● Pregunta 1

10 de 10 puntos

La siguiente secuencia:  CT CCT  GAG GAG AAG TCT GC, representa parte de la
secuencia del gen tipo salvaje, que codifica para la B-globina. En la siguiente secuencia,
CT CCT  GTG GAG AAG TCT GC, se indica en negrita el cambio de A  por  T. Esta
mutación genera un cambio de aminoácido de glutamato a valina en posición 6 de la
proteína. Responsable directo de la enfermedad anemia falciforme, enfermedad
homocigota recesiva. Una forma de detectar si existen pacientes portadores de la
mutación, es mediante la técnica de hibridación usando sondas alelo-especifica. Esto
implica usar dos sondas en experimentos en paralelo. Una de ella, es la denominada
“sonda normal” y la otra denominada “sonda mutante”. El DNA del paciente, se extrae, se
fija en una membrana y se hibridiza con cada una de las sondas por separado.
En el esquema de abajo, se indica el resultado de la hibridación en tres pacientes
distintos,(paciente 1, arriba; paciente 2, al medio y paciente 3, al fondo)  usando las sondas
indicadas:

Indique, que característica (s) tienen las sondas, que le permite detectar una mutación
puntual. Explique (5p)

b) De la interpretación del resultado de hibridación, identifique que paciente (paciente 1 ó

2 ó 3) es paciente homozigoto normal, heterocigoto portador y homozigoto mutante
(paciente que manifiesta la enfermedad). (5p)

Respuesta a) una se aparea con e DNA mutante y la otra con el DNA normal , la
seleccionada: sonda provoca hibidacio cando en esta hay una mutacion, por esto se
diseñan dos sondas, la primera qe es complemetaria y la 2 es
comolementaria a la sonda normal, poterior si se hibrida la sonda
mutante, que es la de rojo quiere decir que eiste una mutacion mkentras
que en la otra no hay
b) el primero de arriba hacia abajo (quien primero tiene un circulo rojo y
otro blanco ) vendria siendo el homozigoto normal AA
     el segundo de arriba hacia abajo ( quien presenta dos circulos
rojos) vendria siendo portador heterozigoto AS
    el terceo de arriba hacia abajo ( quien primero tiene un circulo blanco
y luego uno rojo) vendra siendo  el homozigoto mutante SS 
Respuesta [Ninguna]
correcta:
Comentarios a) Cada sonda es específica para la secuencia blanco, es decir aquella
para respuesta: sonda que detecta la secuencia tipo salvaje, es perfectamente
complementaria a su blanco y, se diferencia de la sonda que detecta
la secuencia mutada, que en posición 7 en vez de tener una A, posee
una T. esta diferencia permite hibridar cada sonda con su
correspondiente blanco y, que no hibride de manera cruzada.
b) Par 1: Homozigoto normal; Par 2, heterocigoto portador; Par 3;
homocigoto recesivo mutante
  

● Pregunta 2
10 de 15 puntos

Explique cuál es el rol del CAP en el proceso de traducción en eucariotas (5p)

b) ¿De qué manera influye la presencia de estructuras secundarias en el 5' UTR de los
mRNAs en el inicio de la traducción? (5p)
c) La puromicina al ser agregada a una célula que este en pleno proceso de traducción,
provoca que las proteínas que se estén sintetizando sean más cortas con respecto a aquellas
de las células control. ¿Por qué cree usted que este antibiótico genera el termino prematuro
de la traducción? (5p) Explique

Respuesta a) el rol del cap en la traduccion de eucariotas que ahi se une la

seleccionada: subunidad 40S del ribosoma mas los fctores de iniciacion,GTP y tRNAi
met y asi podemos comenzarcon el "sacnning" del mensajero, hasta asi
poer encontrar el rpimer codon de inicio y asi definitivamente poder
comnar con la traduccion 
b) esto influye dependiendo de cuanto espacio pueda dejar entre si,
refiriendome al hairpin y el CAP. y si el hairpin tiene la secuncia ATG. si
el espacio es corto pero tine la presencia de ATG en hairpin, se puede
traducir pero pobremente, y esto se explica ya que la subunidad menor
del ribosoma no se ubicaria de l mejor manera. Si el espacio es mayor
, pero la secuencia no la podemos ver incoprporada en el hairpin, el
ribosoma no podra "romper" el hairpin, ya que hay muchos pares de G-C
que son muy estables y fuertes debido a sus 3 puentes de hdrogeno,y en
este caso no se traduciria, si el espacio es el apropiado y ATG se encuntra
en el hairpin, se lograra traducir de la manera correcta 
c)la afecta a la etapa 
Respuesta [Ninguna]
correcta:
Comentarios a) El CAP presente al extremo 5’ del mRNA, es reconocida por la sub
para respuesta: unidad eIF4E del factor de iniciación eIF4F, siendo este evento el paso
limitante del inicio de la traducción, pues una vez reconocido el CAP, la
subunidad eIF4G, permitirá que la sub unidad menor del ribosoma, a
través de eIF3 se una al CAP. Además, mediada por la misma subunidad,
eIF4G, Pab1p, que reconoce la cola de poli A, permitirá circularizar el
mRNA, para asegurar la calidad del mismo y poder iniciar la traducción.
b) La presencia de estructuras secundarias en el 5’ UTR, puede afectar la
eficiencia de la traducción. Si la estructura es muy estable, la actividad
helicasa de eIF4A no será capaz de romper estas estructuras y el
ribosoma no podrá avanzar hacia el codón de inicio. En consecuencia, la
síntesis de proteína sepuede ver impedida en su totalidad o muy
disminuida.
c) Al generar un término prematuro de la traducción tenemos dos
opciones, que el antibiótico este afectando la actividad de la peptidil
 transferasa o, en su defecto, este ocupando el sitio A evitando en
consecuencia que el nuevo aatRNA se una a este sitio y, por lo tanto de
esta manera también se ve interrumpida la síntesis de proteínas.

● Pregunta 3
11 de 15 puntos

Usted desea clonar el gen yfg desde el fragmento de ADN doble hebra que se muestra en
la figura, en el vector  pBIOL240. Tomando en cuenta la información entregada en la
figura responda: (15 puntos totales)
a) Indique la función de los elementos genéticos destacados en el plasmidio (5 puntos)
b) ¿Que enzima(s) utilizaría para clonar el gen yfg en el plasmidio? Fundamente su
decisión. (5 puntos)

c) Al analizar las colonias crecidas en medio con X-Gal obtiene 13 colonias blancas y 80
colonias azules. ¿En cual de estas cree usted que podría estar su fragmento clonado?
¿Cómo analizaría estos clones para comprobarlo? (5 puntos)

Respuesta a) ori: corresponde al sitio de origen

seleccionada:
 AmpR: corresponde al g de resistencia, en este caso seria resistencia a la
ampicilina
LacZ : corresponde a un marcador metbolico el cual puede codificar para la
sintesis de beta galactosida
b) lo cortaria Spel , ya quue esta enzima corta solo una vez y tambien lo
hace cercano al promotor, ecoRI corta bien pero lejos de nuestro promotor
c) en las colonias blancas es en donde se encuentran el fragmento clonado,
ya que Xgal , al ser un sustrato cromogenico, cambia a ser aul cuando este
se encuntra en precensia de lacZ , pero como nuestro gen de interes esta en
medio del gen lacZ, se ve nterrumpida por lo que Xgal no reacciona y la
colonia permanece blanca
Respuesta [Ninguna]
correcta:
Comentarios a) Elementos del plasmidio.
para respuesta: ori: El origen de replicación que permite la replicación del plasmidio en
la bacteria. AmpR: el gen que codifica para resistencia a ampicilina que
permite la selección de bacterias que poseen en el plasmidio en el
proceso de transformación. lacZ: gen que codifica a la enzima
betagalactosidasa pero que tiene un sitio de multiple clonamiento
(MCS) lo que hará que cuando algo sea clonado en este sitio no se
produzca la enzima. Esto permite el desarrollo de un medio diferencial
basado en la presencia funcional de este gen ya que en placas de agar
suplementadas con Xgal las colonias bacterianas que tengan el gen lacz
integro (nada clonado) serán de color azul, y aquellas colonias que
posean un fragmento clonado serán blancas por interrupción del gen
lacZ.
 
B) El gen yfg puede ser clonado utilizando las enzimas EcoRI y FseI
para mantener el sistema de discriminación lacZ. Esto debido a que las
otras enzimas generan cortes en otros sitios del plasmidio. De todas
formas también podria utilizarse EcoRi y SpeI aun cuando el sitio speI
no esté en el MCS.
 

C) El gen lacz codifica a la enzima betagalactosidasa pero que tiene un

sitio de multiple clonamiento (MCS) lo que hará que cuando algo sea
clonado en este sitio no se produzca la enzima. Esto permite el
desarrollo de un medio diferencial basado en la presencia funcional de
este gen ya que en placas de agar suplementadas con Xgal las colonias
bacterianas que tengan el gen lacz integro (nada clonado) serán de color
azul, y aquellas colonias que posean un fragmento clonado serán
blancas por interrupción del gen lacZ. De esta forma el fragmento
clonado debería estar en alguna de las 13 colonias blancas. Para
determinar el correcto clonamiento se puede: 1) purificar el plasmidio
desde cada clon obtenido y realizar un ensayo de digestión con enzimas
de restricción y/o 2) purificar el plasmidio desde cada clon obtenido y
realizar un PCR utilizando distinas parejas de partidores específicos ya
sea para el vector o el fragmento clonado (o una combinación de ambos
partidores).
  

● Pregunta 4
13 de 15 puntos

Usted ha identificado y asilado una variante del virus SARS-CoV-2. Para estudiarlo
decide realizar librerías genómicas y de expresión de manera de estudiar la proteína
”spike”. Detalle los principales pasos experimentales que seguiría para la construcción
de ambas genótecas, destacando la elección de los vectores y  celulas huesped (7.5
ptos) y la metodología de análisis de los clones para lograr identificar dicho gen en su
genoteca (7.5 ptos).  (15 ptos totales)

Respuesta para que podamos hace la libreria genomia, antes que todo hay que aislar
seleccionada: el DNA genomico, asi luego generar fragmentos de DNA usando las
enzimas de restriccion , y luego de hacer estp clonar con el sistema de
vectores adecuados, que en este lugar seria BAC para ppsteriormente
transfromarlo en un hospedador adecaudo, que seria una bacteria, la
metodoliga que se utiliza son sondas radioactivas
para hacer una libreria de expresion, para este caso de tipos de librerias se
usan mRNA como puntos de partidadonde debemos transformarlo a
cDNA para asi poder clonarlo y almacenarlo.El mRNA que ya
esta fragmentado se transformara en cDNA para poder clonarlo en un
sistema de vectores que corresponda, en este caso seria baacteriofago
para asi despues transformarlo en un hospedador adeuado, que seria una
bacteria , la metodologia que se utiliza es mediante el uso de anticuerpos.
Respuesta [Ninguna]
correcta:
Comentarios  
para respuesta:
Construcción librería genómica: Se extraería primero el material
genómico desde las particulas virales purificadas. Luego se
procedería a fragmentarlo mediante digestión con una enzima de
restricción de corte infrecuente y se ligaría a un vector previamente
digerido con la misma enzima. Debido a que es un genoma viral se
podría utilizar un vector plasmidial para construir la genóteca y como
hospedero se utilizaría la bacteria Escherichia coli. Seleccionando el
clonamiento gracias a un cassette de resistencia a antibiotico
codificado en el vector y de forma complementaria un sistema de
discriminación basado en el sistema azul/blanco del gen lacZ. Para
identificar el gen spike se podría realizar lo siguiente: 1) realizar un
experimento de hibridación de colonias con una sonda
radioactivamente marcada específica para una región interna del gen
que codifica la proteína spike. Primero se fijan las colonias a un
papel filtro y luego se procede a la permeablización de las celulas e
incubación con la sonda para finalmente exponer el filtro a un film
autoradiográfico para la identificación de los clones que poseen el
gen (o fragmentos) que codifica para spike.
 
Construcción de librería de expresión: Dos opciones: 1) se extraería
RNA viral de una células infectada por el virus o 2) de forma in vitro
se procedería a la expresión de dicho material genético. Una vez
obtenido el material genético se clonaría en un vector de expresión.
Lo mas útil seria un vector plasmidial (con un promotor que permita
la expresión) y un hospedero E. coli como en el caso anterior. Para el
análisis de spike se podría realizar un experimento utilizando la
estrategia del papel filtro pero ahora utilizando anticuerpos
especificos contra la proteína spike. Al ser una genoteca de expresión
esto podría realizarse. Alternativamente también se puede utilizar el
método de hibridación con sonda marcada utilizada en la
construcción de la librería genómica.
● Pregunta 5
15 de 15 puntos

 En lo referente a traducción en eucariotas, explique qué paso específico se vería afectado

en el hipotético caso de que los siguientes factores estuviesen ausentes. Explique su
respuesta (3 p c/u)
1) Pabp1; 2) eEF1A; 3) eIF4E; 4) eIF4G; 5) peptidil transferasa

Respuesta 1) si Pabp1 no estuviera presente, no se podria realiar la conexion de la

seleccionada: cola de poliA con elF4G, diciendo que si se forma esta cola de poliA el
mRNA esta integro, funcionaria como un control de calidad
2) si eEF1A no estuviera presente, no podria haber union del aa-tRNA
al sitio A del ribosoma.
3) si elF4E no estuviera presente, el complejo de elF4F ni tampoco el
factor elF4B podria unirse el cap del mRNA.
4) si elF4G no estuviera presente, no habria esa facilidad de adaptacion
en el complejo elF4F
5) sin la precensia de la peptidil transferasa no se podria hacer la
fromacion de losenlaces peptidicos a la hora de traducir el mRNA en
una proteina.
Respuesta [Ninguna]
correcta:
Comentarios Pabp1: Proteína que se une a la cola de poly A y, en su ausencia, no
para respuesta: se podría formar el asa que conecta el 3’ del mRNA con el CAP a
través del factor eIF4G. 
b) eEF1A: Responsable de llevar el aatRNA al sitio A durante el
proceso de la elongación, en el denominado complejo ternario (TC).
Por lo tanto, no habría elongación
c) eIF4E: Une al CAP, sin él no se podría iniciar la búsqueda del
codón de inicio por parte de la subunidad menor del ribosoma
según el modelo Kozak
d) eIF4G: Factor de inicio que sirve de andamio, entre otras
funciones y, que a través de él se conecta el extremo 3’ y 5’ del
mRNA, formando el asa cerrada. Por lo tanto, no habría traducción
 e) peptidil transferasa: Actividad enzimática llevada a cabo por el
rRNA 28S, presente en la subunidad mayor del ribosoma y, que es
responsable de generar el enlace peptídico en la proteína en
formación.

● Pregunta 6
1 de 10 puntos

Se preparó un experimento con la prueba Ames; se proporcionaron dos cepas para su

estudio: la cepa A tiene una única substitución de base, mientras que la cepa B muestra dos
mutaciones del marco de lectura. Las mutaciones de ambas cepas se encuentran en los genes
necesarios para sintetizar la histidina. Por lo tanto, las cepas mutantes no crecen en medios
que carezcan de este aminoácido. Se colocan células de cada cepa en placas de medio de
cultivo mínimo sin histidina y se exponen a los mutágenos indicados.
A) ¿Por qué se ven aparecer colonias en las placas de control? Proponer una explicación para
la diferencia observada entre las frecuencias de control de las cepas A y B. (4p)

b)A partir de los datos anteriores, sugerir si la luz UV, MMS y la 9-aminoacridina actúan
como mutágenos efectivos para cada cepa. ¿Qué indican estos resultados sobre los tipos de
mutaciones inducidas por cada uno de estos tratamientos? (6p)
Respuesta a) las bacterias que se usaron son auxotrofas, esto quiere decir que son
seleccionada: deficientes para producr algunas cosas , para el caso de estas bacterias es la
histidina.Estas bacterias son expuestas a mutagenos, si obtenemos como
resultado un aumento considerable de colinias, esto quiere decir que si,
efectivamente son mutagenos, para este caso se muetsra que si hubo un
aumento de bacterias,por lo que se podria dcir que estos mutagenos
recirtieeron el gen dañado, que seria el de no producir histidina.
b) en este caso ambas cepas se sguieren como mutageno efectivo la la UV 
yy como podemos observar la luz UV es el que tuvo un resultado mayor,
cual seria un agente fisico, estos tienen la capacidad de generr rupturas en
los cromosomas, y por otro lado los agentes quimicos son agnetes
intercalantes los cuales se pueden ubicar entre las bases del DNA y
logracomo distorcionar la zona del DNA 
Respuesta [Ninguna]
correcta:
Comentarios 1) Debido a la alta tasa de duplicación bacteriana, lo más probable es que
para respuesta: hayan aparecido revertantes naturales, que revierten la mutación que les
impedía crecer en ausencia de histidina. Y esto explica la aparición de una
 baja proporción de colonias en la ausencia del aminoácido. (la pregunta es
por las bacterias que crecen sin mutageno)
2) Sin duda que el más efectivo es aplicar luz UV por 10 segundos y tiene
una mayor incidencia en la cepa B, mutante que presenta alteraciones en el
marco de lectura, pero también es capaz de revertir las mutaciones de
sustitución de bases (cepa A).El MMS es más efectivo en inducir
mutaciones en la cepa A, lo que indica que es más propenso a generar
mutaciones de substitución de bases. La 9-aminoacridina, es más efectiva
en inducir mutaciones en la cepa B, lo que considerando, que está cepa
porta mutaciones del marco de lectura, sugiere que este agente induce
cambios en el marco de lectura.(Resp muy parcial, 1p)

● Pregunta 7
10 de 10 puntos

A continuación le mostramos un diagrama que muestra el patrón de restricción de un

plasmidio que ha sido cortado con las enzimas EcoRI (E), BamHI (B) y PstI (P) ya sea
en digestiones simples, dobles o triples.

Usted ha comenzado a reconstruir el mapa de restricción del plasmidio y ha llegado a

dos posibles mapas que difieren en la orientación del sitio de corte BamHI con respecto
a los sitios EcoRI (orientación 1 y orientación 2). Utilizando la información del mapa de
restricción de la figura indique y fundamente cual sería la orientación correcta del mapa
de restricción. (10 puntos)
 Respuesta la orientacion 2, ya que al realiar el mapa de restriccion en espacial de
seleccionada: todas las enimas de restriccion tal como dice en el diagrama y
podemosobservar que se froman 4 fragmentos
a) sw 1.5kb el cual se forma entre E y P
B) de1,0kb que se froma entre P y E
+ ambos fragmentos si lo sumamos dan un valor de 2,5kb que
corresponde a un solo fragmento con e. ( al cortar solo con E se obtienen
2 fragmentos uno con2.5 kb y otro con 3.8kb)
c) de 1.8kb que se obtienen entre E Y b 
d) de 2.0 kb que se obtienen entre B Y E ( el otro sitio donde corta E 
+ al sumar estos dos fragmentos obtenemos un valor de 3.8kb que
corresponden al otro cuando se coroto solo E.,
Respuesta [Ninguna]
correcta:
Comentarios para [No se ha dado ninguna]
respuesta:

● Pregunta 8
8 de 10 puntos

En referencia a las técnicas usadas en transcriptómica, como microarreglos y RNAseq,

explique: 
a) Tres características que deben tener los oligonucleótidos usados en microarreglos (3p
c/u)
b) ¿Cuál es el propósito primero, de fragmentar el RNA y segundo de agregar adaptadores
a los extremos 5’ y 3’ en el protocolo de RNAseq? (4p)
 c) En el contexto del análisis de la expresión génica: ¿Qué es un gen reportero y para que
se usa? (3p)

Respuesta a) Algunas caracteristicas que tiene que tener los oligonucleotidos usados
seleccionada: en microarreglos son: una longitud minima de 20-25 pares de bases y un
optimo de 46-60 pares de bases, para cada gen deben tener un minimo de
10 oligonucleotidos disitntos que lo reconozcan, el oligonucleotidos dene
ser unico en el genoma, esto quiere decir que hibridan con un gen y
tampoco debe existir soplamiento entre ellos.
b) fragmentar el RNA para quetengams mensajeros corto, y asi estos ener
mas probabilidad de sintetizar un fragmento completo, en los mas largos
se pueden observar fragmentos dentro de la secuencia que quedan sin
sintetizar 
c) estas son secuencias que codifican para proteinas que se peden lograr
detctar facilmente, se usan para reemplazar productos gnicos dificiles de
medir y determinar la actividad promotora
Respuesta [Ninguna]
correcta:
Comentarios a) 1) De al menos 20–25 bases en longitud, óptimo de 45~60 bases de
para respuesta: largo.
2) Sin sobrelapamiento entre ellos (Si la secuencia es muy corta,
especificidad baja, si es muy larga, ocurre auto-hibridación).
3) Composición de bases similar, esto asegura Tm similares.
4) 10 a 20 oligos diferentes por cada gen
5) únicos en el genoma
 
b) El propósito de la fragmentación del RNA es obtener una
población de moléculas de RNA de tamaño similar (aprox. 200b) que
será usada de molde para la síntesis del cDNA. Al ser una población
homogénea en tamaño, se favorece que la síntesis tenga la misma
eficiencia para cualquier secuencia presente en la población. El uso
de adaptadores en ambos extremos del RNA proporciona una
situación de homogenización de la población de RNAs, en la cual
todos ellos, independiente del largo y de la cantidad poseen los
mismos extremos. Esto asegura que, en el siguiente paso de
amplificación, la totalidad de los cDNAs presentes sean amplificados
de la misma manera. (Res parcial, 2p)
 
c) Un gen reportero se define como secuencias de DNA que codifican
para proteínas de detección simple (GFP, luciferasa,
Beta-galactosidasa) y son usados para determinar la actividad
promotora de genes difíciles de medir.
 

viernes 4 de diciembre de 2020 22H07