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Elaboración de Micelio Semilla de

Hongos Comestibles y Medicinales

III Módulo 3:

Multiplicación del micelio

Contenido

1. INTRODUCCION ................................................................................................ 2

2. OBTENCIÓN DE INOCULO PRIMARIO............................................................. 2

a) Materiales necesarios....................................................................................... 2

b) Preparación del sustrato y esterilización ....................................................... 3

c) Multiplicación del micelio ................................................................................ 7

d) Control de calidad........................................................................................... 11

3. OBTENCIÓN DEL INOCULO SECUNDARIO ................................................... 12

a) Materiales necesarios..................................................................................... 12

b) Procedimiento ................................................................................................ 12

4. VIABILIDAD DE LA CEPA. TECNICAS DE CONSERVACION ......................... 14

5. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................ 17

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1. INTRODUCCION

Aprendimos a elaborar micelio a partir de una esporada o de un trozo de himenio, en

placas de petri o tubos de ensayo, con técnicas de cultivo específicas sea sobre medio de cultivo
solido o líquido. A ese micelio lo denominamos micelio madre.
Por su fortaleza fisiológica, este tipo de micelio sirve para la producción vegetativa, es
decir, para multiplicarlo o clonarlo usando como sustrato semillas o granos de cereal, de calidad
óptima, como: sorgo, trigo, centeno, maíz, mijo, etc.
Este micelio propagado sobre granos de cereal a partir de micelio madre es lo que se
conoce como inoculo o micelio primario.
El inóculo o micelio secundario se obtiene a partir del inóculo primario recién clonado.
Simplemente se inoculan trozos de agar, con la cepa proveniente del talo, sobre la semilla
estéril. El micelio 2° se conoce como spawn.

2. OBTENCIÓN DE INOCULO PRIMARIO

a) Materiales necesarios

Micelio madre en placas de petri o tubos de ensayo

Granos de cereales
Frascos de vidrio con tapa metálica y rosca
Autoclave u olla de presión
Estufa
Balanza
Mechero de alcohol
Encendedor
Bisturí/ Ansa

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Agua destilada
Guata
Papel aluminio
Etiquetas
Marcador indeleble
Taladro o alicate

b) Preparación del sustrato y esterilización

 Preparar los frascos con filtros

A medida que crece, el micelio produce CO2 (tóxico) y consume O2. Por eso, necesitamos
frascos de vidrio con filtros que garanticen el apropiado intercambio de gases para que el
micelio pueda “respirar”.

Los frascos con filtro de aire son un factor importante que puede determinar
el éxito o el fracaso de un intento de crecimiento.

El Polyfill o guata es una fibra de polyester sintética que sirve para rellenar almohadas,
muñecos para niños o ropa térmica, entre otros. Este material es ideal para preparar los frascos
con filtro de aire.
Contiene un ingrediente activo que previene la acumulación de ácaros y bacterias y
resiste altas temperaturas, por lo que se convierte en un material ideal para nuestros objetivos.

Guata o Polyfill

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Para poder utilizar esta fibra y fabricar los frascos con filtro de aire seguimos estos
pasos:
a) Colocar la tapa sobre una superficie plana, boca arriba.

b) Con la ayuda de un taladro, abrir un orificio en la tapa de aproximadamente ¾ a 1” (2,5

cm)
c) Tomar un poco de fibra de polyester e introducirla en el orificio hecho previamente.

d) Cerrar el frasco.

Ya que tenemos los frascos listos. Avanzamos con el paso siguiente: esterilizarlos con el
sustrato, en este caso semillas de trigo. Pintar la tapa con pintura alta temperatura para evitar
la aparición de óxido.

Imágenes: http://pleurotus.unpocodetodo.info/inoculo/preparar-los-tarros-de-vidrio/19

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 Limpieza e hidratado de los granos

Para hidratar el grano y limpiarlo de todas las impurezas indeseables seguir estos pasos:
a) Colocar el grano bajo agua tibia dentro de un colador, removiendo constantemente.

b) Pasarlo a una olla y cubrirlo con 3 cm de agua.

c) Retirar las impurezas que queden flotando en la superficie del agua con una espumadera.

d) Si está muy sucio, llevar nuevamente al colador y lavar otra vez.

e) Pasar por segunda vez a la olla, cubriendo con 3 cm de agua.

f) Tapar y dejar reposar por 12 horas. Ciertas bacterias son bastante resistentes al calor, lo
que significa que pueden no morir en la esterilización en olla a presión. Entonces,
remojando el grano germinamos estas bacterias que se vuelven más vulnerables al calor y
serán en el proceso que sigue.
g) Pasado el tiempo, lavar nuevamente los granos en el colador, removiendo
constantemente.
h) Pasarlo a una olla para calentarlo a fuego lento.

i) Apenas comience a salir vapor, dejar esa temperatura por unos 20 minutos. Remover
constantemente para evitar que se revienten granos del fondo. Los granos tienen que
quedar enteros, por ello no deben hervirse mucho porque explotan.
j) Retirar los granos de la olla, limpiar nuevamente y dejar reposar por 20 minutos, en el
colador.

Remojando granos de avena – Foto: https://www.pictosee.com/p/2269997050532149749

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 Llenado de los frascos y esterilización

Una vez hidratados los granos, llenamos los frascos para su posterior esterilización
siguiendo estos pasos:
a) Llenar los frascos con los granos de trigo, limpios e hidratados, hasta la mitad de su
capacidad.
b) Sujetar el filtro de los frascos con cinta, cerrar flojamente y cubrir con papel aluminio.

c) Agregar agua a la olla de presión hasta la altura de la rejilla metálica y calentar.

d) Cuando el agua hierva, colocar los frascos dentro de la olla y tapar sin cerrar la válvula de
seguridad.
e) Cuando comience a salir vapor, colocar el tapón de seguridad y esperar el tiempo de
esterilización apropiado (20 minutos a 1 atm. de presión).
f) Pasado el tiempo de esterilización, apagar el fuego y esperar a que baje la presión y baje
la temperatura en la olla para poder abrir.
g) Al abrir la olla, cerrar bien los frascos y agitar fuertemente para que se distribuya bien el
contenido de agua.
h) Dejar enfriar a temperatura ambiente en un lugar limpio, un mínimo de 12 horas.

Esterilización de frascos con granos – Foto: https://www.pictosee.com/p/2266409009233701586

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c) Multiplicación del micelio

Una vez preparado y esterilizado el sustrato, colocado en sus respectivos frascos, lo que
queda es aislar el micelio madre en éstos, para clonarlo o multiplicarlo obteniendo así el
inoculo primario.

Recuerden asegurarse de mantener todo el ambiente limpio y desinfectado.

La más mínima falta de higiene repercutirá negativamente en los resultados.
Si van a usar una campana de flujo laminar es indispensable realizar todo el proceso de
desinfección previo, incluso prender la lámpara de luz UV antes de utilizarla.
Para multiplicar una cepa de hongo (crecida sobre una placa de petri en medio sólido)
dentro de frascos con cereal estéril y obtener así inoculo primario, seguimos estos pasos:
a) Debajo de la campana de flujo laminar, flamear la
punta del bisturí con el mechero, calentándolo al
rojo vivo, y dejar enfriar unos segundos.
b) Abrir la placa de petri y hacer cortes de
aproximadamente 1cm2 al micelio, directamente
en la placa.
c) Tomar 3 fragmentos de agar colonizado con
micelio y cerrar la placa de petri.
d) Abrir el frasco con grano estéril, dejar caer los fragmentos y agitar. Si es micelio líquido,
agregamos 1cm3 de solución con esporas al frasco.
e) Cerrar el frasco y colocar una etiqueta que lo identifique: hongo inoculado, sustrato, fecha
de inoculación y nombre del operador.
f) Llevar los frascos a incubar. Mantener los frascos en un ambiente oscuro, a temperatura y
humedad constantes. Las condiciones ambientales de incubación varían según la especie.
Por ejemplo, para Pleurotus ostreatus la temperatura óptima para el crecimiento del
micelio de es de 24-25ºC y si todo se logra correctamente en unos 10-15 días el grano
tendría que estar completamente colonizado.
g) Pasado el tiempo de incubación (que también depende de la especie) los frascos se verán
cargados de una película blanca.

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Micelio de Pleurotus creciendo sobre grano de trigo

Foto: https://www.pictosee.com/p/2273393743897247517

Habremos obtenido, así, frascos con inoculo primario cuyo crecimiento podemos
visualizar en la siguiente secuencia gráfica:

Secuencia gráfica del crecimiento del micelio dentro de los frascos con granos estériles

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Los frascos completamente colonizados se pueden almacenar en refrigeración durante

unos días antes de su uso.

Frasco con micelio primario identificado – Foto: https://www.pictosee.com/p/2259622071688827356

 Algunas recomendaciones

• Al momento de colocar los frascos dentro de la olla de presión, estos no deben tocar
directamente el fondo porque el vidrio podría romperse por el calor. Si la olla no viene
con separadores metálicos ponerle una toalla o un trapo en fondo.

• Si la olla de presión posee manómetro, esterilizar los frascos con semilla unos 20
minutos a 1 atm. de presión, pero no posee, esterilizar por 45 minutos.

• El tiempo de esterilización comienza a correr desde que se cierra la válvula de seguridad

y llega a la presión deseada.

• Los cultivos madre en placas de petri deben mostrar un crecimiento vigoroso, sano, libre
de contaminantes. Si es posible, no utilizar cultivos de más de 3 semanas.

• Al momento de tomar los fragmentos de micelio en la placa para colocarlos en los

frascos, hacerlo cerca de la llama si no tiene flujo laminar.

• Es importante agitar los frascos o golpearlo contra una superficie plana para evitar que
el grano se apelotone ya que dificultaría el crecimiento del micelio.

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• Procurar que los fragmentos de micelio no queden adheridos a las paredes del frasco,
una vez que lo agitemos.

• Una vez que los frascos están colonizados al 100%, es decir, que vemos que esta todo
blanco, esperar 2 días más para que se colonice bien por dentro y ya estaría listo para
multiplicarlo en más frascos con semilla esterilizada o para comercializarla como
materia prima a productores de hongos comestibles.

• La limpieza, del lugar de trabajo, utensilios y personal (vestimenta adecuada), es

fundamental para obtener buenos resultados.

• Si durante el crecimiento del micelio se observa cualquier signo de contaminación,

habrá que deshacerse del grano. Vaciar los frascos con mucho cuidado, lejos de las
demos frascos, de lo contrario las esporas del moho contaminante podrían infectar todo
el cuarto de incubación.

• Si quisiéramos repicar un cultivo en placa en otra placa, con medio estéril, el proceso
sería el mismo: básicamente, tomaríamos los fragmentos de micelio activado y los
colocaríamos sobre el medio presente en la nueva placa. Incubamos y listo.

Granos de maíz Granos de sorgo Granos de trigo

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d) Control de calidad

Antes de avanzar, es importante hacer un control de calidad de los granos esterilizados

y de los granos inoculados:

Semillas contaminadas

Contaminación bacteriana

¡Micelio arrancando!
Semillas sanas, sin contaminantes

Fotos: Deán Fernández Bustos

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3. OBTENCIÓN DEL INOCULO SECUNDARIO

a) Materiales necesarios
Frasco con micelio o inóculo primario
Bolsas con grano esterilizado
Mechero de alcohol
Bisturí
Etiquetas
Marcador indeleble

b) Procedimiento
El inóculo primario se puede usar para invadir más grano esterilizado. Este método se
conoce como grano sobre grano.
Los profesionales no acostumbran a utilizar este método más de 3 veces seguidas
porque se produce una degeneración natural de las características propias de la cepa, es decir
que el micelio propagado por este método se va debilitando. Lo mejor es colonizar el grano con
micelio madre desarrollado en placas de petri.
El paso a paso de multiplicar el micelio en bolsas con el método grano sobre grano, es el
siguiente:
a) Agitar el frasco con semilla inoculada para que se desgrane bien el micelio.

b) Bajo la campana de flujo laminar, flamear la punta del bisturí con el mechero,
calentándolo al rojo vivo y dejar enfriar unos segundos.
c) Tomar varios fragmentos de micelio madre e introducirlo en las bolsas con granos
estériles.
d) Cerrar la bolsa y colocar una etiqueta que la identifique: tipo de hongo inoculado, tipo de
sustrato, fecha de inoculación y nombre del operador.
e) Agitar bien para que los fragmentos de micelio se distribuyan homogéneamente.

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f) Llevar las bolsas a incubar. Mantenerlas en un ambiente oscuro, a temperatura y

humedad constantes, según la especie.
g) Agitar las bolsas cada 3-4 días, mientras dura la incubación, para procurar un crecimiento
más rápido y homogéneo.
h) Pasado el tiempo de incubación, las bolsas se pueden conservar en refrigeración.

Frasco con inóculo primario y bolsas con granos

estériles esperando ser sembradas

Frasco con inóculo primario

Fotos: Deán Fernández

Bolsas para micelio secundario

Fotos: Deán Fernández Bustos

Producción de spawn – Foto: https://www.pictosee.com/p/2190177860979538207

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¡En el Álbum Audiovisual 3 incluimos un

video que muestra el proceso completo!

4. VIABILIDAD DE LA CEPA. TECNICAS DE CONSERVACION

Para saber si la cepa se mantiene en perfectas condiciones para ser utilizada como
micelio madre o para multiplicarla en bolsas, placas o matraces para micelio líquido, analizamos
3 aspectos fundamentales:

• Viabilidad: se dice que la cepa es viable cuando se toma una porción de ésta y se
siembra en medio de cultivo observando su recuperación y crecimiento.

• Pureza: si una cepa es pura, únicamente se recuperará o crecerán las colonias típicas
del hongo en cuestión.

• Estabilidad morfológica: teniendo en cuenta que el concepto de especie que se

maneja para los hongos es a nivel morfológico, se considera que un asilamiento o
micelio posee estabilidad morfológica cuando su evaluación macroscópica y
microscópica se corresponde con las características descritas antes de ser conservado.

La declinación de las características deseables de una cepa se puede atribuir a diversos

factores, entre ellos:

• Carencia o agotamiento de los nutrientes en el medio de cultivo. Cuando una cepa se

ha mantenido por largo tiempo dentro de un refrigerador, observamos que el medio
se seca, separándose incluso de las paredes del tubo o del fondo de la placa, indicando
que ha pasado mucho tiempo.

• Acumulación de secreciones toxicas propias del metabolismo del hongo.

• Alteración del pH en el medio.

• Disminución de la concentración de O2 y la consecuente acumulación de CO2.

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Para mantener y conservar la viabilidad y las características particulares de los hongos

es necesario desarrollar técnicas óptimas que garanticen la conservación de las cepas.
El objetivo de estos métodos es evitar la degeneración y el envejecimiento de las cepas,
retardando, en la medida de lo posible, los cambios degenerativos normales que ocurren en las
células.
No es objetivo de este curso profundizar en estos métodos de conservación pero
creemos importante mencionarlos
Los MÉTODOS DE CONSERVACIÓN A LARGO PLAZO son los mejores porque ayudan a
detener el crecimiento de las células sin que mueran. Entre ellos, podemos citar:

 Liofilización: es una forma de deshidratación en frío a baja presión (vacío) que sirve para
conservar sin daño el material biológico. El producto se conserva con muy bajo peso y a
temperatura ambiente y mantiene todas sus propiedades al rehidratarse, a diferencia
de los demás métodos de secado. En la liofilización no ocurre la evaporación del agua,
como si sucede en los procesos de secado. Primero se congela el material y luego el
hielo se elimina por sublimación mediante vacío. Fue introducido en 1903 cuando
Vansteenberghe liofilizó el virus de la rabia sobre ácido sulfúrico bajo vacío. Los equipos
tienen tres componentes: un mecanismo de congelamiento, una fuente de vacío y una
trampa para el vapor de agua. Los equipos son realmente costosos pero los resultados
altamente beneficiosos. El periodo de viabilidad para algunos hongos conservados bajo
este método es de 23 años (Smith y Onions, 1994).
 Criocongelación: también conocido como congelación criogénica. Este proceso consiste
en la aplicación intensa del frío para reducir la temperatura, bloqueando las reacciones
bioquímicas de los procesos enzimáticos. La congelación mediante los sistemas
convencionales requiere de largos períodos, sufriendo los alimentos la deshidratación
celular, pérdidas de proteínas, color, sabor, etc. Se emplean sustancias crioprotectoras
que protegen del daño que se pueda producir en la células en el momento de la
congelación. Entre estas sustancias el glicerol es el más utilizado a una concentración del
15 al 20%; también tenemos la leche descremada y carbohidratos como la glucosa,
lactosa, sacarosa, etc.

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Los MÉTODOS DE CONSERVACIÓN A CORTO PLAZO son:

 Cultivo seriado: consiste en resembrar el hongo cada cierto tiempo en un medio

adecuado. Generalmente se utiliza el agar como medio solido (más recomendable que
el medio liquido) y se emplean todas las técnicas que hemos visto en el curso. Este
método es válido para cortos periodos de tiempo (máximo 15 días). Esa cantidad de
siembras consecutivas, en tan cortos periodos de tiempo, podría aumentar la
contaminación si no se siguen rigurosamente las normas de higiene. Otro riesgo que se
corre con este método es la posibilidad de mutación con cada transferencia, con
pérdidas de las características del organismo. En ese sentido, es preferible utilizar como
micelio madre una cepa en placa obtenida a partir de una esporada o trozo de himenio y
a partir de allí obtener el inoculo primario, como vimos antes o repicar el menor número
de veces.
 Conservación por suspensión en agua destilada: descrito originalmente por Castellani
en 1939, es un método alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad
de las especies en periodos superiores a 5 años. La estabilidad morfológica es buena.
Este método consiste en suspender en agua estéril, las células de cultivo como esporas.
Es una técnica fácil de implementar, económica y efectiva. En laboratorios de escasos
recursos es ideal.
 Conservación con aceite mineral: consiste en recubrir con aceite mineral estéril un
cultivo que se encuentre en condiciones óptimas de crecimiento micelial y esporulación.
Generalmente se utiliza aceite mineral de alta calidad. Esta técnica disminuye la
deshidratación del medio retarda la actividad metabólica del cultivo por la reducción de
la tensión de oxigeno además de reducir la posibilidad de infección por ácaros. Es
ampliamente aplicable a formas no esporuladas o estrictamente miceliales para las
cuales la liofilización o la criopreservación no resultan tan efectivas. Algunas especies de
Arpergillus y Penicillium han permanecido viables por 40 años (Smith y Onions, 1994).
 Otros: Conservación en tierra, arena o silica gel y congelación en nitrógeno líquido.

Para realizar estos métodos, es necesario disponer de un microscopio, pero antes de la

evaluación microscópica, es preciso detallar el aspecto macro, del crecimiento del micelio en la
placa, como por ejemplo: color de la colonia, velocidad de crecimiento y aspecto en general.

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Si no observamos nada extraño al momento de repicar una dilución de esporas en un

medio de cultivo en placa, o al clonar un cultivo conservado, utilizando cualquiera de los
métodos antes descritos, decimos que la cepa es viable y estable morfológicamente.

5. BIBLIOGRAFIA
• Hartung de Capriles and Mata-Essayag. 1990. Mantenimiento de actinomicetos con el
método de Castellani. Bol Soc Venez Microbiol, 10(1): 3-4.

• Hartung, Mata and Middelveen. 1989. Preservation of fungi in water (Castellani): 20

years. Mycopathologia, 106(2): 73-79.

• López, A. 2007. Manual de Producción de MICELIO de Hongos Comestibles. Instituto de

Genética Forestal, Universidad Veracruzana. Veracurz, 31 pp.

• Rodrigues, Lírio and Lacaz. 1992. Preservacao de fungos e actinomicetos de interesse

médico em agua destilada. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo, 34(2):159-165.

• Ryan, Smith and Jeffries. 2000. A decision-based key to determine the most appropriate
protocol for the preservation of fungi. World Journal of Microbiology and Biotechnology,
16: 183-186.

• Smith and Onions. 1994. The preservation and maintenance of living fungi. International
Mycological Institute. Wallingford, United Kingdon: CAB International 122 pp.

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