INÓCULO MICROBIOLÓGICO

Blgo. Hernández Obrgón Eswin D.

Trujillo - 2020
INTRODUCCIÓN

INÓCULO: Suspensión de microorganismos que se

transfieren a un ser vivo o a un medio de cultivo a
través de la inoculación. Por otra parte:

• Un inoculo microbiano es una preparación solida o

líquida la cual contiene una gran cantidad de
microorganismos
APLICACIÓN

http://www.science.oas.org/Simbio/mbio_ind/mbio_ind.htm
 Características de inoculo
 La cepa o cultivo a utilizar debe ser genéticamente estable.
 La cepa o cultivo debe estar libre de contaminantes.
 El microorganismo a usar debe ser de fácil conservación sin
pérdida de sus características.
 El inoculo puede ser un consorcio de diversas especies
microbianas, como las que se encuentran en lodos aerobios
(aguas residuales).
 Un inoculo debe tener la capacidad de crecer e invadir
rápidamente el sustrato (velocidad de crecimiento alta).
 El inoculo implica obtener una suspensión de microorganismos
viables y aptos para reproducirse y producir metabolitos a escala
industrial.
 Si el objetivo es obtener un producto, este debe ser obtenido en
altas concentraciones.
Condiciones ambientales

El medio ambiente en el que crece el

microorganismo va a determinar su
adecuado desarrollo. El pH, la
temperatura y la presencia de
oxígeno son los parámetros
ambientales más importantes
cuando se pretende utilizar un
microorganismo industrialmente
LA PREPARACIÓN DEL INÓCULO

La preparación del inóculo implica el desarrollo de

una población de microorganismos, desde su
estado de conservación hasta obtener una
suspensión de microorganismos viables y aptas
para reproducirse y producir metabolitos a escala
industrial

Los métodos para la preparación del inóculo

tienen dos finalidades
-Obtener máximo de viabilidad de los
microorganismos
- Evitar que pierdan las características para
producir los metabolitos de interés
 LAS ETAPAS PARA PREPARAR EL INÓCULO
EL PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR EL INÓCULO INCLUYE TRES ETAPAS:

1. La Recuperación de la cepa.

La forma de recuperar la cepa depende del método de conservación utilizado; por ejemplo:
Si el cultivo está liofilizado, se le adiciona agua destiladas estéril para rehidratar las células.
Si el cultivo está congelado, se recomienda poner el recipiente que lo contiene en un baño de
agua a 37°C para que la descongelación sea lo más rápida posible.
Si el cultivo está en tubos de agar inclinado, se adiciona agua destilada estéril y se raspa la
superficie con ayuda de un asa microbiológica.
Si el cultivo está en una botella de Roux, se le adiciona agua destilada estéril y unas perlitas de
vidrio estériles y se agita suavemente con el fin suspender los microorganismos
- Si el cultivo está desecado, se le adiciona agua destilada estéril para rehidratar las células
El Crecimiento

En un medio de cultivo sólido

Una vez preparada la suspensión de microorganismos, se toma una asad

( muestra) y se raya en un medio de cultivo sólido en el interior de tubos de
agar inclinado. Se incuba a la temperatura y el tiempo adecuados.

El crecimiento en un medio de cultivo líquido

Se toma una asada del crecimiento del microorganismo en el medio de

cultivo sólido y se introduce en matraces erlenmeyers de 100 ó 250 ml de
capacidad, que contienen un medio de cultivo líquido (en una cantidad que
varia del 10 al 20% de su capacidad). Luego, se esterilizan y se incuban de
acuerdo con los requerimientos ambientales del microorganismo.
Los aspectos por considerar en la preparación del inóculo

En la preparación del
inóculo se deben
tomar en cuenta dos
aspectos
importantes:

La cantidad de
inóculo requerida La concentración
para el proceso de de los
fermentación microorganismos
en el inóculo
La Cantidad de Inóculo

La cantidad de inoculo que se prepara y se agrega, en la mayoría de los

casos, es el 10% del volumen total de trabajo: si se va a trabajar con un
volumen final de un litro, se debe preparar cien mililitros de inóculo, En el
caso de que el volumen requerido sea muy grande, el inóculo se debe
preparar en varias etapas: por ejemplo, si el volumen de producción es de
un millón de litros, el inóculo que se debe sembrar en el caldo
fermentación es de cien mil litros y, para su obtención, la preparación se
hace por etapas. A veces, se necesitan seis o siete etapas para lograr el
volumen de inóculo requerido; las dos primeras etapas, generalmente, se
realiza en matraces erlenmeyers y las demás en fermentadores con
volúmenes cada vez mayores.

Durante la preparación del inóculo, se recomiendan mantener condiciones

estrictas de higiene y esterilidad en los equipos así como hacer varias
pruebas de pureza, porque el cultivo se puede contaminar en el paso de
una etapa a otra
La concentración de microorganismos

La concentración de microrganismos es un parámetro vital que se debe conocer

en un proceso de fermentación, pues suministra datos no solo relacionados con
la curva de crecimiento del microrganismo, con la que se debe iniciar el
proceso. Cuando el producto deseado es la biomasa. La concentración de
microrganismos representa la eficiencia dek proceso si el interés va dirigido
hacia los metabolitos , el mismo parámtro ( la concentración de
microrganismos ) es una medida indirecta de su producción, Existe varios
modelos para medir la concentración de microrganismos,los más comunes son:

Métodos directos

La determinación del numero de células por unidad de área:

Se aplica cuando los microrganismos son unicelulares (levaduras o bacterias)

se realiza por conteo

Cuenta viable (en placa, cuenta en tubo de Hungate, tinción con azul de tripano)
Métodos indirectos

La determinación de masa Celular

Se emplea principalmente para microorganismos que crecen

en forma micelial, La masa celular se determina por peso seco.

La determinación de la densidad celular

Cuando se dirige un haz de luz hacia un cultivo con

microorganismos, estos desvían el haz parcialmente, según su
concentración en el medio
De lo más pequeño
a lo más grande
 Etapas del desarrollo
del inóculo

1. Reactivación de
la cepa.

2. Crecimiento del 3. Crecimiento del

microorganismo en microorganismo en un
medio sólido o líquido medio de cultivo liquido
IMPORTANCIA DEL DESARROLLO DE INÓCULOS

 Para la elaboración de procesos

fermentativos .
 En la industria de los alimentos,
panadería, lácteos y otros.
 Para la optimización de los resultados en los
procesos biotecnológicos.
 En la Comercialización como cultivos
liofilizados.
IMPORTANCIA DEL DESARROLLO DE INÓCULOS
Desarrollo de inóculos microbianos empleando
lodos activados para la remoción de acido
sulfhídrico (H2S) mediante biofiltración

Desarrollo de inóculos para la determinación de la

DBO:

Desarrollo de inóculos de microorganismos

lácticos y levaduras para la nutrición y
alimentación animal
Yarrowia lipolytica La cepa (ATCC 9773) se adquirió de Medimark © Europe, 38033
Grenoble Cedex 2. Francia.

2.2. Residuos industriales de aceites.

La muestra de residuos lácteos se obtuvo de una industria láctea ubicada en Valledupar
(Colombia). La muestra se
recogió en un recipiente de plástico de 8l. El contenedor utilizado para la muestra La
recolección se trató previamente mediante lavado con alcohol y luego se enjuagó cuatro veces
con agua destilada. La muestra se almacenó a una temperatura inferior a 4 ° C para evitar
cualquier cambio fisicoquímico en el efluente. Finalmente, el volumen de muestra se dividió
para que los valores de pH se ajustaran a 5.0 y 6.5 empleando solución de HCl 0.5 N.
2.3. Activación y conservación de Yarrowia lipolytica ATCC 9773
La cepa se inoculó a 25 ° C durante tres días en placas de Petri que contenían agar PDA
(Figura 1a) y aceite de oliva como fuente de lípidos. Luego se realizó una morfología
microscópica (Figura 1b) empleando azul de lactofenol como colorante. Finalmente, se
ajustaron 0,5 ml del inóculo por turbidimetría a escala MacFarlan (3) y se almacenaron a 4 °C
hasta su uso.
2.4. Preparación del inóculo y obtención del extracto enzimático crudo (CEE)
El inóculo se obtuvo de una suspensión de esporas maduras de Y. lipolytica cultivado durante
cinco días a 25 ° C en agar PDA suplementado con aceite de oliva. La biomasa obtenida se
suspendió en una solución de cloruro de sodio (NaCl) al 0,9% (p / v). Posteriormente, se
inocularon 200 ml de medio de cultivo que contenía agua salada (30% SW), cloruro de
sodio (5.0%), extracto de levadura (0.5%), aceite de oliva (1.0%) y Triton X-100 (0.1%) con una
suspensión. de Y. lipolytica por un tiempo de incubación de 8 horas. La biomasa fúngica se separó
luego del sobrenadante por centrifugación a 5000 rpm durante 10 min. Finalmente, el
sobrenadante [extracto enzimático (EE)] se filtró a través de membranas de acetato de celulosa
(0.22 a 0.45 mm) y la viabilidad de la célula en suspensión se determinó por espectrofotometría
(Spectronic 20D) a 600 nm (Wu et al. 2009).
2.5. Caracterización fisicoquímica de efluentes.
Los análisis fisicoquímicos se realizaron utilizando los protocolos de métodos estándar
establecidos para agua cruda y aguas residuales. El contenido de grasa y aceite se determinó por
el método Soxhlet de acuerdo con los métodos estándar de la APHA et al. ( 2012). La dureza se
midió mediante valoración utilizando una solución de EDTA como agente de valoración, los
resultados se expresaron en mg de CaCO3 / L (Método 2340 C). La demanda biológica de
oxígeno (DBO) se calculó preparando el volumen requerido de agua de dilución con la adición
de nutrientes e incubando durante un período de cinco días a 20 ° C, mientras que la demanda
química de oxígeno (DQO) se determinó en base al método de oxidación rápida de dicromato
(APHA et al. 2012). El contenido de fósforo se determinó mediante digestión ácida, utilizando el
método del ácido ascórbico expresado en mg de P / L. El contenido de proteína fue
determinado por el método Kjeldahl. El potencial de hidrógeno se determinó
potenciométricamente utilizando un potenciómetro digital (medidor de pH-conductividad de
banco PC 510).
2.6. Evaluación de biodegradación
Esta prueba se realizó durante la fermentación discontinua del efluente utilizando diferentes
concentraciones (8%,12% y 16%) de CEE de Y. lipolytica, considerando el volumen de grasa residual
del efluente (pH 5 y 6.5 a 25 ° C). El contenido de grasa se determinó cada 8 horas hasta alcanzar 32
horas de fermentación. Cabe mencionar que BOD55 y la DQO se calcularon solo para el momento en
que se alcanzó la mejor eliminación de grasa (concentración de inóculo: 6%, tiempo de incubación:
32 hr pH: 5.0).