INGENIERÍA GENÉTICA

Ingeniería genética: Tecnología de la manipulación y transferencia del ADN de unos

organismos a otros, que posibilita la creación de nuevas especies, la corrección de
defectos génicos y la fabricación de numerosos compuestos útiles.
DNA RECOMBINANTE
La ingeniería genética se basa principalmente en la tecnología del DNA recombinante,
que significa

 Combinar el DNA de un organismo dentro de otro organismo

 Inicialmente fue desarrollado en bacterias, actualmente se puede utilizar
organismos superiores (plantas, mamíferos)
 El proceso de la tecnología del DNA recombinante, es más fácil en bacterias y se
maneja in-vitro, es más la mayoría de los procesos de generar organismos
recombinantes, primeramente, se desarrolla en bacterias las herramientas para
después proceder a la transformación de los
organismos superiores
En líneas generales, está compuesto de:
 Un plásmido, el cual es cortado por una
enzima de restricción
 Un ADN foráneo, el cual también es cortado
por la misma enzima de restricción
 Posteriormente se incuba el plásmido con el
ADN foráneo en presencia de una enzima ligasa,
donde se incorpora el ADN foráneo dentro del
plásmido, que después es introducido dentro de
una bacteria
Por lo tanto, se tiene 2 componentes básicos en la
generación del ADN recombinante, los cuales son las enzimas de restricción y los
plásmidos
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Son enzimas que cortan secuencias de ADN, que cortan en regiones específicas
reconocidas por la enzima, que generalmente están constituidas por palíndromos
(secuencias que
pueden ser leídas de la
misma manera en
ambos sentidos)
EJEMPLO → la enzima
reconoce la secuencia
5’- GAATTC - 3’// 3’ -
CTTAAG -5’ (secuencia
palindrómica); la
enzima de restricción
 reconoce estos palíndromos y los corta. Puede cortar de 2 maneras diferentes:
 La enzima Alu l reconoce a la secuencia AGCT//TCGA, la corta exactamente en el
medio, generando extremos ROMOS, ya que están en formato de doble hebra los
extremos del sitio del corte
 La enzima BamH 1 corta de manera asimétrica, cortando en los extremos de la
secuencia, generando extremos de simples hebras que se denominan extremos
COHESIVOS. Estos extremos de simple hebra son útiles ya que permiten unir
fácilmente dos secuencias de ADN para poder generar el ADN recombinante.
Existen enzimas que reconocen diferentes tamaños de secuencias; por ejemplo, la
enzima Alu 1 reconoce 4 nucleótidos y sin embargo la enzima BamH 1 reconoce 6
nucleótidos
 Las enzimas que reconocen 4 nucleótidos son denominadas de alta frecuencia;
porque una secuencia de 4 nucleótidos es altamente repetida en el genoma, y
generalmente no se utilizan para las técnicas de ADN recombinantes, sin embargo,
tiene otras utilidades
 Las enzimas que reconocen 6 o más nucleótidos son los que se utilizan para cortar las
secuencias para la
técnica de ADN
recombinante
Existen diferentes tipos
y un gran mercado
asociado a las enzimas
de restricción, debido a
las múltiples
combinaciones de
secuencias que pueden
ser reconocidas
también existen
múltiples enzimas
capaces de reconocer
diferentes secuencias.
Estas tablas anteriormente eran comunes, donde se veían los diferentes tipos de
restricción, la secuencia que cortaban y las diferentes condiciones en las cuales hacían
la restricción; debido a la variabilidad actualmente estos datos son capaces de obtenerse
a partir de una base de datos, en donde se pone la secuencia y aparecen las enzimas
disponibles, si cortan romo o cohesivo.
EJEMPLO
BamH 1 → es una enzima que reconoce la secuencia 5’- G GATCC - 3’// 3’- CCTAG G - 5’
Bgl 11 → es una enzima que reconoce la secuencia 5’- A GATCT - 3’// 3’- TCTAG A - 5’
Estas enzimas cortan secuencias diferentes, pero cortan de manera simétrica,
generando extremos cohesivos, sin embargo, los extremos cohesivos terminan siendo
los mismos “GATC”, por lo tanto, es posible unir los fragmentos que fueron generados
con estas enzimas.
 ADN 1 que fue cortado por la enzima BamH 1
en esta condición corta en G GATCC
ADN 2 que fue cortado por la enzima Bgl 11 en
esta condición corta en A GATCT
Al unirse estos 2 fragmentos, interaccionan a
través de los extremos cohesivos GGATCT //
CCTAGA, permite esta interacción que
estabiliza a esta molécula para que luego una
enzima haga la unión entre las GG y GA; al
generar esta unión, este sitio no va a ser
reconocido por ninguna de las enzimas de
restricción, ya que no tiene el consenso para
BamH 1 (que reconoce la secuencia GGATCC, y la otra secuencia presenta GGATC)1 y
tampoco para Bgl 11 (que reconoce la secuencia AGATCT, y la otra secuencia presenta
AGATCC). Entonces lo que ocurre en esta situación es que es posible unir fragmentos
cortados con las enzimas de restricción, pero el sitio de restricción desaparece.
PLÁSMIDOS

Es un DNA de doble hebra que tiene un origen de replicación bacteriana.

Esto significa que, si introduzco el plásmido dentro de una bacteria, debido a que
presenta el origen de replicación (ori) habrá múltiples copias del plásmido que se
realizará dentro de la bacteria, y cuando la bacteria se divida va a generar que las
bacterias hijas van a tener el plásmido, por lo tanto, el ADN plasmidial va a ser fácilmente
reproducido dentro de una bacteria generando múltiples copias del mismo que sean
fáciles de aislar y obtener (mediante la técnica de mini-prep)
El plásmido más clásico que es el pBR322, creado por Borier; mediante la presencia del
ori que es capaz de permitir la multiplicación del plásmido; también es deseable que
presente un casete de resistencia, porque cuando se introduce el plásmido dentro de la
bacteria, en donde algunas bacterias van a presentar el plásmido y otras no (no al 100%
de las bacterias se les introduce el plásmido), con el casete de resistencia a ampicilina
(amp), le agrego el antibiótico ampicilina y solo van a vivir aquellas bacterias que tengan
el plásmido, y a esto se denomina SISTEMA DE SELECCIÓN POSITIVA. Entonces aquellas
bacterias que tengan el casete de resistencia para ampicilina van a crecer en cultivos
con ampicilina, y de esa manera se obtendrá la bacteria con el plásmido presente.
El plásmido pBR322 presenta dos casetes de resistencia uno a ampicilina (amp) y otro a
tetraciclina (tet).
También presenta
diferentes sitios de
corte para poder
introducir el ADN
foráeo de interés,
por ejemplo, un sitio
de corte para la
enzima de
restricción Nde 1, Pst
1. EcoR 1, Hind 111,
EcoR V, BamH 1, Sal 1
 Si se introdujera el material genético en el sitio de corte entre EcoR 1 y Hind 111 (se
corta un extremo con EcoR 1 y otro extremo con Hind 111) se podrá insertar el
fragmento, donde el plásmido tendrá resistencia a ampicilina y tetraciclina.
Si no se puede utilizar por alguna razón EcoR 1 y Hind 111; y se debe utilizar Hind 111 y
BamH 1, se corta entre esos extremos, se extra ese fragmento y se introducirá el
fragmento entre Hind 111 y BamH 1, lo que ocurrirá es que se va a perder un pedazo del
casete de tetraciclina y por lo tanto la bacteria no va a ser resistente a tetraciclina.
Casos particulares → en un plásmido puede ocurrir una recombinación e insertarse en
el genoma y de esa manera se pierde (el plásmido se recombina con el genoma, se
introduce en el genoma y se pierde), se realiza una mini-prep a la bacteria, pero ya no
se recupera más el plásmido porque se encuentra integrado al genoma.
Actualmente las bacterias que se utilizan para ingeniería genética son mutantes,
normalmente tienen el sistema de recombinación inactiva, por lo tanto, esto es un
fenómeno que no ocurre, pero en ciertos casos puede ocurrir en las bacterias.
CORTAR Y PEGAR
Normalmente se tiene un plásmido que se corta con una enzima de restricción
Se tiene un ADN foráneo que se quiere introducir, generalmente es un genoma, el cual
se introduce algún gen de interés que se
corta con la enzima de restricción, que
genera extremos cohesivos que van a
interactuar por complementariedad de
bases, una vez interactuados los extremos
una ligasa se encarga de cerrar esos
enlaces; se introduce el ADN dentro de
una bacteria, en donde finalmente
tendremos una bacteria con su propio
genoma más el gen foráneo.
PASOS
1. Obtener el plásmido de bacteria
Tener el plásmido de la bacteria, lisar y
obtener el plásmido
2. Cortar DNA plasmidial
Cortar el DNA con una enzima de restricción
3. Cortar DNA foráneo de interés
Cortar el DNA con la misma enzima de restricción o una que genere extremos
compatibles
4. Combinar las piezas mediante EXTREMOS COHESIVOS. Ligar
Mezclar los 2 productos, dejar que los extremos cohesivos interactúen entre sí;
posteriormente actuará la ligasa que se encargara de ligar y cerrar estas uniones,
generando uniones covalentes
Introducir el DNA recombinante en la bacteria
Este ADN recombinante generado es introducido en una bacteria
6. La bacteria tendrá genes foráneos
Posteriormente la bacteria tendrá genes foráneos en su interior
CORTAR Y PEGAR NO ES SUFICIENTE
Si bien el plásmido tendrá los sitios de corte de restricción (sitio de interés).
Normalmente el ADN foráneo no tiene esos sitios de corte ubicados en los sitios de corte
de interés; es extremadamente raro que se obtengan los sitios de corte de restricción
en el lugar donde los necesita. Por lo que se busca estrategias para poder introducir esas
secuencias correspondientes a los sitios de corte de las enzimas requeridas para poder
realizar el clonamiento; en este caso se utiliza la técnica de PCR.
Esta técnica es un proceso para amplificar y generar múltiples copias del ADN.
En donde tenemos primeramente un proceso de desnaturalización; donde se abre la
doble hebra; se insertan los primers (cebadores o partidores), que se unen a una
secuencia específica que flanquea la región que se quiere amplificar; luego la ADN-
polimerasa se encarga de extender a los primers siempre desde el extremo 5’→3’,
posterior a la extensión de los primers se generará 2 copias del mismo ADN, que se
replicará en múltiples ciclos, obteniéndose múltiples copias de ADN.
¿CÓMO INTRODUCIMOS LA SECUENCIA DEL SITIO DE CORTE DE LA ENZIMA DE
RESTRICCIÓN EN EL PRODUCTO QUE QUEREMOS AMPLIFICAR Y QUE
POSTERIORMENTE SERÁ INTRODUCIDO EN EL PLÁSMIDO?
La polimerasa requiere siempre para poder polimerizar necesita de un extremo 3’-OH;
entonces, se tiene
la secuencia
complementaria
del gen interés, y en
la región 5’ se mete
una secuencia que
corresponda al sitio
de corte de la
enzima de interés
(se realiza tanto
con el primer 5’ y
3’), de esta manera
se va a amplificar, se copiaran los ADN, pero esos productos generados van a tener los
sitios de corte en los extremos 5’ en ambos casos. De esta manera en el siguiente ciclo,
cuando se vuelva a dar la amplificación se irá replicando y se obtendrá un producto de
pcr el cual será en el extremo 5’ de ambas hebras tendrán el sitio de corte, pero al
copiarse en los extremos 3’ de ambas hebras también tendrán el sitio de corte
correspondiente a cada primer; de esta manera se obtendrá en formato de doble hebra
los sitios de corte posteriormente pueden ser cortados por la enzima de restricción.
De esta manera se puede introducir sitios de corte exactamente en el lugar que se quiera
para poder generar el ADN foráneo que se introducirá dentro del plásmido.
IMPORTANTE RECORDAR....si queremos producir una proteína de interés solamente
con un ADN foráneo o la secuencia codificante de un ADN foráneo no es suficiente,
tenemos que tener todo un sistema para poder expresarlo, que requiere de promotores,
secuencia codificante, terminadores y otros factores más.
 SISTEMAS DE
EXPRESIÓN
PROCARIONTES
PLÁSMIDOS DE
EXPRESIÓN EN
BACTERIAS
Sistema p-GEX es un
típico plásmido de
expresión para
producir proteínas en
bacterias. Como todo
plásmido tiene un
origen (ori) de
replicación (pBR322),
un casete de
resistencia en este
caso es ampicilina (Amp) y un casete o región para poder expresar la proteína. Mediante
un promotor, en este caso el sistema p-GEX tiene un promotor que se denomina Ptac
(es un híbrido que tiene una región -35 en triptófano y la de -10 del promotor lac); al ser
un derivado del promotor lac tiene un sistema de represión que se reprime por una
proteína denominada lacI. ¿Porque se tiene un sistema regulado de la expresión de
proteínas? supongamos la expresión de una proteína heteróloga en una bacteria es un
problema para la bacteria porque gasta energía para introducir una proteína que la
bacteria no le sirve y le afecta para crecer y en sus actividades metabólicas; por lo tanto,
la mayoría de los sistemas de expresión en bacterias son sistemas regulados en los que
se reprime o inhibe la expresión de la proteína recombinante hasta llegar a que la
bacteria pueda crecer de manera natural y producir gran cantidad de biomasa; una vez
obtenida una gran cantidad de biomasa lo que se hace es activar ese sistema de
expresión para producir la proteína recombinante y producir grandes cantidades de
proteína, posteriormente la bacteria se termina lisando y purificando la proteína.
Entonces, el promotor Ptac tiene un sistema por el cual reprime la expresión del
transgen, hasta que uno quiera activarla a través de IPTG.
Tenemos el promotor Ptac, en alguna de esas regiones debe encontrarse el gen de
interés; en este caso, este sistema tiene una secuencia codificante de una región de una
proteína que se denomina “glutatión S-transferasa” (importante para producir la
proteína y purificarla); posteriormente a esta secuencia se encuentra una región
denominada “sitio de múltiple clonamiento”, en esta región hay una serie de cortes de
enzimas de restricción los cuales permiten cortar para introducir el gen de interés
(cuando se habla de plásmidos de expresión, es importante introducir la secuencia en el
lugar apropiado, o sea río abajo del promotor) además no solamente es necesario
introducir la secuencia si no que tiene que tener un sentido, sabiendo que el mRNA se
producirá a partir del promotor por lo tanto la secuencia codificante se debe encontrar
en ese sentido (si se la inserta al revés se produciría cualquier proteína menos la de
interés)
Función de la secuencia codificante de la región glutatión S-transferasa → suponiendo
que se inserte la secuencia codificante de la proteína de interés entre los sitios BamH 1
y EcoR 1, cuando se transcriba se producirá una proteína quimérica que estará
 compuesto en su N-terminal por las secuencias codificantes del glutatión S-transferasa
y posteriormente la proteína de interés, y esto es extremadamente útil para purificarla.
¿CÓMO FUNCIONA EL SISTEMA?
 Columnas con glutatión-sefarosa: tiene columnas con unas perlas de sefarosa
asociadas a glutatión.
 Posteriormente se va a producir la proteína de interés: una proteína quimérica que
en un extremo va a tener al glutatión S-transferasa y en la otra va a tener mi proteína
de interés, además va a tener otras proteínas que corresponden a proteínas de E.Coli
que no son las proteínas de interés. Entonces se introduce todo el lisado celular en
la columna las proteínas de fusión (como se tiene este dominio

glutatión-S-transferasa) va a interactuar con glutatión y las proteínas que no son la

proteína recombinante van a pasar de
largo, entonces se puede purificar por
afinidad a la proteína de interés.
 Una vez que hecho esto y eliminado el
resto de las proteínas celulares, se
agrega una proteasa la cual está
acoplada a glutatión-S-transferasa, es
una proteasa que casualmente reconoce
una secuencia que está justo entre
glutatión-S-transferasa y el gen de
interés para cortar

 Entonces esta “PreScission Protease”

corta en ese lugar y libera la proteína de
interés. Entonces se une, corta y libera la
proteína de interés, y además, como
tiene al glutatión-S-transferasa acoplada
a esta proteasa, se va a pegar
nuevamente al glutatión y por lo tanto
voy a poder purificar la proteína de
interés
No es solamente un plásmido con un
promotor para poder producir una proteína
recombinante, sino que es todo un sistema
de regulación (para regular la expresión) y además un sistema de purificación.
 ¿CÓMO FUNCIONA EL SISTEMA
DE REGULACIÓN DEL
PROMOTOR Lac?
El promotor {puede ser el
promotor lac específicamente o
algún promotor híbrido como el
Ptac (promotor-tac)}. Lo
importante es que tenga un
sitio lac u operador lac.
En presencia del gen lac I
(presente en el plásmido
anterior) se produce una
proteína que es el represor, que
va a unirse al sitio lac, entonces
al unirse al sitio lac (cuando se
una al RNA polimerasa) va a chocar contra este represor y no va a permitir la expresión
del gen. Se empieza a producir el mensajero en donde se tiene el sitio de unión al
ribosoma (RBS) y el ATG para el inicio de la región codificante.
En estas condiciones, el gen está apagado, se producirá grandes cantidades de proteínas
y no se va a producir el gen de interés y va a molestar para producir la biomasa. Sin
embargo, posteriormente se agrega lactosa o un análogo de lactosa (IPTG), eso provoca
que interactúe esta lactosa o el IPTG (que es un análogo de mayor afinidad) por el
represor lac, produciendo un cambio de conformación que hace que ya no se una más
al operador lac o al sitio lac y cae el represor. Entonces, en esas condiciones la RNA
polimerasa ya no se ve bloqueada y lo que hace es transcribir y producir el gen de
interés. De esa forma tenemos un sistema que funciona para prender y apagar; que se
encuentra normalmente apagado, cuando se agrega IPTG el represor cae y se activa la
trascripción de los genes.
El sistema lac, a pesar de que funciona muy bien y es ampliamente utilizado, no es 100%
efectivo para inhibir la expresión de proteínas en ausencia de IPTG, siempre produce
una pequeña cantidad de la proteína transgénica. Entonces, a fin de mejorar el sistema,
porque muchas proteínas, aunque se expresen en muy poca cantidad, pueden ser
tóxicas o perjudiciales para las células y afectar la producción de biomasa, se ha
generado el sistema t7/lac.

SISTEMA T7/LAC
Este sistema consta de los plásmidos PET y de las bacterias bl-21 con el sistema DE-3. En
este sistema, el gen de interés no se encuentra bajo el control de un promotor lac, se
encuentra bajo el control del promotor T7. En el genoma de la bacteria, tenemos el gen
lac I que produce el represor lac, además tenemos el cassette DE3 que tiene el promotor
lac acoplado al gen que codifica para la polimerasa de fago T7.
¿QUÉ ES LO QUE OCURRE?
Tanto en el promotor lac
como en el promotor T7
también tiene sitios de
operador lac donde se une
el represor lac;
Si el sistema se encuentra
apagado; ocurre que en
muy baja cantidad se puede
unir la polimerasa, y
producir la polimerasa del
T7, esta polimerasa es capaz
de unirse al promotor, pero
como se encuentra también
este operador, el represor en el operador evita la producción del transgen. Entonces
cuando el sistema está apagado no se produce ninguna proteína, además, cuando uno
le agrega el IPTG, éste represor cae y se activa la transcripción del promotor lac, y
produce la polimerasa del T7, ésta se une al promotor T7 y aquí tampoco va a estar el
represor lac, va a caer y puede expresar el gen.
Es importante notar que está estrictamente reprimido el sistema por la presencia del
represor lac; al tener la presencia de lacI tanto en el genoma como en el plásmido PET
en donde se introduce el gen de interés. Hay que notar que a su vez como es
extremadamente estricto y vital la expresión basal de las proteínas recombinantes igual
no es 100% eficiente, entonces, si aplico un tercer componente del sistema, que es el
plásmido pLysS o E, que produce una encima que se denomina lisozima del T7, la cual es
capaz de unirse a esta t-RNA polimerasa e inactivarla. Entonces cuando el sistema está
apagado se producen pequeñas cantidades de polimerasa que otra vez son secuestradas
por este sistema de la lisozima t7 y la vuelve inactiva; y se queda nuevamente un poco
reprimido por el represor lac, sin embargo, cuando cae el represor lac en los dos
sistemas produce grandes cantidades de T7; cuando las cantidades de lisozimas no son
suficientes para inhibir a toda la polimerasa de T7 producida, eso provoca que se exprese
el gen de interés. Es un sistema bastante complejo el cual busca de múltiples formas
reprimir la expresión basal del gen a fin de poder tener una cantidad de biomasa
suficiente para llegar al punto en el cual se activa la expresión agregando
fundamentalmente IPTG.
PLASMIDO DE EXPRESIÓN DEL SISTEMA Pet-22b (+)
Como todo plásmido tiene un origen de replicación, un casete de resistencia a
ampicilina, una secuencia codificante para el represor lac (que se denomina lacI),
además tiene un origen de replicación de fago que sirve para producir fagos que tienen
en su genoma DNA de simple hebra y es una forma de obtenerlo; los plásmidos nuevos
no tienen tantos, pero los plásmidos antiguos siguen utilizando el origen de replicación
f1; además, tiene el casete para la expresión a partir del promotor T7.
Primeramente, se tiene el promotor T7 y posteriormente el operador lac, luego ya un
sitio de corte Xba 1 que se podría cortar en la región () pero eso va a producir dos
problemas; después se encuentra el sitio de unión al ribosoma (la secuencia rbs) para
que ocurra la traducción.
 Luego se
encuentra un
sitio Nde 1,
después esta la
secuencia que se
denomina pelB,
(antes de pasar al
pelB en el sitio Nde se encuentra el ATG, la metionina 1, a partir de aquí se empieza a
traducir) y que se va a producir hasta acá, una secuencia líder denominada pelB, esta
secuencia permite que cuando se produzcan las proteínas, sean transportadas hasta la
membrana y sean secretadas al periplasma, esto es muy importante porque permite (en
el periplasma hay ciertas enzimas que hacen modificaciones post-traduccionales) la
formación de puentes de disulfuro. Aquí está exactamente el sitio de corte, donde se
corta y se escinde el péptido señal, posteriormente una serie de aminoácidos que son
de unión, y se tiene el sitio de múltiple clonamiento donde están las enzimas BamH 1,
EcoR 1, Sac 1, Sal 1, Hind 3, Eag 1 Not 1, Ava 1 y Xho 1. Y posteriormente se tiene una
secuencia denominada His*Tag o cola de histidina (permite poner 6 histidinas al final de
la secuencia). Veremos que esta cola de histidina es bastante importante, porque
permite la purificación de la proteína producida. Posteriormente al final de la cola de
histidina está el UGA o codón de STOP donde determina el término de la traducción.
Posteriormente también se encuentra el terminador de la transcripción del T7.

SISTEMA DE PURIFICACIÓN CON HISTIDINA

Todas las proteínas producidas

con el sistema PET van a producir una proteína quimérica que va a tener en el extremo
C-terminal la cola de histidina. Esta histidina es capaz de interaccionar con el níquel y
formar un complejo, normalmente se tiene este complejo con níquel adosadas a perlitas
de sefarosa; de esa forma hacer columnas que tengan níquel y posteriormente se le
agrega la proteína a través de la interacción de las histidinas con el níquel. Las proteínas
recombinantes van a quedar adheridas a la columna, las otras proteínas bacterianas van
a pasar de largo, y posteriormente lo que se hace es agregar un exceso de imidazol para
poder romper esta interacción y poder liberar la proteína de interés. Entonces se
obtendrá la proteína de interés, o la proteína recombinante más mucha imidazol en
solución, lo cual se puede purificar fácilmente por diálisis. De esa forma se obtiene la
proteína recombinante pura por el método de purificación del sistema His Tag.
 PROMOTORES
BACTERIANOS

Existen varios
promotores
bacterianos, por
ejemplo, el promotor
lac que es regulado por
IPTG; luego el
promotor lac UV5 que
es otra variante del
promotor lac (el ptac),
y una serie de
promotores. Todo esto
es regulado por IPTG, pero también existen promotores que reaccionan a otra clase de
sistemas, como por ejemplo el ara BAD responde a la arabinosa, el rha BAD responde a
ramnosa(no se utiliza IPTG sino que para que caigan los represores se utilizan inductores
como la arabinosa y la ramnosa o inclusive algunos que dependen de tetraciclinas
también).
Por lo tanto, existen varios tipos de promotores y uno va seleccionando según el interés
que quiera, muchas veces uno quiere expresar dos proteínas al mismo tiempo y
entonces lo que hace es utilizar uno bajo el control de la arabinosa y otro bajo el control
de IPTG
VENTAJAS DEL SISTEMA DE EXPRESIÓN BACTERIANO

 Lo primero es que son muy fáciles de manejar

 El cultivo es relativamente barato
 Existen muchas herramientas para la producción de proteínas (existen muchos
vectores de expresión, muchos sistemas de regulación muchas variedades de E.Coli
con diferentes características que pueden favorecer la expresión de proteínas por
ejemplo la bl-21 – DE3 con el sistema t7.
 Funciona muy muy bien para proteínas intracelulares
Es de fácil manejo para expresar al menos en pequeñas cantidades una proteína en
bacteria, lo único que necesitás es un mechero, un agitador y un par de erlen.
PROBLEMAS DE EXPRESIÓN EN BACTERIAS

 Probablemente el mayor problema que uno tiene cuando expresa proteínas en

bacterias son las modificaciones post-traduccionales, porque si bien, la bacteria
hace ciertas modificaciones, no hace todas las modificaciones post-traduccionales
que hace una célula eucarionte, entonces si se quiere expresar una proteína
eucarionte en bacteria es un problema. Las proteínas eucariontes, normalmente las
modificaciones post-traduccionales ocurren en el retículo endoplasmático y en el
aparato de Golgi, por lo tanto, generalmente las modificaciones post-traduccionales
ocurren en proteínas que son normalmente secretadas.
 Otro problema muy común es el uso de t-RNA poco frecuentes
 Problemas con proteínas secretadas; más o menos el 50% de las proteínas humanas
van a retículo endoplásmico, son secretadas y ahí sufren diferentes modificaciones,
entre ellas la formación de puentes de disulfuro. Si bien, los puentes de disulfuro
son un problema, éste puede ser abordado porque ocurre en la bacteria en el nivel
del periplasma, entonces si uno le pone una secuencia líder como la pelB, permitiría
poder solucionar el problema del puente de disulfuro. Pero existen otras
modificaciones como son las glicosilaciones que no es posible hacerlas en bacterias,
entonces una proteína, que para su función requiere ser glicosilada, no sería lo ideal
hacerlo en un sistema bacteriano.
 También está el problema que las proteínas no se pliegan correctamente, esto es
nuevamente aplicada a proteínas secretadas, el ambiente del retículo
endoplasmático para el plegamiento no es similar al ambiente del citoplasma, por
eso cuando se habla del citoplasma de una célula eucarionte es relativamente
similar al de una célula procarionte, por eso cuando se habla de proteínas
intracelulares en líneas generales funciona bastante bien las bacterias. Sin embargo,
no tiene nada que ver el ambiente del retículo endoplásmico con el ambiente que
tenemos en el citoplasma, ya sea de una bacteria o de una célula eucarionte,
entonces si uno expresa una proteína que normalmente es secretada en un
ambiente como el citoplasma de una bacteria generalmente tienden a plegarse mal,
y muchas veces cuando se pliegan mal lo que ocurre es que ciertas regiones
hidrofóbicas quedan expuestas y se forman unos agregados proteicos que
normalmente se denominan cuerpos de inclusión. Estos cuerpos pueden ser vistos
como ventaja o como desventaja. Son una desventaja porque se tendrá un montón
de proteínas mal plegadas, pero también pueden ser vistos como ventajas porque
son bastante fáciles de purificar, entonces lo que uno hace es que, si hay cuerpos
de inclusión, se trata de recuperar estos cuerpos y después de hace un proceso que
se llama renaturación, ¿cómo hace esto? Lo que se hace normalmente es agregarle
algún agente caotrópico como el cloruro de guanidinio usualmente o urea, que lo
que hace es desplegar la proteína (le agrega grandes cantidades) y después va
reduciendo la concentración gradualmente del cloruro de guanidinio o urea para
ver si se puede replegar la proteína en una mejor conformación. Esas es una
estrategia que se pueden utilizar para expresar proteínas que son secretadas en
bacterias. También existe la alternativa de enviarla al periplasma (tiene un ambiente
bastante similar al retículo endoplásmico), entonces podría favorecer ciertos
plegamientos que normalmente no ocurrirían en el citoplasma.
 USO DE CODONES
Si comparamos que
codifica cada uno de
estos codones,
veremos que siempre
es el mismo, UUU
corresponde a la
fenilalanina y es en los
dos organismos, sin
embargo, si vemos el número que está a lado es la frecuencia con que se usa ese codón.
Sabemos que el código genético es degenerado y sabemos entonces que varios codones
codifican para un mismo aminoácido, y lo que ocurre es que se usan con diferentes
frecuencias, generalmente los problemas ocurren con los aminoácidos básicos. Por
ejemplo: AAA corresponde a Lisina (K) y AAG también. En la bacteria utiliza el 73% de las
veces el codón AAA y el 27% de las veces el codón AAG. Sin embargo, en el humano se
utiliza en un 43% de las veces el codón AAA y en un 57% de las veces el codón AAG. Esto
nos lleva a un problema porque existe la posibilidad de que la secuencia codificante
proveniente de humanos sea rica en codones tipo AAG porque se usa con mayor
frecuencia en humanos. Cuando eso lo introducimos en la bacteria, y ésta no usa
frecuentemente ese codón, entonces se va a empezar a producir esa proteína en gran
cantidad, se van a gastar los t-RNA AAG cargados con Lisina y a la larga eso va a afectar
la producción de mi proteína recombinante. Este problema se resuelve usualmente
sobre-expresando tanto la t-RNA; como el t-RNA sintetasa de los codones que están en
baja frecuencia en la bacteria. La otra opción es modificar la secuencia codificante
humana y cambiar los codones AAG por los codones AAA para mantener el codón que
utiliza con mayor frecuencia en la bacteria. Generalmente los problemas con el uso de
codones se asocian a aminoácidos básicos, ya sean Lisina o Arginina, por ejemplo, en la
Arginina 0.44, 0.07, 0.07, 0.02, 0.03 (en el cuadro de bacteria), sin embargo, 0.21, 0.21,
0.20, 0.18 (cuadro de humanos). Y comparando este codón usa el 44% de la bacteria,
pero solamente 18% en humanos. El 36% de las veces la bacteria y solamente el 8% en
humanos. Entonces cuando uno toma una secuencia de humanos y la quiere trasladar
para expresar en bacterias hay que tener mucho cuidado con éstos codones pocos
frecuentes o utilizar bacterias que estén optimizadas para la expresión de éstos
codones.