AVALUACIÓ EGM 29 de Maig de 2017

GRAUS BIOTECNOLOGIA/GENÈTICA/MICROBIOLOGIA
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-El tiempo de realización del examen es de 2h
-Es necesario justificar todas las respuestas
-Los exámenes con caligrafía ininteligible no se corregirán
-Es necesario contestar las preguntas en el espacio indicado
-Recordad que se penalizarán los errores en la escritura del nombre de genes, proteínas o microorganismos
-Cada ejercicio vale 2 puntos

APELLIDOS, NOMBRE_____________________________________________________________________________
GRADO _______________________________ AULA DE EXAMEN____________________________

Localización en el aula:
FILA__________________________________ COLUMNA__________________________________

1. Se pretende construir una fusión traduccional entre un antígeno de una bacteria patógena y el dominio de anclaje
de una proteína de membrana externa de una bacteria Gram-negativa. Para realizar dicha construcción se
utilizará el sistema de “Gibson assembly” o de “In Fusion assembly”. Teniendo en cuenta las secuencias que se
dan a continuación, indica la secuencia de los cuatro oligos que utilitzarías para la realización del procedimiento y
marca su ubicación en las secuencias dadas.

>gen de la proteïna de membrane externa (ompF)

ATGGCTATCGACGAAAACAAACAGAAAGCGTTGGCGGCAGCACTGGGCCAGATTGAGAAACAATTTGGTAAAGGCTCCATCATGCGC
CTGGGTGAAGACCGTTCCATGGATGTGGAAACCATCTCTACCGGTTCGCTTTCACTGGATATCGCGCTTGGGGCAGGTGGTCTGCCG
ATGGGCCGTATCGTCGAAATCTACGGACCGGAATCTTCCGGTAAAACCACGCTGACGCTGCAGGTGATCGCCGCAGCGCAGCGTGAA
GGTAAAACCTGTGCGTTTATCGATGCTGAACACGCGCTGGACCCAATCTACGCACGTAAACTGGGCGTCGATATCGACAACCTGCTG
TGCTCCCAGCCGGACACCGGCGAGCAGGCACTGGAAATCTGTGACGCCCTGGCGCGTTCTGGCGCAGTAGACGTTATCGTCGTTGAC
TCCGTGGCGGCACTGACGCCGAAAGCGGAAATCGAAGGCGAAATCGGCGACTCTCACATGGGCCTTGCGGCACGTATGATGAGCCAG
GCGATGCGTAAGCTGGCGGGTAACCTGAAGCAGTCCAACACGCTGCTGATCTTCATCAACCAGATCCGTATGAAAATTGGTGTGATG
TTCGGTAACCCGGAAACCACTACCGGTGGTAACGCGCTGAAATTCTACGCCTCTGTTCGTCTCGACATCCGTCGTATCGGCGCGGTG
AAAGAGGGCGAAAACGTGGTGGGTAGCGAAACCCGCGTGAAAGTGGTGAAGAACAAAATCGCTGCGCCGTTTAAACAGGCTGAATTC
CAGATCCTCTACGGCGAAGGTATCAACTTCTACGGCGAACTGGTTGACCTGGGCGTAAAAGAGAAGCTGATCGAGAAAGCAGGCGCG
TGGTACAGCTACAAAGGTGAGAAGATCGGTCAGGGTAAAGCGAATGCGACTGCCTGGCTGAAAGATAACCCGGAAACCGCGAAAGAG
ATCGAGAAGAAAGTACGTGAGTTGCTGCTGAGCAACCCGAACTCAACGCCGGATTTCTCTGTAGATGATAGCGAAGGCGTAGCAGAA
ACTAACGAAGATTTTTAA

>antígeno de bacteria patógena (antI)

ATGACTGACAGTGAACTGATGCAGTTAAGTGAACAGGTTGGGCAGGCGCTGAAAGCCCGTGGCGCAACCGTAACAACTGCCGAGTCT
TGTACCGGTGGTTGGGTAGCGAAAGTGATTACCGATATTGCCGGTAGCTCCGCCTGGTTTGAACGCGGATTTGTCACCTACAGTAAC
GAAGCCAAAGCGCAGATGATCGGCGTACGCGAAGAGACGCTGGCGCAGCATGGCGCGGTGAGTGAACCCGTCGTGGTGGAAATGGCG
ATAGGCGCACTGAAAGCGGCTCGTGCTGATTATGCCGTGTCTATTAGTGGTATCGCCGGGCCGGATGGCGGCAGTGAAGAGAAGCCT
GTCGGCACCGTCTGGTTTGCTTTTGCCACTGCCCGCGGTGAAGGCATTACCCGGCGGGAATGCTTCAGCGGCGACCGTGATGCGGTG
CGTCGTCAGGCTACTGCGTATGCATTGCAGACCTTGTGGCAACAATTTCTACAAAACACTTGA

OLIGO 1

OLIGO 2 ATG

OLIGO 3

OLIGO 4
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2. Se ha aislado una cepa Gram-negativa de una muestra clínica y se ha determinado que presenta un defecto en el
genX. Se pretende incorporar un plásmido que contiene dicho gen para complementar en “trans” la deficiencia
detectada. Para ello se ha seguido el siguiente procedimiento:

Amplificación del genX salvage por PCR usando Polimerasa Pfu

↓
Ligación con el vector pUA002* cortado con SmaI (extremos romos)
↓
Electrotransformación de la ligación en la cepa aislada
↓
Siembra en placas con ampicilina (después de esperar el tiempo de expresión
fenotípica)
↓
Incubación

*el esquema del plásmido puede verse en el conjunto de plásmidos disponibles

Al final del proceso no se ha obtenido ningún clon. Teniendo en cuenta que los resultados no pueden justificarse
desde el punto de vista técnico (la ejecución del procedimiento ha sido correcta, y también lo son la temperatura de
incubación, la concentración de antibiótico, etc), indica dos posibles puntos críticos del diseño que justifiquen el
resultado y cómo los resolverías.

El vector debe desfosforilarse después de ser digerido con SmalI

Los extremos romos no generan las mejores ligaciones ya que no hay estabilización previa por puentes de H, seria
mejor usar una enzima de restricción que genere extremos cohesivos.
La electrotransformacion no se da de forma eficiente porque
El vector no presenta resistencia a ampicilina?

En la amplificacion
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CONTESTA 3 DE LOS 4 PROBLEMAS QUE SE PLANTEAN
PARA HACERLO PODEIS USAR LOS PLÁSMIDOS QUE HAY EN LA ÚLTIMA HOJA. SI NO ENCONTRÁIS ALLÍ LAS HERRAMIENTAS
QUE NECESITÁIS INDICAD LAS CARACTERÍSTICAS CONCRETAS DE LAS QUE NECESITÁIS PARA LA RESOLUCIÓN DEL PROBLEMA.

1. Se pretende construir un mutante ΔgenX de una cepa de una bacteria Gram-negativa aislada del suelo. Las
primeras pruebas realizadas con dicha cepa nos indican que los procedimientos de electroporación habituales no
parecen ser óptimos para la incorporación de DNA en ella y además, los ensayos para determinar la frecuencia de
recombinación simple apuntan a que ésta se da en una frecuencia extraordinariamente baja. Describe
brevemente el diseño experimental que aplicarías para obtener la cepa ΔgenX.

Usmos un fago que pueda infectar a la cepa especifica i a través de transducción en ese fago introducimos:
- Transpsoson: el gen debería presentar una zona de Att correspondiente con el transposón usado en medio
del gen.
- CRISPr

Utilitzar un fag al que li forcem el cicle lisogenic al gen X especificament i despres forçar el cicle litic generant una
transudcció especialitzada del gen X.?

2. A partir de un vector del tipo R2K se quiere construir un vector suicida, que sólo pueda replicar en un entorno
Suam. Describe brevemente el diseño experimental que seguirías para obtenerlo.
Suam  és que la regió de supressió no funciona (no sé si és delecionada o que és una mutació sense sentit). Llavors
el tRNA interacciona amb els codons STOP i hi carreguen un aminoàcid, enlloc de deixar-lo buit com farien
normalmente.

la resposta de classe va ser bàsicament que es pot fer una PCR inversa per posar un codó stop àmbar (i així el vector
no és suïcida en un entorn de supressió àmbar). Una alternativa per fer això és fer una overlap PCR i incorporar
aquesta mateixa mutació a la regió on hi ha normalment Su. Altrament, es pot treure repA, mutar-la i incorporar-la
amb enzims de restricció
RecA es necesaria per interaccionar amb les regions interions del plasmid R2K de forma que si es muta no podrá
donarse la replicacio daquest. S’uneix als interons, a l’origen de transcripcio.

3. Una empresa de Sevilla encargada de la producción de encurtidos (pepinillos, zanahorias, olivas, etc) que se
consumen a nivel local cree que puede mejorar el proceso de encurtido si una de las bacterias del ácido láctico
que utiliza pierde la capacidad de degradar la galactosa eliminando la función del gen galM. Describe brevemente
los pasos que seguirías para obtener este mutante.
Uso de ARN antisentido complementario al mRNA del gen gal M.
Dependiendo del tamaño del:
- Menor de 100 pb: uso de primers específicos para generar DNA sintético que codifique para un mRNA
complementario al mRNA del gen gal M
- Superior a 100 pb: uso de Gibson assemly i solapamiento entre primers jugar con 80 nucleotidos de libertad i
20 de complementariedad

Doble sistema CRIPSr, cada uno específico para las secuencias que flanquean el gen galM. Después añadir una ligasa.
Se delecciona

Uso de enzimas de restricción con la metodología anterior.

No se permite le uso de OGM al tratarse de la industria alimentaria.

No se pueden hacer mutagénesis dirigas, solo al azar por selección aprovechando la frecuencia de mutagenesiss de
la polimerasa i usando medios que generen presión selevctiva.

En general  augmentar la freqüència de mutagènesi espontània, fer un pre-enriquiment i aplicar llum ultraviolada
(fent rèpliques a saco).

1. sembra en medis amb penicil·lina i una font de carboni (galactosa, en aquest cas): així les cèl·lules deixen de
creixer, però no moren.
2. Sembra en medis amb una font de carboni diferent (primer una, i després altra). es que creixin en el primer
d'aquests medis però no en el segon són les que tenen la mutació del den (en aquest cas galM).
i sempre tens la opció de al final de tot fer una PCR com a prova confirmativa
La penincilina es un bactierostatic

4. Mediante mutagénesis al azar usando luz ultravioleta se ha obtenido un mutante de una cepa aislada en aguas
del mar Adriático incapaz de usar el glicerol como fuente de carbono. Ahora se quiere identificar qué gen es el
responsable de dicha deficiencia. En los bancos de datos no se dispone del genoma de esta especie bacteriana ya
que ha sido aislada por primera vez en nuestro laboratorio. Qué estrategia seguirías para identificar dicho gen?

A partit del aislado se hace una genoteca.

El genoma se digiere con enzimas de restricción al azar generando tamaños de una medida mínima i máxima para
ser clonados a posteriori.
Cada fragmento resultante de la digestión se clona en un vector / cosmido / Bac que serán introducidos a posteriori
en una cepa de expresión.
En esta cepa se observara sembrando en un medio donde el glicerol sea la única fuente de C i simultaniamente se
hacen replicas en un medio rico. Hacemos selección indirecta
Observamos cuales han incorporado el vector … que contenía el fragmento asociado al gen responsable de la
deficiencia ya que no podrán crecer en medio 1 pero si en el 2.
Se puede hacer una sequenciacion i comprobación a posteriori.

Se pueden usar tags también.

PLASMIDOS DE LOS QUE SE DISPONE:

pUA006
RESPUESTA PREGUNTA__________

RESPUESTA PREGUNTA ____________

RESPUESTA PREGUNTA__________

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