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AISLAMIENTO Y EXTRACCIN DE MERISTEMOS

Laboratorio # 7









PhD. JAVIER BELTRAN




UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE EDUCACIN Y CIENCIAS
PROGAMA DE BIOLOGA
CULTIVO DE TEJIDO
2013

OBJETIVOS
Realizar una correcta extraccion de meristemas.
Conecer las tcnicas adecuadas para realizar aislamiento y extracccion de
meristemas.
Observar y analizar al microscopio las caractersticas de un meristema
apical.
Explicar la utilizacin del aislamiento de meristemas en ceiba leche.


















INTRODUCCIN
En la yema apical se encuentra un grupo de clulas que conforman el meristemo
apical (con un tamao entre 0,01 y 0,3 mm). Es un tejido embrionario que tiene la
capacidad de formar todos los tejidos de la planta y regenerar plantas completas.
Estos tejidos se caracterizan por mantenerse siempre jvenes y poco
diferenciados, tienen capacidad de divisin y de estas clulas aparecen los dems
tejidos. Esta particularidad diferencia los vegetales de los animales, pues denota
que los primeros llegaron a la multicelularidad de una forma completamente
diferente. Esta tcnica se fundamenta en que la distribucin de los virus no es
uniforme y que su concentracin tiende a disminuir progresivamente hacia el
meristema apical del tallo, donde las clulas se encuentran en constante y rpida
divisin.
En condiciones de laboratorio in vitro, mediante la extraccin y aislamiento de
meristemos se puede obtener el cultivo de tejido de cualquier planta y de cualquier
rgano de la planta, la nica condicin es que se parta de clulas vivas, es decir,
se puede obtener el cultivo de meristemos y la diferenciacin de brotes y races,
siempre que se parta de un pedazo de la planta (explante) que tenga clulas
vivas. Este es el fundamento fisiolgico de la obtencin de los cultivos de tejidos
vegetales in vitro, tanto de plantas dicotiledneas (tabaco, papa, tomate, etc.)
como de plantas monocotiledneas (arroz, maz, caa de azcar, etc.). Este
proceso se logr por primera vez a partir de la dcada de los aos 30 del siglo
pasado y es una metodologa bsica imprescindible que se aplica en la
Biotecnologa Vegetal actual para regenerar las plantas.
En la siguiente prctica de laboratorio se realiz el aislamiento y extraccin
meristemos a partir de primordios jvenes de un rbol de ceiba de leche
encontrado en las instalaciones de la universidad.





MATERIALES Y MTODOS
Para la realizacin de esta prctica se hizo necesario la obtencin de un explante
de una rbol de ceiba de leche, para ello nos desplazamos a las afueras del
laboratorio de biotecnologa ubicado en la universidad de sucre sede puerta roja
(ver figura 1), y se tomaron varias ramas de este rbol y se le cortaron los
meristemos apicales, con ayuda de una tijera. Luego nos desplazamos al
laboratorio de biotecnologa vegetal y se procedi a realizar los instrumentos con
los cuales se realiz el aislamiento y extraccin de estos, as: para la elaboracin
de la microcuchilla, se tom un palillo se chuzos y se le hizo una pequea abertura
en su extremo, con ayuda de una cuchilla. Luego se cort una cuchilla en forma de
triangul con una tijera y se insert en la pequea abertura que se realiz
previamente en el palillo de chuzos (ver figura 2). Seguidamente para la
realizacin de la microaguja, se tom la aguja de la jeringa y se dobl su extremo
terminal en forma de U con ayuda de una pinza, luego se tom un palillo de
chuzos y se le insert la parte de la aguja y se peg con gota mgica (ver figura
3). Ms tarde se tom el explante de ceiba de leche cortado anteriormente y se
coloc bajo la observacin del estereoscopio (ver figura 4) y con ayuda de la
microcuchilla y de la microaguja elaboradas previamente se procedi a cortar la
base hojas y las brcteas con sumo cuidado, hasta obtener el domo del
meristemo.










GALERIA FOTOGRAFICA


Fig. 1. rbol de ceiba de leche del
cual fue extrado el explante para la
extraccin de los meristemos.

Fig.2. Microcuchilla elaborada para
realizar el aislamiento y extraccin de
meristemos.

Fig.3. Microaguja utilizada en el
aislamiento y extraccin de
meristemos.

Fig.4. estereoscopio utilizado en la
observacin de meristemos.




RESULTADOS
Marca: ZEISS
Modelo: Stemi
DV4
Meristemas de diferentes pices observados bajo el estereoscopio


Fig.5.meristema observado bajo el estereoscopio aumentado 400 X.

Fig.6.meristema observado bajo el estereoscopio aumentado 400 X.





Fig.7meristema observado bajo el estereoscopio aumentado 400 X.

Fig.8.meristema observado bajo el estereoscopio aumentado 400 X.

Fig.9.meristema observado bajo el estereoscopio aumentado 400 X.


DISCUSIN

El meristemo apical es un tejido embrionario que tiene la capacidad de formar
todos los tejidos de la planta y regenerar plantas completas, esta tcnica tiene
numerosas aplicaciones. Una de las ms importantes es la obtencin de plantas
libres de virus, ya que esta pequea zona de tejido generalmente no est afectada
por estos patgenos vegetales, debido a que estos ltimos tienen dificultades
para alcanzar esta zona cuando la planta est creciendo activamente, es decir,
que la concentracin de virus disminuye hacia el pice siendo posible en muchos
casos encontrar la zona del meristema apical, libre de partculas. En general se
acepta que esta situacin se debera a la ausencia de tejidos de conduccin en la
zona meristemtica y al hecho de que la activa divisin de sus clulas estara
dejando a estas fuera del alcance del virus.

Otra aplicacin es la multiplicacin vegetal de enorme potencial; la tcnica permite
multiplicar especies de plantas con reproduccin lenta o dificultosa o acelerar la
produccin de plantas bianuales. Una ventaja que esta tcnica ofrece es que las
clulas constituyentes del meristema son genticamente estables y por lo tanto las
plantas regeneradas son idnticas a las plantas donadoras de los meristemas.

El cultivo de meristemas incluye un proceso de esterilizacin de superficie, la
escisin y aislamiento del meristema, y su cultivo en un medio bajo condiciones
adecuadas. En el laboratorio de realiz el aislamiento y extraccin de meristemas
partir de un explante de ceiba de leche, para lo cual fue imprescindible esterilizar
la superficie del material (explante) con agua destilada, puesto que para lograr un
trabajo de alta calidad durante el corte de las yemas y el aislamiento de los
meristemas, se debe mantener la esterilidad del material, prevenirla desecacin
de la estructuras de la yema y evitar daos fsicos al meristema. De igual forma
este procedimiento de aislamiento se debe hacer rpidamente sino el tejido se
deshidrata y puede sufrir daos, por lo cual se requiere de prctica y destreza a la
hora de realizarlo. Por otra parte, es preciso decir que el tamao de la zona libre
de virus vara con la especie del virus involucrado. De esto se deduce que para
cada especie de planta es necesario establecer el tamao adecuado de los
explantes para regenerar plantas libres de virus.

Es importante resaltar que cultivar una planta in vitro no es tan simple, requiere
una serie de cuidados para su total desarrollo. Hay varios factores que pueden
afectar totalidad del proceso y estos deben ser controlados, como por ejemplo la
edad fisiolgica; este es un aspecto de gran influencia en la morfognesis debido
a que cuando ms joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor
ser su respuesta in vitro. Es por ello que los meristemas apicales y axilares son
ampliamente usados en numerosas especies. Tambin es necesario tener en
cuenta el crecimiento de los cultivos se lleva a cabo en medios de cultivo
especficos. En general, estos medios deben tener una composicin que
proporciona los nutrientes necesarios y los factores de crecimiento en la
proporcin adecuada. Los medios de cultivo se componen de ciertos nutrientes
principalmente inorgnicos tales como nitrgeno, fsforo, potasio, calcio,
magnesio y azufre. Los oligoelementos tales como el boro, el cobre, el
manganeso, el yodo, el cobalto y el sodio son necesarios para apoyar un
crecimiento saludable y sano. Requieren de una fuente de carbono. Tambin
necesitan hierro para la sntesis de la clorofila y para las diversas reacciones de
reduccin de oxidacin dentro del cultivo en desarrollo. Los reguladores
de crecimiento de las plantas, tales como las auxinas y las citoquininas, deben
estar presentes en la proporcin correcta para formacin de la raz y de los brotes.
Las giberelinas se utilizan fundamentalmente en el cultivo de meristemas y en
estudios de diferenciacin vascular debido a que esta acta en las primeras fases
poder crecer en esta aunque ello quiere adems de otras hormonas.

Otro de los principales problemas que se presentan cuando se tratan de
establecer los cultivos es el de la contaminacin de los mismos con diversos tipos
de microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, virus).El ambiente
generado por explante-medio de cultivo-condiciones fsicas de incubacin es
altamente propicio para la proliferacin de muchos de estos microorganismos que
pueden provocar la destruccin de los cultivos, por ello se deben tener todas las
condiciones aspticas para establecer nuestro cultivo. Cabe resaltar que la
eliminacin de patgenos a travs del simple uso de compuestos antimicrobianos
es del todo eficiente. Por ello, cuando se detecta la presencia de patgenos o
contaminantes en el material vegetal propagado, resulta indispensable establecer
una estrategia de saneamiento que contemple el tratamiento ms adecuado o la
suma de varios tratamientos. En el caso de la presencia de virus y viroides, el
tratamiento con calor (termoterapia), acompaado del uso de agentes antivirales
no especficos y de baja fitotoxicidad como la ribavirina, resulta indispensable. La
eficiencia de las metodologas de saneamiento mencionadas se incrementa
notablemente cuando los diferentes tratamientos se utilizan en forma combinada.

La termoterapia es un tratamiento de plantas con altas o bajas temperaturas. La
efectividad del tratamiento por termoterapia depender tanto del rango de
temperaturas seleccionado como del tiempo o ciclos de exposicin de la planta
contaminada a las condiciones y temperaturas seleccionadas. Es de gran
importancia minimizar el posible dao irreversible a la planta bajo tratamiento.
Luego de haber aplicado el protocolo y monitoread la calidad fitosanitaria de la
planta tratada, se procede a la diseccin de los meristemas como explantes
iniciadores del cultivo in vitro.
La quimioterapia es una tcnica ampliamente difundida, no slo bajo condiciones
de laboratorio, sino tambin en campo. La aplicacin de los diferentes agentes
tales como antibiticos, insecticidas, agentes antivirales, puede realizarse durante
el cultivo in vitro del material vegetal infectado, adicionando los mencionados
compuestos a los medios sintticos de cultivo. Cabe considerar que el uso
repetido o a largo plazo de un compuesto antibitico, insecticida o antifngico
puede general respuestas de resistencia o tolerancia por parte del patgeno que
se desea controlar. Por otra parte es importante mencionar que la efectividad de la
aplicacin exgena de sustancias con probada actividad antimicrobiana, de alta
especificidad o de amplio espectro, depender de la adecuada identificacin del
patgeno, del uso de una dosis adecuada y del correcto manejo de la planta bajo
tratamiento.




















CONCLUSIN

La tcnica de cultivo de meristemos es ampliamente utilizada en cultivos in vitro
para obtener plantas libres de virus, esto se debe a que la concentracin de virus
disminuye hacia el pice siendo posible en muchos casos encontrar la zona del
meristemo apical, libre de partculas. La ausencia de contaminantes es un
prerrequisito que asegura el adecuado crecimiento y alta productividad de las
especies vegetales de inters comercial. Por ello esta tcnica recobra gran
importancia al momento de general plantas libres de contaminantes debido a que
este es un mtodo fcil de implementar y accesible econmicamente como se
pudo evidenciar con la realizacin de esta prctica.


CYBERGRAFIA


http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/biotecnologia%20vegetal.p
df
http://www.ehowenespanol.com/factores-afectan-tecnicas-cultivo-tejido-
vegetal-info_209734/
http://es.scribd.com/doc/134743780/2-Cultivo-de-Tejidos-Vegetales