producto, desempeño y actitud), de
los aprendizajes de los alumnos, para lograr el desarrollo de las competencias propuestas para
esta actividad.
Se evalúa el reporte de la práctica realizada, trabajo en equipo, valores y actitudes,
considerando los criterios establecidos en las rúbricas diseñadas para cada actividad.
1. ¿Qué características debe tener un colorante para ser empleado en una tinción negativa?
Que las bacterias gram negativas se tiñen de rojo (rojo, anaranjado o rosado).
Colorantes
Fucsina fenicada. Da un color rojizo a las bacterias AAR.
Azul de metileno. Da un color azulado al resto de bacterias que no son AAR.
Tinción negativa
Se usa para detectar las cápsulas que aparecen en algunas bacterias, así que entra en el grupo de
las tinciones selectivas. La tinción negativa se puede usar para el microscopio óptico o para el
microscopio electrónico.

2. ¿En qué consiste una tinción diferencial y para qué se emplea?

Son aquellas tinciones que se usan para diferenciar de manera mas explicita los microorganismos.
Estas tinciones utilizan los colorantes diferenciales, que se componen de más de una sustancia
tintórea.

3. ¿Qué sucede si a un cultivo envejecido de Bacillus sp. se le realiza una tinción de Gram?
4. un cultivo envejecido de una bacteria G+ puede fácilmente dar lugar a una reacción G-,
debido a encontrarse ya las células .en periodo de autolisis .
5. ¿Podría utilizar un colorante básico como primer colorante en la tinción de esporas?

El verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva débil) y por
tanto, se une débilmente a la bacteria. Penetra en las células vegetativa . Cuando se calienta la
preparación también penetra las endosporas

6. ¿Cómo se observarán las bacterias después de la tinción de Gram, si se olvida realizar el

paso de decoloración?
Las bacterias que resisten la decoloración (BAAR) aparecerán teñidas de color rosa,
completamente saturadas con la fucsina
7. ¿Qué sucederá si no se calienta el colorante en la tinción de esporas?
Solo se puede teñir el contenido de la espora alterando su envuelta.

8. ¿La disposición de las endosporas en las dos especies de Bacillus, es la misma?

Las endósporas son formas de supervivencia de ciertas bacterias, constituidas por células
durmientes deshidratadas y recubiertas por capas protectoras, que muestran una resistencia
extrema al estrés físico y químico. Son capaces de perdurar por tiempo indefinido en ausencia de
nutrientes. Se forman en el interior de las bacterias.
9. ¿Qué importancia tiene la presencia de la cápsula en las bacterias?
Protegen a las bacterias de la fagocitosis
Participa en la adherencia bacteriana
Protegen a la bacteria frente a distintos agentes nocivos
Protege a las bacterias frente a la desecación

Bibliografía
Harvey R. A.; Champe, Pamela C. y Fischer, Bruce D. 2008. Microbiología. Liippincott Williams &
Wilkins Wolters Kluwer Health. Agapea.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P. V. y Clark, D.P. 2009. Brock Biología de los
microorganismos.
12ª edición. Editorial Pearson.
Tortora, Gerard J. Funke, Berdell y Case, C.L. 2007.Introducción a la Microbiología. 9ª ed.Editorial
Panamericana

Practica 5. Conservación de sepas

Competencia general
Realiza la preservación de cepas microbianas utilizando técnicas a corto plazo y desarrolla una
colección de cepas en el laboratorio.

Competencias específicas
 Conserva cepas puras utilizando las técnicas de desecación, aceite mineral y suspensión
en agua estéril.
 Argumenta, con base a la experimentación, las ventajas y desventajas de cada una de las
técnicas utilizadas en la conservación de cepas.
Competencias transversales
 Construye nuevas conceptualizaciones a partir de evidencias científicas.
 Argumenta ideas de forma oral y escrita.
Actitudes y valores
 Asume una actitud constructiva, congruente con los conocimientos y habilidades con los
que cuenta. Aporta puntos de vista con apertura y considera los de otras personas de
manera reflexiva.

Antecedentes teóricos

En Microbiología, el concepto de cepa se refiere al conjunto de microorganismos, como bacterias,

hongos... que comparten el mismo acervo genético. Una cepa se deriva de un único
microorganismo aislado en cultivo, y la cepa de referencia de una especie, representa un ejemplo
invariable de la especie en cuestión y es parte de una colección de cultivos (por ejemplo ATCC). En
el laboratorio de Microbiología es fundamental el mantenimiento y conservación de cepas
microbianas, puesto que constituyen el objeto material de trabajo. Por tan, un buen método de
conservación ha de garantizar la pureza, supervivencia de al menos el 70 % de las células y su
estabilidad genética. Existen varios métodos para la conservación de microorganismos, agrupados
en 3 categorías de acuerdo al tiempo de su viabilidad: métodos de conservación a largo, mediano
y corto plazo. Sin embargo, la Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC, siglas en
inglés), establece que por seguridad, cada cepa debe ser mantenida por al menos 2
procedimientos diferentes.
La congelación (a –70 °C y –196 °C) y la liofilización son técnicas de conservación a largo plazo,
minimizan al máximo el riesgo de cambio genético en las células y las mantienen viables hasta por
25 años. Durante la congelación, al bajar la temperatura se reduce el metabolismo drásticamente,
hasta el caso de anularlo con nitrógeno líquido (-196°C). La liofilización es el método más utilizado
por las colecciones internacionales de cultivos tipo, y consiste en congelar una suspensión de
microorganismos y eliminar el agua como vapor de agua directamente del hielo, sin pasar por el
estado líquido, combinando técnicas de congelación y deshidratación. A mediano plazo, es el
término que agrupa las técnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los cultivos entre 2
y 5 años. Se destaca en este grupo la desecación en diferentes soportes (papel filtro, arena,
suelo...), esterilizados por calor seco. La desecación se basa en la paralización del crecimiento por
eliminación del agua disponible para las células, lo que reduce drásticamente el metabolismo. El
subcultivo seriado es una técnica que permite la supervivencia de los cultivos en cortos períodos
de tiempo (semana - 15 días), lo que incrementa el riesgo de contaminación y de cambios
genéticos. Consiste en resembrar el microorganismo en un medio adecuado; se utiliza agar
inclinado para evitar la desecación rápida del medio, además, en medio sólido se detectan mejor
los contaminantes, que en medio líquido.
Una técnica de preservación resulta más efectiva para un grupo microbiano que para otro, no
existe una técnica universal para conservar adecuadamente todos los microorganismos. Así, los
hongos pueden conservarse por desecación en suelo; las bacterias se conservan mejor por
liofilización, pero se pueden utilizar prácticamente todos los métodos; los virus con nitrógeno
líquido; las algas y cianobacterias en subcultivo seriado. En el caso de bacterias y hongos
filamentosos de espora pequeña, la temperatura de almacenamiento recomendada es de 18°C; las
levaduras y hongos filamentosos de espora grande, se almacenan a 5°C en un cepario, lugar
aséptico y específico, donde se almacena todo tipo de cepas puras con fines de investigación y
enseñanza. Para ello,
pueden ser utilizados refrigeradores mecánicos (-60oC), refrigeradores de nitrógeno líquido (-
196oC) y cuartosos (5oC). Existen las colecciones de cultivos tipo, dedicadas a almacenar,
mantener y comercializar cepas a nivel mundial como la ATCC (USA), Kral (Praga), Lobaina
(Belgica)...
Materiales
 Bitácora de laboratorio
 Mecheros Fisher
 Cronómetro
 Espátulas
 Asa de siembra
 Placas de Petri estériles
 Tubos de cultivo
 Gradilla para tubos
 Matraz Erlenmeyer de 100, 250l y de 500 ml
 Probeta de 100 ml
 Pipetas graduadas de 1,0ml
 Dispensadores para pipetas
 Micropipetas de 0.1 – 5.0 ml
 Puntillas estériles para micropipetas 0.1 – 5.0 ml
 Vasos de precipitado de 100, 250 y 500 ml
 Piseta
 Guantes de asbesto
 Guantes de latex estériles
 Cubreboca
 Marcador indeleble
 Algodón
 Gasa
 Papel filtro
 Papel metálico
 Papel secante
 Parafilm
 Cinta masking con indicador de esterilidad
 Carbonató de calcio
 Arena tamizada
 Tierra tamizada
 Vaselina líquida estéril
 Solución de fenol al 5% o benzal al 10%
 Agua destilada
 Cultivospurosentuboinclinado.

Equipo
 Cámara fotográfica
 Gabinete de bioseguridad
 Refrigerador
 Horno Pasteur de aire caliente
 Incubadora con termómetro
  Baño María
 Autoclave
 Balanza analítica

Procedimiento

1. Preservación por desecación

 Limpie la zona de trabajo con una solución de fenol al 5% o de benzal al 10%.
 Tome un tubo de cultivo y agregue 0,1 g de arena tamizada, 0,1 g de tierra tamizada y 0,1
g de carbonato de
calcio, coloque la tapa al tubo sin apretar mucho. Coloque el tubo en un vaso de precipitado, cubra
con papel
metálico y esterilice en autoclave. Saque el material utilizando guantes de asbesto y deje enfriar.
 Trabajando al mechero o en gabinete de bioseguridad, haga una suspensión de
microorganismos de la siguiente manera: agregue agua destilada estéril a un tubo
inclinado conteniendo un cultivo puro (de los que
se obtuvieron en la práctica anterior) y agite para obtener la suspensión.
 Agregue 0,1 ml de la suspensión al tubo que contiene la arena, tierra y carbonato estéril.
 Rotule con el nombre del microorganismo, la fecha y medio en el que fue preservado.
 Guarde el cultivo entre 2oC – 8oC, con la finalidad de iniciar la colección de cepas en el
laboratorio (cepario).
2. Preservación en aceite mineral
 En condiciones asépticas tome el tubo que contiene el cultivo puro y agregue la vaselina
líquida estéril, hasta el pico del tubo.
 Rotule el tubo con el nombre de microorganismo, la fecha y el medio en el que fue
preservado. Guarde el cultivo en refrigeración entre 2oC – 8oC y sume el cultivo a la
colección.
3. Preservación en agua destilada
 En condiciones asépticas, haga una suspensión de
microorganismos
siguiendo las instrucciones
anteriormente descritas en el punto no. 1.
 Deposite 0,1 ml de la suspensión en un tubo de cultivo estéril.
 Rotule el tubo con el nombre de microorganismo, la fecha y el medio en el que fue
preservado.
 Guarde el cultivo en refrigeración entre 2oC – 8oC y sume el cultivo a la colección.

Observaciones y resultados
Conclusiones
En esta ´practica se logro aprender la conservación de cepas a partir de un método económico y
Saber que el cultivo que se conservo sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones
durante el proceso de conservación; que durante el tiempo de conserva- ción sobrevivan al menos
el 70-80% de las células,

Seguridad e higiene
 Se siguen los procedimientos de bioseguridad e higiene indicados en el reglamento
interno del Laboratorio. Al finalizar el experimento, se realiza un proceso de limpieza de
material y equipo utilizado, siguiendo las
recomendaciones generales para tal fin.
 Tanto los residuos como los desechos biológicos reciben el tratamiento adecuado para
evitar contaminación.
Evaluación
 La evaluación es sistemática con una planeación flexible y criterios definidos. Continua a
través de la observación de los desempeños en los aspectos puntuales relacionados con el
trabajo de laboratorio; formativa y sumativa, los desempeños logrados abonan a la
competencia general del curso.
 Se centra en recabar evidencias (de conocimiento, producto, desempeño y actitud), de los
aprendizajes de los alumnos, para lograr el desarrollo de las competencias propuestas
para esta actividad.
Se evalúa el reporte del experimento, valores y actitudes, considerando los criterios establecidos
en las rúbricas diseñadas para cada actividad. Además del siguiente cuestionario:
 1. ¿Qué tipo de métodos se utilizaron en esta práctica para la conservación de cepas?
Desencacion, aceite mineral y suspensión en agua estéril
2. ¿Por cuánto tiempo considera que se podrán conservarse las cepas que ha preservado?
De 7 a 25 días
3. ¿Cuáles son las características de debe reunir una cepa preservada?
4. Después de días aún tendrá bacterias y se podrá regenerar
4. ¿Qué porcentaje de supervivencia de microorganismos debe garantizar cualquier método
de preservación?
Al menos un 70%
5. Mencione las ventajas y desventajas de los métodos utilizados para la conservación de
cepas.
Las ventajas es que es un procedimiento de un bajo costo que toda persona puede realizar
con cosas que son fáciles de adquirir pero una desventaja es que cada 25 días tienes que
estar volviendo a hacer el procedimiento ya que no es 100% efectivo y preserva mucho
tiempo los microorganismos.