FACULTAD DE CIENCIAS

QUÍMICA FARMACÉUTICA

PRACTICA DE LABORATORIO

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Presentado por:
Valentina Barrera Sanchez
Valentina García Castro
Angie González Cobos
Karen Muñoz Vargas
Santiago Henao Rojas

Asignatura:
Biología celular y molecular

Docente:
Félix Giovanni Delgado Tiria

2021
Resumen

En esta práctica de laboratorio se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), esto
con el fin de comprender las bases teóricas de esta técnica, reconociendo los reactivos que se deben
emplear en cada reacción y entender el uso correcto del termociclador, implementandolo
correctamente a la PCR. Para esto se realizó un control positivo y negativo con dos 2 microtubos,
posteriormente se dio inició a la serie de ciclos de 3 reacciones sucesivas, la desnaturalización en la
cual se ajusta a una temperatura de 93 a 95°C para el ADN genómico, seguido del alineamiento, a una
temperatura variable entre 45 a 65°C de acuerdo con la Tm de los cebadores y por último la
polimerización de manera característica alrededor de 70 a 75 °C, una temperatura óptima a la cual
trabaja la enzima. Adicionalmente, se realizó una electroforesis para comprobar la eficiencia de la
reacción en cadena de la polimerasa. Por lo tanto, de la presente práctica se concluye que se deben
tener en cuenta varios factores de alta importancia que pueden afectar el proceso, como lo es el uso de
cebadores puesto que estos permiten definir la región amplificada de ADN; además el buen manejo de
los reactivos requeridos para llevar a cabo la reacción, ya que esto influye a la optimización del
proceso y la identificación correcta del ADN.

Palabras Clave: enzima, AND, cebadores, PCR, desnaturalización.

Metodología
Cuestionario
1.¿Por qué los cebadores o primers tienen entre 20 y 30 nucleótidos de largo?

Los cebadores son secuencias cortas de ADN de cadena simple que tienen la función de hibridar con
el ADN que está presente en la muestra y definir la región del ADN que será amplificada (National
Human Genome Research Institute, 2019). Dichas secuencias generalmente constan de 18 a 25
nucleótidos de largo, sin embargo se ha descrito que idealmente se usaría una secuencia de 20-30
nucleótidos de longitud, con el fin de obtener el mejor tamaño posible e híbridos que cuenten con
mayor estabilidad con la molécula que sirve como plantilla o molde (Sanz, 2016).

2.¿Por qué la temperatura de alineamiento depende de la secuencia de los cebadores?

La temperatura de alineamiento depende de la secuencia de los cebadores dado que cada pedazo
sintetizado sirve como base para sintetizar otros en el siguiente ciclo por lo cual es necesario que uno
de los oligonucleótidos tenga la misma secuencia que se encuentra en una de las cadenas del ADN y
el otro deberá llevar la secuencia complementaria que estará al final del fragmento que se quiere
amplificar, además la concentración, el número de bases y el porcentaje de guaninas-citosinas, serán
de vital importancia en la fase de alineamiento y definirán la temperatura y tiempo, los cuales sí
presentan un aumento favorecerá la especificidad porque disminuyen las uniones incorrectas de los
iniciadores con la hebra molde.
3.Explique por qué la longitud precisa de la secuencia de ADN molde no llega a ser amplificada hasta
el tercer ciclo. Realiza un dibujo que explique tu respuesta.

El ciclo “desnaturalización-templado-extensión” genera una copia de cada hilo en una base

exponencial dada por 2n donde n es el número de ciclos (fig.1), de modo que no es sino hasta el tercer
ciclo (fig.2) donde la longitud precisa de la secuencia de ADN molde no llega a ser realmente
amplificada, Eso es porque no solo se usa el ADN original como molde en cada ciclo. En realidad, el
nuevo ADN que se produce en una ronda puede servir como molde en la siguiente ronda de síntesis de
ADN.

Figura 1. Resultados después de un ciclo

 Figura 2. Crecimiento exponencial del ADN duplicado a partir del tercer ciclo

Resultados

● Resultados obtenidos por PCR

Figura 3. Control positivo Figura 4. Control negativo

Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa con base en control negativo y positivo

Discusión

Se realizó un análisis de amplificación para la β-actina, la cual participa activamente en la formación

de microfilamentos del citoesqueleto, para esto se lleva a cabo un control positivo en el cual se
incluye el DNA extraído y purificado con una concentración de 228.40 ng/μL, en el que se
adicionaron 1.727 μL para obtener 100 ng de ADN de la reacción y un control negativo en el cual no
se adiciona el DNA. Este DNA purificado va actuar como DNA molde, una enzima polimerasa
termoestable como es el caso de la Taq polimerasa (proveniente de la bacteria Thermus aquaticus, con
una temperatura óptima alrededor de los 95°C). Con estas condiciones se realizó inicialmente una
ruptura de los puentes de hidrógeno presentes en la cadena de ADN, ya que manteniendo dichas
condiciones se genera una desnaturalización de la molécula permitiendo llevar a cabo la amplificación
en la cual van a intervenir los cebadores que se encargan de marcar la secuencia de interés en donde se
dará la reacción con la polimerasa.[1]
Por otra parte, el ADN se extrae por completo y se amplifica la región de la β-actina para tener un gen
con 150 pares de bases, mediante PCR utilizando cebadores 5 '50 μM y 3' 50 μM. El cebador 5’
consta de dos nucleótidos terminales no específicos requeridos para que se enganche mejor la enzima
de restricción. El cebador 3’ consta de 25-30 nucleótidos específicos en la región 3’ codificante. Para
dicha amplificación se llevan a cabo 35 ciclos, del cual se obtienen, por cada molécula de ADN
inicial, 70 copias de una longitud de 150 pb cada una.
Luego de amplificar la región se hace correr por electroforesis en gel de agarosa, el cual permite
separar moléculas desde 50 pb hasta 40 pb. Los geles se tiñeron con una tinción en gel, la cual es una
molécula cargada positivamente que, al estar en solución sin unirse al ADN de doble cadena, no emite
fluorescencia, esta es la razón por la cual no se observa ninguna banda del control negativo al llevarlo
al transiluminador UV. Esta tinción tiene una alta afinidad por el ADN de doble cadena, se intercala
entre los pares de bases, además, implica reacciones de oxidación que generan una señal fluorescente.
La fluorescencia emitida es capturada en la etapa de extensión de cada ciclo que es proporcional al
número de copias de ADN de doble cadena obtenidas en cada ciclo del PCR. Los fragmentos de ADN
se visualizaron en el transiluminador UV como se observa en la figura 5, el ADN se sembró en los
pozos y por electroforesis se aplica corriente eléctrica (100 V) que permite que el ADN migre del
negativo al positivo y se separa según el tamaño de las moléculas , estas operaciones se pueden
observar cuando el tinte cambia de color verde a amarillo, este cambio indica el frente de corrido, aqui
se puede ver el ADN amplificado en el transiluminador UV, para su posterior caracterización. [2]

Conclusiones
-El uso de cebadores es de gran importancia para llevar a cabo la reacción debido a que presentan una
gran capacidad de proporcionar una unión específica y firme a las secuencias complementarias de
DNA, en donde estas secuencias de hibridan con el DNA presente en la muestra con el fin de definir
la región amplificada de la molécula de ADN.

-El buen manejo de los reactivos es fundamental para la óptima realización de la práctica ya que en el
caso del gel el cual ayuda a la identificación de la muestra con presencia de ADN al no agregar la
cantidad correcta dificulta la visualización de la muestra presente lo cual podría presentar un falso
negativo

Bibliografía

[1] Blázquez, R. (2016). BIOLOGÍA MOLECULAR. Departamento de genética Universidad de

Granada. Recuperado de:
http://www.ugr.es/~rmblazquez/pcr1.html#:~:text=Cloruro%20de%20Magnesio%3A%20Se
%20utiliza,la%20polimerasa%20no%20funcionar%C3%A1%20correctamente
[2] Tamay de Dios, L., Ibarra, C & Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real. Investigación en discapacidad, 2(2), 70-78.
[3] Pérez, G. D. (2006). Amplificación de DNA mediante PCR (Reacción en Cadena de la
Polimerasa). Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, 18.
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/44 PCR.pdf
[4] Espinosa, L. (2007). Guía práctica sobre la técnica de PCR 517 Guía práctica sobre la técnica de
PCR. Ecología Molecular, 517–536. http://www.publicaciones.inecc.gob.mx/libros/530/cap17.pdf
[5] Larrachea, E. (1997). Reacción en cadena de la Polimerasa. Revista Chilena de Neuro-Psiquiatría,
35(2), 247–249.
[6] National Human Genome Research Institute. (2019). Iniciador o cebador. Obtenido de:
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Iniciador-o-cebador
[7] Sanz, J. (2016). Técnicas de amplificación, fundamento teórico, PCR. Obtenido de:
https://www.seap.es/c/document_library/get_file?uuid=153e8941-e2ee-4032-9b68-b0
408ff3ed67&groupId=10157