Química Biológica II

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TRABAJO PRÁCTICO DE LABORATORIO: MUCOPOLISACÁRIDOS

CONCEPTOS TEÓRICOS:
Los glicosaminoglicanos (GAGs) son los heteropolisacáridos más abundantes de nuestro organismo, y aquellos de
importancia fisiológica son: ácido hialurónico, dermatán sulfato, condroitín sulfato, heparina, heparán sulfato y
queratán sulfato I y II.

Un GAG es un polisacárido no ramificado, cargado negativamente y constituido por secuencias repetidas de

disacáridos. Uno de los componentes siempre será un aminoazúcar modificado, como N-acetilgalactosamina
(GaINAc) ó N-acetilglucosamina (GlcNAc) y el otro componente de la secuencia repetida es un ácido urónico, que
puede ser el ácido L-glucurónico (GluUA) o su 5´epímero, el ácido L-idurónico (IdUA). Con excepción del ácido
hialurónico, todos los GAGs poseen grupos sulfato, como O-ésteres o como N-sulfatos (en la heparina y heparán
sulfato).

Los PROTEOGLUCANOS son proteínas que poseen GAGs

unidos en forma covalente. La cantidad de carbohidratos de
un proteoglicano es, por lo común, mucho mayor que la
encontrada en una glucoproteína, y puede comprender
hasta el 95% de su peso. Las proteínas que se unen a los
GAGs son llamadas “proteínas centrales”. Los GAGs se
extienden perpendicularmente desde el centro como una
estructura tipo cepillo.

La unión de los GAGs a la proteína central involucra un trisacárido específico compuesto de dos residuos de
galactosa y un residuo de xilosa (GAG–GalGalXyl–O–CH2– proteina).El trisacárido de unión está acoplado a la
proteína central a través de una unión O-glicosídica a un residuo serina en la proteína. Las proteínas centrales de
los proteoglicanos son ricas en residuos S y T lo cual permite la adhesión de múltiples GAG.
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Estructuralmente, los GAGs son moléculas con una conformación extendida que brinda alta viscosidad a las
soluciones que los contienen. Los GAGs están principalmente ubicados en la superficie de las células o en la matriz
extracelular (MEC). Junto con la viscosidad que brindan, también confieren una compresibilidad baja lo cual hace
que estas moléculas sean ideales como líquido lubricante de las articulaciones. Al mismo tiempo, su rigidez brinda
integridad estructural y provee vías entre las células, permitiendo la migración celular.

El hialurónico es único entre los GAGs ya que no contiene ningún grupo sulfato y no se encuentra unido de manera
covalente a ninguna proteína como proteoglicano. Sin embargo, sí es parte de los complejos que se forman de
manera no covalente con proteoglicanos en la MEC. Los polímeros de ácido hialurónico son de gran tamaño (con
pesos moleculares entre 100.000–10.000.000 Da) y pueden desplazar un gran volumen de agua. Esta propiedad
les permite actuar como lubricantes y absorbentes de golpes.

Los siete GAGs antes mencionados difieren entre sí en cuanto a las características siguientes: composición del
aminoazúcar; vomposición del ácido urónico; enlaces entre estos componentes; longitud de la cadena de
disacáridos; presencia o ausencia de grupos sulfato y sus posiciones de fijación a los azúcares constituyentes;
naturaleza de las proteínas centrales a las cuales se fijan, distribución tisular, y funciones biológicas.

ÁCIDO HIALURÓNICO: Compuestos de D-glucoronato +

GlcNAc unión tipo β (1, 3). Presente en bacterias y
distribuído de forma extensa en muchos animales y tejidos,
incluyendo el líquido sinovial, humor vítreo de los ojos,
cartílago y tejido conectivo laxo.
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DERMATÁN SULFATO : Compuestos de un ácido ur ónico

(puede ser L-idurónico sulfatado o no, o ácido
glucurónico) + GalNAc-4-sulfato en unión α (1, 3). El ácido
urónico Se lo encuentra en piel, vasos sanguíneos,
válvulas caríiacas.

CONDROITÍN 4 – Y 6 –SULFATO: Compuesto de

D-glucuronato y GalNAc -4- o 6 -sulfato unión tipo
β (1, 3) (la figura contiene GalNAc 4 -sulfato). Los
proteoglicanos unidos al condroit ín sulfato
mediante el enlace Xil-Ser O -glucosídico, son
componentes fundamentales del cartílago.

En las unidades repetitivas del condroitín -4-sulfato y del dermatán -4-sulfato se alternan las unidades
glucosídicas 1---3 con las 1---4.

HEPARINA: Compuesto de iduronato-2-sulfato (o D-glucuronato-

2-sulfato) y N-sulfo-Dglucosamina-6-sulfato
unión tipo α (1, 4). Aproximadamente 90% de los
residuos de ácido urónico son IdUA. La proteína de la heparina
es única, puesto que está compuesta por residuos de serina y
glicina exclusivamente. La heparina se encuentra en los gránulos
de los mastocitos y también en hígado pulmón y piel.

HEPARÁN SULFATO: Posee GluN con muy pocos N-sulfatos a comparación de la heparina, y a diferencia de la
heparina el heparán tiene como ácido urónico predominante al GluUA. Presente en la superficie extracelular,
componente de membranas basales.
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QUERATÁN SULFATO: Compuestos de galactosa +

GlcNAc-6-sulfato unión tipo β (1, 4). El queratán sulfato
está formado por residuos de galactosa sulfatados o no
que se alternan con glucosamina.

Los GAGs (antes llamados mucopolisacáridos) son degradados en varias etapas por enzimas lisosomales
específicas y, si existe algún bloqueo en alguno de los pasos de la vía de degradación los mucopolisacáridos se
acumularán en los lisosomas y aumentará la excreción urinaria de mucopolisacáridos parcialmente degradados.

MUCOPOLISACARIDOSIS:

Son enfermedades monogénicas, de curso crónico y progresivo. La herencia es autosómica recesiva, con excepción
de la MPS II que se hereda ligada al cromosoma X. La incidencia conjunta mundial es de 1/10.000 a 1/25.000 recién
nacidos vivos.

De una manera general, la degradación de los GAG en los lisosomas es iniciada por endoglicosidasas como la
hialuronidasa, que rompe las cadenas largas de polisacáridos en uniones menores. Luego que ocurre esta
“degradación limitada”, los fragmentos son nuevamente degradados por hidrólisis secuenciales en las en las
terminaciones no reductoras. Esta segunda etapa es realizada por hidrolasas lisosómicas específicas para cada
tipo de unión que debe ser degradada. La ausencia de cualquiera de las enzimas comprometidas en este proceso
lleva a la acumulación intralisosomal de moléculas de glicosaminoglicanos parcialmente degradadas, haciendo
que los lisosomas (repletos de GAG) se acumulen en la célula e interfieran con el funcionamiento celular normal.

Las MUCOPOLISACARIDOSIS (MPS) comprenden un amplio espectro de enfermedades producidas por déficit de
una de las enzimas que degrada las tres clases de mucopolisacáridos: heparán sulfato (componente de células del
sistema nervioso, lo que lleva a síntomas predominantemente neurológicos, retraso mental, ceguera, sordera), el
queratán sulfato (componente de córnea y cartílagos, lo que lleva a opacidad corneales y deformidades
esqueléticas) y dermatán sulfato (componente de tejido conjuntivo de miocardio y válvulas , lo que lleva a
valvulopatías y cardiomiopatías).
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Las manifestaciones clínicas son en general de compromiso multisistémico, principalmente:

• Sistema esquelético: disostosis (deformaciones) múltiples.

• Sistema respiratorio: infecciones respiratorias recurrentes.
• Piel y faneras: engrosamiento de piel y mucosas, hirsutismo.
• Hepatoesplenomegalia, hernias umbilicales, inguinales.
• Aumento de tamaño de cerebro y engrosamiento de meninges.
• Talla baja de inicio pos-natal.
• Circunferencia craneana aumentada (hidrocefalia).
• Facies sindromática (gargolismo): aspecto tosco, abombamiento frontal, cabello y cejas gruesas, puente
nasal bajo, lengua protuyente, voz ronca y gruesa.

• Compromiso ocular: opacidad corneal.

• Cardiopatías: alteraciones en válvula mitral y aórtica aunque existen alteraciones específicas para cada
MPS.

• Compromiso articular, manos en garra.

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La causa de muerte más frecuente es una enfermedad obstructiva de vías aéreas o insuficiencia cardíaca.

Clasificación:

1) Enfermedad de Hurler: o MPS I, es el prototipo de MPS. El defecto bioquímico consiste en un déficit de

alfa-iduronidasa, con acumulación de heparán sulfato y dermatán sulfato. Prácticamente todos los
elementos del fenotipo están presentes y se hallan en grado variable. La muerte ocurre en el primer
decenio de la vida. Síntomas: nublamiento de la córnea, distosis múltiple, organomegalia, enfermedades
cardiacas, enanismo, retraso mental, mortalidad temprana

2) Sindrome de Scheie: o MPS IS. Se caracteriza clínicamente por su inicio en la infancia y la supervivencia
hasta la edad adulta. Este trastorno es consecuencia del déficit de alfa-iduronidasa. Síntomas:
nublamiento de la cornea; enfermedad de la válvula aórtica, endurecimiento de las articulaciones;
inteligencia y esperanza de vida normales

3) Sindrome de Hunter: o MPS II . Consecuencia del déficit de L-iduronato-2-sulfatasa. Se diferencia de

Hurler I por la ausencia de opacidad corneal y por ser de herencia ligada al cromosoma X. La forma infantil
parece al fenotipo de Hurler y existe una forma más leve que permite la supervivencia hasta la vida adulta.
Síntomas: distosis múltiple, organomegalia, deformaciones faciales y física, retraso mental.

4) Mucopolisacaridosis Sanfilippo: o MPS III, A, B, C y D. se diferencian por la acumulación de heparán sulfato

exclusivamente, pero no de dermatán ni queratán sulfato, y por la afectación considerable del sistema
nervioso central. Las mucopolisacaridosis de Sanfilippo suelen diagnosticarse durante el estudio del
retraso mental infantil. Como los rasgos somáticos de esta enfermedad son discretos, el diagnóstico puede
ser omitido al evaluar un problema aislado del sistema nervioso central. La muerte suele ocurrir durante
el segundo o tercer decenio de la vida.Síntomas: Detorioro mental profundo, hiperactividad, piel, cerebro,
pulmones, corazón y músculo esquelético están afectados en los 4 tipos de MPS-III.

5) Sindrome de Morquio: o MPS IV. Se distingue por la ausencia de retraso mental y la presencia de distrofia
ósea. El déficit de galactosa-6-sulfatasa es la base de la enfermedad.

6) Trastorno de Maroteaux-Lamy: o MPS VI. Es consecuencia del déficit de N-acetilgalactosamina-

4sulfatasa, y acumulación de dermatán sulfato. Existen 3 formas distintas que van desde moderadas a
severas, con enfermedad de la válvula aórtica, distosis múltiple, inteligencia normal, anublamiento de la
córnea, rasgos faciales ásperos

Diagnóstico:

Los pacientes con MPS acumulan GAG, los excretan en orina y se puede establecer el diagnóstico, identificando
su aumento.

En la mayoría de las mucopolisacaridosis, la mucopolisacariduria es también un marcador que puede ser detectado
por procedimientos de pesquisa semicuantitativa, basados en la turbidez de la orina o visualizando las manchas
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metacromáticas en papel impregnado con colorante (azul de toluidina). Este examen es rápido, barato y útil para
una evaluación inicial de laboratorio del paciente, pero puede arrojar falsos positivos o falsos negativos.

En una segunda etapa se puede utilizar exámenes cuantitativos más precisos para confirmar la presencia de
mucopolisacariduria. La cromatografía en capa fina o electroforesis uni o bi direccional son exámenes cualitativos
que detectan el tipo de GAG y permiten dirigir la confirmación con el estudio enzimático preciso. El diagnóstico
definitivo se establece cuando se demuestra la deficiencia enzimática en plasma, leucocitos o en fibroblastos.

Debido a la falta de síntomas clínicos en los primeros meses de vida, es difícil la sospecha diagnóstica de una de
estas patologías a esa edad. Además, la excreción de glucosaminoglucanos está aumentada en el periodo neonatal
(pacientes normales) y puede ser confundida con la observada en un paciente con MPS. La MPS tipo III puede no
ser detectada en el examen de azul de toluidina porque los GAG se presentan en forma de pequeños fragmentos
de heparan sulfato. Esto se debe a la presencia de endoglicosilasas en muchos tejidos, que fijan el heparan sulfato.

Figura. Cromatografía de GAG: Hs maior mobilidade (HS de mayor movilidad) patrón sugerente de una MPS tipo
III; DS + HS patrón sugerente de una MPS tipo I, II, IV o VII; QS patrón sugerente de una MPS tipo IV y C4S + C6S
patrón normal.
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Cuando existe una sospecha clínica es importante realizar estudios no sólo con pruebas de pesquisa, también con
exámenes más específicos, como análisis cuantitativos (ensayos colorimétricos), y cualitativos cromatografía en
capa fina o electroforesis), de GAG urinarios.

A continuación, se debe realizar la determinación de actividad enzimática, utilizando plasma, leucocitos, o cultivo
de fibroblastos. Este examen es importante no sólo para confirmación del diagnóstico, sino también para detectar
portadores y para el diagnóstico prenatal.

PRUEBAS CUANTITATIVAS DE SCREENING PARA MUCOPOLISACÁRIDOS

La medición de los mucopolisacáridos urinarios ha sido empleada extensamente para el diagnóstico de las
enfermedades por depósito de mucopolisacáridos. Las técnicas empleadas para su medición están basadas en las
propiedades físicas y químicas de los polianiones.

Éstos son precipitados por soluciones de sales de amonio cuaternario como bromuro de cetilpiridinio
(denominados también bromuro de hexadeciltrimetilamonio y cloruro de cloruro de hexadecilpiridinio) o
retenidos y posteriormente eluídos en forma selectiva por resinas de intercambio aniónico. El ácido urónico es
medido en el precipitado o efluentes de las columnas mediante diferentes reacciones.

Además, el contenido total de mucopolisacáridos puede ser determinado usando una técnica basada en la
formación de complejos insolubles de mucopolisacáridos ácidos con un colorante catiónico.
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El primer paso para el reconocimiento de un aumento en la secreción de mucopolisacáridos es una prueba

discriminatoria sencilla. Estas pruebas están basadas en la interacción de mucopolisacáridos con albúmina
acidificada, sales de amonio cuaternario o diversos colorantes.

Una prueba discriminatoria debe detectar la excreción anormal de mucopolisacárido sin dar resultados negativos
falsos y con un mínimo de resultados positivos falsos.

Dorfman describió una prueba discriminatoria en la cual la turbidez producida cuando la orina se mezclaba con
una solución de albúmina bovina al 20% a pH ácido era proporcional a la cantidad de mucopolisacárido presente.
La prueba era positiva para cerca de 100 mg/L de mucopolisacárido.

Berry y Spinanger introdujeron una prueba basada en la metacromasia producida cuando la orina desecada sobre
papel de filtro se teñía con azul de metileno. Luego de eliminar el exceso de colorante, las muestras con alto
contenido de mucopolisacáridos (más de 100 mg/L) aparecían de color púrpura, mientras que aquellas con
concentraciones menores eran de color azul claro.

Se han descripto pruebas discriminatorias basadas en la turbidez o precipitado floculento que resulta del complejo
macromolecular formado entre las sales de amonio cuaternario y los mucopolisacáridos. Un buffer de citrato
estabiliza el complejo de las sales de amonio cuaternario con los mucopolisacáridos en solución, de modo que es
posible medir la turbidez en un espectrofotómetro registrando la absorbancia a 680 nm.

Todas las pruebas discriminatorias han sido ampliamente utilizadas para la detección de desórdenes de los
mucopolisacáridos. La PRUEBA AL TOQUE CON AZUL DE TOLUIDINA tiene la ventaja de la simplicidad y
confiabilidad junto con una frecuencia baja de resultados negativos falsos en pacientes con mucopolisacaridosis.

Cuando se encuentra un resultado positivo, la muestra debe ser sometida a una prueba cualitativa para identificar
la especie molecular presente y a una determinación cuantitativa para determinar la cantidad de
mucopolisacáridos. Sin embargo, las pruebas discriminatorias negativas no descartan necesariamente la presencia
de un trastorno de los mucopolisacáridos en los pacientes que presentan síntomas sugestivos. En estos casos
deben realizarse pruebas cualitativas y cuantitativas.

Para las pruebas discriminatorias puede emplearse una muestra de orina al azar o de 24 horas. Si la orina es muy
diluída, con una densidad inferior a 1.005 o una concentración de creatinina menor de 0.20 g/L, la prueba
discriminatoria puede no ser válida. Cuando se ha confirmado la excreción elevada de mucopolisacáridos y se los
ha identificado, la observación debe ser confirmada sobre otra muestra del paciente, para lo cual es conveniente
una muestra de 24 horas. Las muestras deben ser conservadas congeladas o refrigeradas.

En una segunda etapa se pueden utilizar pruebas cuantitativas más específicas. La cromatografía en capa fina o
electroforesis en acetato de celulosa se usan para identificar el tipo de MPS acumulado y permite dirigir el estudio
enzimático que demuestra la falla metabólica en plasma, leucocitos o cultivo de fibroblastos cutáneos.
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PARTE PRÁCTICA

MÉTODO DISCRIMINATORIO MEDIANTE PRUEBA AL TOQUE CON TOLUIDINA

La prueba al toque (en papel) de Berry es una de las pruebas discriminatorias más usadas. Está basada en el efecto
metacromático observado cuando los grupos acídicos de la molécula del polisacárido atraen los grupos polares
del colorante y permiten su polimerización que se refleja en un desplazamiento de su espectro de absorción.

MATERIALES Y REACTIVOS
 Capilares de vidrio
 Pipetas automaticas 20-200 µL
 Cajas de Petri descartables
 Pinzas, Tijeras
 Pipetas de vidrio 5 ml y 10 ml
 Secadores de cabello
 Cronómetros
 Papel de filtro Whatman N°1

1. Azul de Toluidina: 0,4 mmol/l. disolver con agitación 1,22 g de azul de O- toluidina en 800 ml de
acetona, diluir a 1 L con agua. Estable indefinidamente a T° ambiente.
2. Ácido Acético: 1,8 mmol/l. Diluir 100 ml de ácido acético glacial (densidad 1,06) a 1 litro. Estable
a T° ambiente durante 6 meses.
3. Solución estándar de condroitín sulfato 100 mg/l. disolver 10 mg del estándar hasta un volumen
final de 100 ml de ClNa 3 M. Estable durante 6 meses a 4°C.

- En una zona marcada de papel de filtro N°1 se aplica un volumen total de 50 µL de orina en alícuotas de 5
µL, dejando secar entre uno y otro agregado. Aplicar de igual modo el mismo volumen de la solución
estándar de condroitín sulfato en el papel.
- Teñir la tira de papel con azul de toluidina durante 2 minutos y dejar secar.
- Eliminar el exceso de colorante lavando el papel con 3 cambios de 5 minutos de ácido acético 1,8 M
seguidos por un lavado de 5 minutos de agua destilada.

Las reacciones positivas tienen un color púrpura contra un fondo azul claro. Las muestras se consideran positivas si
la reacción indica concentración de mucopolisacáridos en orina mayor o igual a 100 mg/L.

Los valores para la excreción de mucopolisacáridos en pacientes con alguna de las MPS hereditarias varían
considerablemente, pero en general son 5 a 20 veces mayores que lo normal.